Summary
De muis die geperfuseerde nier (MIPK) is een techniek voor het houden van een muizennier onder ex vivo omstandigheden geperfuseerd en functioneel voor 1 uur. De buffers en operatietechniek worden beschreven.
Abstract
De muis die geperfuseerde nier (MIPK) is een techniek voor het houden van een muizennier onder ex vivo omstandigheden geperfuseerd en functioneel voor 1 uur. Dit is een voorwaarde voor de fysiologie van het geïsoleerde orgaan en vele innovatieve toepassingen die in de toekomst mogelijk is, zoals perfusie van cellen ontdoen van nier biotechniek of de toediening van anti-afwijzing of genoom bewerken geneesmiddelen in hoge doses prime de nier voor transplantatie. Ten tijde van de perfusie kan de nieren worden gemanipuleerd, nierfunctie meetbaar zijn en verschillende geneesmiddelen toegediend. Na de procedure kunnen de nieren worden getransplanteerd of bewerkt voor moleculaire biologie, biochemische analyse of microscopie.
Dit artikel beschrijft het perfusaat en de chirurgische techniek die nodig is voor de ex vivo perfusie van nieren muis. Details van de perfusie inrichting worden gegeven en gegevens zijn die de vANSPRAKELIJKHEID van de voorbereiding van de nieren: renale bloedstroom, vasculaire weerstand, en urine gegevens als functioneel, transmissie electronenmicroscoop van verschillende nephron segmenten als morfologische uitlezingen en western blots van transporteiwitten van verschillende nephron segmenten als moleculaire uitlezing.
Introduction
De geïsoleerde perfusie van organen is het onderwerp van een voortdurende inspanning onder fysiologen al vele tientallen jaren 1. De techniek maakt de functie van het orgaan, zonder systemische invloeden zoals bloeddruk, hormonen of zenuwen, te bestuderen. Carl Eduard Loebell wordt beschouwd als de eerste te hebben beschreef de succesvolle perfusie van een geïsoleerde nier, in 1849 2 te zijn. Sindsdien is de perfusie apparaat aanzienlijke verfijning ondergaan. Frey en Gruber introduceerde een kunstmatige long voor oxygenatie en pulserende pomp voor continue perfusie 2. Terwijl de vroege onderzoekers bestudeerden vooral de nieren van de grote zoogdieren, namelijk varkens en honden 2 3 -het eerste verslag van het gebruik van de rat nieren, door Weiss et al. , Was een mijlpaal in de studie van kleine zoogdieren-orgel perfusie 4. Schurek et al. meldde de noodzaak van het toevoegen van zoogdieren erytrocyten aan het perfusaat voldoende als tubulaireoxygenatie moest worden bereikt 5. Kritiek voor langdurige experimenten was de introductie van continue dialyse van de buffer van dezelfde onderzoeksgroep 6. In 2003, Schweda et al. waren de eersten die een geïsoleerd functionele muis doorbloed nier (MIPK) 7, later verfijnd door Rahgozar et al melden. 18 en Lindell et al. 14.
Terwijl technisch lastiger dan de rat geïsoleerde geperfuseerde nier, het gebruik van de MIPK draagt het voordeel dat het gebruik van een breed scala van genetisch gemanipuleerde muizen. Dit document geeft de details van de methode van de auteurs voor perfuseren geïsoleerde muis nieren gedurende 1 uur. De methode maakt het mogelijk voor de continue evaluatie van renale stroomsnelheid, vasculaire weerstand, afgifte van hormonen, bloed gas analyse, urine-analyse, en de toepassing van drugs. De procedure kan nieren worden verwerkt voor moleculaire en biochemische analyse, voor microscopie worden vastgesteld, ofgetransplanteerd in een ontvanger muis (Figuur 1).
Figuur 1: Overzicht van mogelijke Input / Output aan de geïsoleerde geperfuseerde nier. BGA: Blood gas analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deze techniek zal waarschijnlijk krijgen steeds meer aandacht de komende jaren, zoals vele innovatieve toepassingen worden met het aanbreken van langdurige normotherme nier perfusie besproken voorafgaand aan de transplantatie (met of zonder de toepassing van anti-afwijzing of-genoom bewerken drugs) 8, 9, 10 , 11, de bioengineering van hele nieren van cellen ontdane scaffolds 12, en de toepassing van hoge doses van fluorescente kleurstoffen voor beeldvorming multiphoton 13 14.
Een stap-voor-stap protocol gegeven zodat andere laboratoria geïsoleerde muizennier perfusie succes uit te voeren. Eerst wordt de samenstelling en de bereiding van de buffer opgegeven. Vervolgens wordt de operatie beschreven en de kritische stappen worden. Ten derde, gegevens worden gepresenteerd die representatief zijn voor een succesvolle voorbereiding zijn: renale bloedstroom, vaatweerstand, glomerulaire filtratiesnelheid en fractionele uitscheiding van elektrolyten-all als functionele metingen van de levensvatbaarheid-en transmissie elektronen microfoto van de morfologie van verschillende nephron segmenten van geperfundeerde nieren vastgesteld na 1 uur van perfusie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren in dit manuscript beschreven, werden uitgevoerd volgens Zwitsers recht en door de veterinaire dienst van het kanton Zürich, Zwitserland goedgekeurd.
1. Buffer Voorbereiding
- Bereid oplossingen 1-4 en de oplossing antidiuretisch hormoon (ADH) (Tabel 1).
- Bereid de dialyse buffer (Tabel 1).
Opmerking: Dit is de buffer als de dialyse buffer tijdens de perfusie. Later zal de erytrocyten worden verdund in de buffer tot de uiteindelijke perfusaat vormen. - Erytrocytpreparaat.
- Verdun 250 ml humaan erytrocytenconcentraat (getest materiaal verkregen van de plaatselijke bloedbank) tot 500 ml met dialyse buffer. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 8 minuten. Verwijder de buffer, zorg dat u geen erytrocyten niet te verwijderen. Herhaal 3x.
- Bereid de albumine (runderserumalbumine; BSA) buffer.
- In 200 ml dialysis buffer, los 44 g BSA met behulp van een roerstaafje. Filter de oplossing met filter papier.
- Bereid de perfusaat.
- Filter de erytrocyten uit stap 1.3.1 door middel van filter papier in de BSA buffer. Vult tot een totaal volume van 800 ml met dialysebuffer.
LET OP: Dit is de laatste perfusaat. De hematocriet moet nu tussen 8 en 12%. Het perfusaat kan worden bewaard tot 12 uur bij 4 ° C.
- Filter de erytrocyten uit stap 1.3.1 door middel van filter papier in de BSA buffer. Vult tot een totaal volume van 800 ml met dialysebuffer.
2. Initiëren Dialyse en Oxygenatie
- Zet het waterbad rond de grotere bufferreservoir kleiner bufferreservoir en de vochtige kamer (een kleine, dubbelwandige kamer gebracht tot 37 ° C en 100% vochtigheid later houden de nier) tot 37 ° C (figuur 2) .
- Vul het grotere bufferreservoir met de dialysebuffer en hoe kleiner reservoir van het perfusaat.
- Schakel de 5% CO2 / 95% O2 gas aanvoer naar de dialyse buffer.
- Schakel continue dialyse van het perfusaat tegen dialyse buffer. Zorg ervoor dat low-flux dialyse tubing gebruiken. Ga verder met stap 3.
Figuur 2: schematische tekening van de perfusie Circuit. Schema toont de belangrijkste onderdelen van het perfusiecircuit en de richting van de bufferstroom. Alle componenten omgeven door donkerblauwe worden bij 37 ° C gehouden met een waterbad / thermostaat. 1: Dialyse buffer van ten minste 3 keer het volume van de perfusie buffer continu geborreld met 95% O2 / 5% CO2. 2: dialysebuffer en perfusiebuffer continu gedialyseerd tegen elkaar in een dialysebuis door een rollerpomp. 3: Hierdoor dialyse, de perfusie buffer verrijkt met 9% O2 / 5% CO 2 en elektrolyten worden constant gehouden throughout perfusie. 4: Een rollenpomp stuwt de perfusie buffer naar de nier. 5: Een windketel verwijdert peristaltische golven en fungeert als een zeepbel te houden. 6: Druk meters (aangesloten op 4. (roller pomp) continue druk te houden terwijl het toestaan van vrij afwisselend flow). 7: Gedurende perfusie, de nier blijft in een vochtige kamer 100% luchtvochtigheid en 37 ° C nier temperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Chirurgische Procedure Part 1 (voor een schema van ligaturen, zie figuur 3)
Opmerking: Voer alle ligaturen met behulp van 5-0 chirurgische draad.
- Verdoven een muis door intraperitoneale injectie (10 ul / g lichaamsgewicht, 20 mg / ml ketamine en 1 mg / ml xylazine opgelost in 0,9% NaCl). Bevestig voldoende diepte van AnesthESIA door het testen voor de afwezigheid van de achterste voet reflexen.
- Bevestig de muis in een liggende positie in de vochtige kamer. Bescherm de ogen met dierenarts zalf. Plaats een 1 ml spuit onder de ruggengraat naar de lumbale vaten verhogen.
- Voer een mediane laparotomie van de schaamstreek kuif aan het borstbeen opening eerst de huid, dan is de buikspieren, met een schaar.
- Verwijder de darm en plaats het op de linkerkant van de muis laterale uit de buik.
- Bevrijd de blaas uit bindweefsel en verken zowel urineleiders en de plasbuis.
- Plaats een ligatuur rond de linker ureter (ligatuur I). Sluit het.
- Plaats een ligatuur rond de plasbuis (ligatuur II). Sluit het.
- Plaats een "lasso" ligatuur rond de gehele blaas (ligatuur III).
- Insnijden de blaas 1 mm.
- Canule de opening 2 cm PE 50 buis.
- Sluiten ligatuur III rond de buis.
- Snijd de linker urineleider en de urinebuis distale van de ligaturen. het bladder is nu aan de rechter ureter alleen en vrij bewegen.
- Schakel de abdominale aorta van bindweefsel en vet.
- Plaats een abdominale aorta mid-ligatuur (ligatuur IV).
- Plaats een ligatuur rond de aorta onder het diafragma tussen de mesenterica superior en het Celiac kofferbak (ligatuur V).
- Plaats een ligatuur rond de mesenterica superior (ligatuur VI).
- Plaats een aorta ligatuur direct onder rechts en boven de linker nierslagader (ligatuur VII).
- Plaats een ligatuur rond de staartader pakket (cava) (ligatuur VIII). Ga verder met stap 4.
Figuur 3: schematische tekening van de Ligatures geplaatst tijdens de operatie. Uitzicht op de open buik na de laparotomie. De darm wordt verplaatst naar links. L en R geven de linker en rechter nier. Dezwarte lijnen tonen het gebied van de respectievelijke ligatuur. Ligaturen eerst gelegd en dan gesloten, in de volgorde in de tekst. X geeft de locatie van de incisie voor aorta infusen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Vullen van de perfusiekringloop
- Start de roterende pomp en vul de buis met perfusaat. Zorg ervoor dat alle luchtbellen leeg te maken van het.
- Vul het windketel apparaat tot ongeveer mid-level met perfusaat.
- Kalibreer de drukomvormer aan 0 mm Hg wanneer alle buis wordt gevuld en flow 0. Laat de perfusie naald onder nier niveau gedurende deze tijd.
- Houd stroom op een constant minimaal niveau (0,6 ml / min) en ga verder met stap 5.
5. Chirurgische Procedure Part 2
- Plaats een klem tussen ligatuur IV en de vertakking van de linker renal slagader.
- Maak een kleine incisie in de aorta staart van ligature IV, zorg ervoor dat niet snijd de dorsale muur.
- Verwijden van de opening in de aorta met een vaatverwijder.
- Canule van de aorta met een naald (2 cm lang, trok PE 50), duwt de punt alleen maar om de klem.
- Open de klem.
- Duw de punt van de naald craniaal tot aan de kruising van de rechter nierslagader en de aorta bereikt.
- Sluit ligatuur VII.
- Sluit ligatuur IV.
- Open de kist met een schaar door het ontleden van het middenrif. Met een enkele cut, scheiden de aorta, vena cava, hart en vegetatieve zenuwen. Met deze stap wordt het dier opgeofferd via snelle verbloeding onder continu diep narcose.
- Start drukregeling de perfusiepomp. Handhaaf de gemiddelde druk tussen 80 en 100 mmHg.
- Sluiten ligatuur V.
- Sluit ligatuur VI.
- Sluit ligatuur VIII.
- Gratis de rechter nier van verbindende tissue en de inbedding in het vet capsule met een schaar.
- Snijd de aorta proximaal aan Ligatuur V.
- Snijd de mesenterica superior distaal aan Ligatuur VI.
- Snijd de nier ondersteunende schip bundel uit, zorg ervoor dat niet in de vaten zelf te snijden.
- Snijd de lever in de verbinding met de nier. Zorg ervoor dat de nieren vrij, maar laat een klein deel van de lever hechtend aan, zodat de vena cava opengehouden wordt door het.
- Neem de nier bundel uit de muis. Verwijder de muis uit de vochtige kamer.
- Plaats een "lasso" ligatuur rond de aansluiting van de lever en de nieren (ligatuur IX).
- Canule van de vena cava met een veneuze lijn (2 cm PE 50).
- Sluit ligatuur IX. Veneuze uitstroom door de veneuze lijn moet onmiddellijk beginnen.
- Sluit de vochtige kamer.
6. Downstream Analyses
- Gedurende het volgende uur, voortdurend te controleren bloedstroom en intravascular druk 15. Verzamel veneuze uitstroom, die kan worden gebruikt voor analyse van bijvoorbeeld renale reninesecretie 7. Verzamel urine voor de analyse van de elektrolyt concentratie en glomerulaire filtratiesnelheid 14. Na 1 h perfusie, nieren kan worden snel bevroren voor western blotting of beeldvorming vastgesteld nadert 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met de werkwijze beschreven, kan geïsoleerd muis nieren levensvatbaar is ten minste 1 uur. We testten het weefsel levensvatbaarheid na 1 uur van continue perfusie met functionele (renale bloedstroom en vasculaire weerstand, bloedgasanalyse van veneuze uitstroom, glomerulaire filtratiesnelheid, urinair fractionele Na + en K + excretie en urine osmolaliteit) en morfologische (transmissie elektronen microscopie, TEM) methoden vier nieren van wildtype C57BL / 6 muizen. Bovendien, western blots van apicale merkereiwitten verschillende tubulus segmenten werden uitgevoerd, vergelijken geïsoleerde geperfundeerde nieren unperfused nieren van dezelfde dieren. In alle experimenten werd constante druk perfusie gebruikt, waarbij de perfusiedruk op ~ 100 mmHg (figuur 4). In de nieren, perfusaat stroom en vaatweerstand bleef stabiel gedurende een tijd van 55 minuten bij 15,6 ± 0,4 ml / min * g niergewicht en 35 ± 1,0 mmHg * min / ml (Figuur 4 A). Een afname van perfusaat stroom of een verhoogde vasculaire weerstand gevoelige parameter met betrekking tot afnemende levensvatbaarheid van het weefsel en in de perfusie zorgvuldig moeten worden gecontroleerd. Bloed Elektrolyt en analyse 100 pl monsters genomen 60 minuten na het begin van perfusie geopenbaard renale CO 2 productie en O2 consumptie, wanneer de arteriële instroom vergeleken met de veneuze uitstroom (tabel 2). De andere parameters ongewijzigd gebleven tussen slagader en ader (tabel 2). Speciale nadruk moet op ongewijzigde veneuze kalium vrijkomen worden geplaatst, als een toename kan optreden tijdens weefselschade. Glomerulaire filtratiesnelheid, beoordeeld via FITC-Inuline klaring 14, de neiging om toenemen in de tijd (figuur 4 B), maar deze trend niet significant. Fractionele excretie van natrium en kalium geëvalueerd in de 55e minuut van de perfusieverhoogd vergeleken met de in vivo situatie (figuur 4 C). Urine osmolaliteit niet boven de osmolaliteit van de veneuze uitstroom verhoogd na 55 min perfusie (figuur 4D).
Morfologische studies, werden nieren vastgesteld na perfusie in 3% paraformaldehyde en 0,1% glutaaraldehyde in dialysebuffer zoals eerder beschreven 17. Renal ultrastructuur werd gemeten met TEM. Glomeruli en S1 segmenten van proximale tubuli verscheen grotendeels onveranderd na perfusie (Figuren 5 A en B). Sommige, maar niet alle S2 / S3 segmenten van proximale tubuli en het dikke stijgende ledematen die niet waren dichtbij vaatbundels werden tekenen van orgaanschade, zoals eerder in geïsoleerde geperfundeerde nieren rat 5 (figuren 5 C en D). Zelfs bij nadere inspectie, heeft distale gekronkelde tubuli en het verzamelen van leidingen geen duidelijke tekenen van necrose vertonen (Figuren 5 E, F en G). Kortom, de morfologische bevindingen in de muis nieren weerspiegelen de situatie die in de geïsoleerde rat geperfuseerde nier 5.
Western blots van apicale markereiwitten van de verschillende nefron segmenten geïsoleerde geperfundeerde nieren (snap-ingevroren na 1 h perfusie) in vergelijking met unperfused contralaterale nieren van hetzelfde dier (snel bevroren voor het begin van perfusie) geen significante veranderingen aan het licht. We onderzochten NaPi-IIa (in proximale tubulus), NKCC2 (dikke stijgende ledematen), NCC (distale gekronkelde tubuli) en ENaC (waarbij tubuli / verzamelbuizen) (figuur 6 A en B).
Figuur 4: Evaluatie van functionele levensvatbaarheid van Nieren doorbloed voor 55 min. A) </ Strong> Tijdens constante druk perfusie, vasculaire weerstand en perfusaat stroom bleef stabiel gedurende 55 min. De eerste 15 min uitgesloten vanwege de grote variabiliteit altijd gezien gedurende deze tijd. B) glomerulaire filtratiesnelheid (FITC-inuline) van vier nieren geëvalueerd na 25 en 55 min weergegeven lichte, maar niet significante toename in de tijd. C) fractionele uitscheiding van natrium en kalium bepaald na 55 min perfusie. D) veneuze plasma en urine osmolaliteit na 55 min perfusie. n = 4 in alle experimenten. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Transmission Electron Microscopy. Vertegenwoordiger morfologie van D ifferent Nephron Segmenten van geperfuseerde nieren bij een eindpunt van 1 uur. A) glomeruli intact. Detail van een podocyte in een glomerulus. B) S1 segment van een proximale tubulus. S1 segmenten intact. C) S2 / S3-segment van de proximale tubulus. Sommige, maar niet alle S2 / S3 segmenten van proximale buisjes zijn zeer necrotische. Cellen blijken gezwollen en vertonen grote intracellulaire schade. De buisvormige omtrek wordt gehandhaafd alleen door de basale membraan. D) Dikke oplopende ledematen (TAL). Die TALS die verre van de vaatbundels tonen de eerste tekenen van hydropische degeneratie. Luminale membranen lijken verdund en fragiel. E) distale tubulus (DCT). DCT intact zijn. F) Detail van de basolaterale infoldings van een DCT cel. Fenestrated endotheel, basaal membraan, basolaterale infoldings en mitochondriën intact zijn. G) verzamelbuis (CD). Cd's zijn intact.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Western Blot van Apicale Marker Eiwitten in geïsoleerde doorbloed Nieren Vergeleken met Unperfused Nieren van dezelfde dieren. A) Western blots van de nieren geperfuseerd gedurende 1 uur en unperfused nieren. NaPi-IIa representatief is voor de proximale tubulus. NKCC2 representatief is voor de dikke stijgende ledemaat. NCC en NCC gefosforyleerd op threonine 53 (pT53 NCC) worden uitsluitend in de distale gekronkelde tubulus. Alfa- en gamma subeenheden van ENaC in hun volle lengte en hun respectievelijke proteolytisch gesplitst producten worden getoond representatief is voor het aansluiten van buisje / verzamelen van kabelgoten. B) Kwantificatie van A) geen significante verschillen tussen nieren geperfundeerd f onthullenof 1 uur en unperfused nieren. n = 3 in alle experimenten. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM en individuele waarden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van Solutions en Dialyse buffer. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Tabel 2: bloedgas en Elektrolyt analyse van arteriële instroom en uitstroom van veneuze geperfundeerde nieren Muis 60 min na het begin van perfusie (n = 4). De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ±SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De muis die geperfuseerde nier is een hulpmiddel voor het bestuderen van nierfunctie in een gecontroleerde omgeving ex vivo gedurende 1 uur, de kloof tussen in vivo experimenten bij intacte dieren, eventueel ontsierd door de impact van talrijke systemische factoren, en in vitro experimenten geïsoleerde nefron segmenten of gekweekte cellen, die de impact van intacte orgaan structuur op de functie noodzakelijk verwaarlozen. Er is, om de kennis van de auteurs, geen alternatieve techniek waarmee deze specifieke taak uit te voeren. Biochemische studies over nierweefsel kan echter worden uitgevoerd op een veel eenvoudiger manier gebruikt nieren segmenten 17. Terwijl de techniek Momenteel loopt meestal gebruikt om nierfysiologie bestuderen, zijn veel nieuwe toepassingen besproken. Zo kan het worden gebruikt voor de nieren biotechniek tijdens perfusie decellularisatie en hercellularisatie 12. Bovendien, langdurige normotherme perfusie van nieren vóór transplantation, met de toediening van hoge doses van anti-afwijzing of genoom-bewerken van geneesmiddelen in het perfusaat, wordt onderzocht; zelfs in klinische settings 8, 9, 10, 11. De geïsoleerde geperfuseerde nier muis is een uitstekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor deze toepassingen, vooral voor de rol van individuele genen met knockout modellen helderen.
Drie stappen zijn essentieel voor een succesvolle experiment. Dit document biedt geïnteresseerd labs met de middelen om de procedure te reproduceren. Ten eerste, de buffer moet worden opgesteld zodanig dat de nier ontvangt de meeste van de voedingsstoffen die nodig zijn voor langdurige levensvatbaarheid onder reproduceerbare omstandigheden. Er moet een evenwicht worden gevonden tussen een volledig gecontroleerde omstandigheden (synthetische buffer) en een native perfusie voorwaarde (volbloed). Daarom albumine en erythrocyten zoogdier een hematocriet van 10% moeten worden opgenomen. Dit hematocriet vertegenwoordigt, in de ervaring van de auteurs, het beste compromis tussen voldoende tuitgifte zuurstofvoorziening en lage buffer viscositeit (toenemende hematocriet daalt stromen dramatisch tijdens de druk constant perfusie (vergelijk waarden in dit document om waarden in de nieren doorbloed zonder erytrocyten 18)). De kwaliteit en de versheid van de erytrocyten kritisch. Tijdens de wasstappen, moeten erytrocyten met zorg worden gehanteerd om hemolyse te voorkomen. De buffer moet worden vers bereid op de dag van het experiment. Ten tweede, de operatie moet worden uitgevoerd door een getrainde chirurg binnen de kortst mogelijke tijd uitgevoerd. De chirurg moet 6 ligaturen rondom het vaten verbindt de nieren naar de rest van het lichaam uitvoeren, terwijl bloedverlies van het dier tot een minimum. Voor een optimaal resultaat moet de chirurgische ingrepen worden bereikt binnen 30 minuten. Als de gemiddelde arteriële bloeddruk van het dier daalt tijdens langdurige operatie of als gevolg van anesthesie, onder 60 mmHg, renale perfusie zal reeds minimaal zijn en het weefsel zal gevoelig zijnnecrose. Om dit uit te sluiten, kan de linker nier worden genomen na een operatie, bij perfusie van de rechter nier reeds begonnen, en gebruikt als een onbehandelde controle. Ten derde, in de tijd van de perfusie de correcte werking van de perfusie inrichting, bestaande uit een standaard dierenverblijf perfusie circuit, moet worden gegarandeerd. Terwijl de computer voert de perfusie zelf, menselijk toezicht is noodzakelijk, bijvoorbeeld om te controleren op bellen in het perfusiecircuit.
De representatieve gegevens maakt de evaluatie van nier levensvatbaarheid na 1 uur ex vivo perfusie en de vergelijking van de technische succes van elke uitvoering van deze methode om de benadering hierin beschreven. Gedurende ten minste 1 uur, nierdoorbloeding, vasculaire weerstand, bloed gassen van de veneuze uitstroom en de glomerulaire filtratiesnelheid stabiel moeten blijven.
Er zijn bepaalde beperkingen aan de techniek, die men in gedachten te houden. Zelfs een kidney de afgifte van de meest succesvolle operatie kan alleen blijven nog gedurende een beperkte tijd. De auteurs vinden 1 uur naar het beste tijdstip waarop te stoppen perfusie zijn. Bovendien, terwijl perfusie van de geïsoleerde nier maakt de studie van het geïsoleerde orgaan gehele diepte, is het moeilijk om specifieke effecten op een celtype te differentiëren. Nieren na 1 uur vast kunnen defecten in S3 segmenten van proximale tubuli en dikke opstijgende deel cellen vertonen, terwijl de glomeruli, S1 segmenten, DCT, en CD's intact moet blijven. Het verplichte gebruik van erytrocyten, in het bijzonder van de mens, is ook gekoppeld aan potentiële risico's (bijvoorbeeld infecties) voor de experimentator.
Samengevat, de geïsoleerde geperfuseerde nier muis is een nuttige techniek om het gehele orgaan ex vivo. Zoals elke techniek, heeft bepaalde voordelen en beperkingen. De auteurs zijn van mening dat zowel het spruitstuk nieuwe toepassingen die momenteel zijn ontstaan en dit protocol kunnen sufficien biedent momentum voor andere labs om deze inspanning te reproduceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
- Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
- Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
- Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
- Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
- Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
- Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
- Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
- Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
- Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
- Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. , (2016).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).
