Summary
L'isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. I buffer e tecnica chirurgica sono descritte in dettaglio.
Abstract
L'isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. Questo è un prerequisito per lo studio della fisiologia dell'organo isolata e per molte applicazioni innovative che possono essere possibile in futuro, tra perfusione decellularization per la bioingegneria reni o la somministrazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing in dosi elevate per innescare il rene per il trapianto. Durante il tempo della perfusione, il rene può essere manipolato, funzione renale può essere valutata, e vari farmaci somministrati. Dopo la procedura, il rene può essere trapiantato o trasformati per la biologia molecolare, l'analisi biochimica, o al microscopio.
Questo articolo descrive il perfusato e la tecnica chirurgica necessaria per la perfusione ex vivo di reni mouse. Dettagli dell'apparato perfusione sono date e dati sono presentati mostra la vESPONSABILITÀ di preparazione del rene: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, e delle urine dati come, microscopio elettronico di trasmissione funzionali dei diversi segmenti del nefrone come letture morfologiche, e le macchie occidentali di proteine di trasporto dei diversi segmenti del nefrone come lettura molecolare.
Introduction
La perfusione isolata di organi è stato oggetto di uno sforzo continuo tra fisiologi per molti decenni 1. La tecnica consente la funzione dell'organo, senza influenze sistemiche come la pressione sanguigna, ormoni, o nervi, da studiare. Carl Eduard Loebell è considerato il primo ad aver descritto la perfusione successo di un rene isolato, nel 1849 2. Da allora, l'apparato perfusione ha subito notevole raffinatezza. Frey e Gruber ha introdotto un polmone artificiale per le pompe di ossigenazione e pulsatile per continua perfusione 2. Mentre i primi ricercatori hanno studiato principalmente i reni di grandi mammiferi, cioè, maiali e cani 2 3 -la prima relazione l'uso di reni di ratto, di Weiss et al. , È stata una pietra miliare nello studio della perfusione piccolo-mammifero-organo 4. Schurek et al. riferito la necessità di aggiungere eritrociti di mammifero al perfusato se tubulare renale sufficienteossigenazione doveva essere raggiunto 5. Critico per esperimenti di lunga durata è stata l'introduzione della dialisi continua del buffer dallo stesso gruppo di ricerca 6. Nel 2003, Schweda et al. sono stati i primi a segnalare un rene del mouse funzionale isolato perfuso (MIPK) 7, in seguito perfezionato da Rahgozar et al. 18 e Lindell et al. 14.
Mentre tecnicamente più impegnativo rispetto al ratto isolato rene perfuso, l'uso del MIPK porta il vantaggio di permettere l'uso di una vasta gamma di topi geneticamente modificati. Questo documento presenta i dettagli del metodo degli autori per la perfusione isolata reni del mouse per 1 ora. Il metodo consente la valutazione continua della velocità di flusso renale, resistenza vascolare, rilascio di ormone, emogasanalisi, analisi delle urine, e l'applicazione di farmaci. Seguendo la procedura, reni potrebbero essere trattati per analisi molecolari e biochimiche, fissati per la microscopia, otrapiantato in un topo ricevente (Figura 1).
Figura 1: panoramica dei possibili Input / Output al rene isolato e perfuso. BGA: analisi dei gas del sangue. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Questa tecnica probabile che riceverà maggiore attenzione nei prossimi anni, come molte applicazioni innovative sono in discussione con l'alba di una prolungata perfusione del rene normotermico prima del trapianto (con o senza l'applicazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing) 8, 9, 10 , 11, la bioingegneria di interi reni da impalcature decellularized 12, e l'applicazione di elevate dosi di coloranti fluorescenti per l'imaging multiphoton 13 14.
Un protocollo step-by-step è dato per consentire ad altri laboratori di eseguire isolato mouse perfusione del rene con successo. Innanzitutto, è specificato la composizione e preparazione del buffer. Quindi, l'intervento è descritto in dettaglio e sono presenti i punti critici. In terzo luogo, i dati vengono presentati che sono rappresentativi di una preparazione di successo: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, velocità di filtrazione glomerulare, e degli elettroliti frazionaria misurazioni funzionali di vitalità e di elettroni trasmissione micrografie della morfologia dei diversi segmenti nefrone di reni perfusi tutti escrezione- fisso dopo 1 ora di perfusione.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali descritti in questo manoscritto sono stati condotti secondo il diritto svizzero e approvati dall'amministrazione veterinario del Cantone di Zurigo, Svizzera.
1. Preparazione Buffer
- Preparare soluzioni 1 - 4 e la soluzione ormone antidiuretico (ADH) (Tabella 1).
- Preparare il tampone di dialisi (Tabella 1).
NOTA: Questo è il buffer utilizzato come tampone di dialisi durante la perfusione. Successivamente, gli eritrociti vengono diluiti in questo tampone per formare il perfusato finale. - preparazione degli eritrociti.
- Diluire 250 ml di concentrato di eritrociti umani (materiale testato ottenuto dalla banca locale del sangue) a 500 ml con tampone di dialisi. Centrifugare a 2.000 g per 8 minuti. Rimuovere il tampone, facendo attenzione a non rimuovere eventuali eritrociti. Ripetere 3x.
- Preparare la (albumina sierica bovina; BSA) l'albumina del buffer.
- In 200 ml di dialysibuffer di s, sciogliere 44 g di BSA con un ancoretta. Filtrare la soluzione con carta da filtro.
- Preparare il perfusato.
- Filtrare le eritrociti dal punto 1.3.1 attraverso carta da filtro nel buffer BSA. Riempire fino ad un volume totale di 800 ml con tampone di dialisi.
NOTA: Questo è il perfusato finale. L'ematocrito dovrebbe essere compresa tra 8 e 12%. Il perfusato può essere conservato per un massimo di 12 ore a 4 ° C.
- Filtrare le eritrociti dal punto 1.3.1 attraverso carta da filtro nel buffer BSA. Riempire fino ad un volume totale di 800 ml con tampone di dialisi.
2. Avvio Dialisi e l'ossigenazione
- Accendere bagnomaria circonda il serbatoio più grande del buffer, più piccolo serbatoio tampone, e la camera umida (una piccola camera doppia parete portata a 37 ° C e 100% di umidità per mantenere entro il rene) a 37 ° C (figura 2) .
- Riempire il serbatoio buffer maggiore con il tampone di dialisi e il serbatoio più piccolo con perfusato.
- Accendere il 5% di CO 2/95% O 2 afflusso di gas al tampone di dialisi.
- Accendere dialisi continua del perfusato contro il tampone di dialisi. Fate attenzione ad usare a basso flusso tubo di dialisi. Passare al punto 3.
Figura 2: Schema del circuito di perfusione. Schema mostra i principali componenti del circuito di perfusione e la direzione del flusso buffer. Tutti i componenti circondato da blu scuro vengono mantenute a 37 ° C con un bagno di acqua / termostato. 1: Dialisi tampone di almeno 3 volte il volume del buffer di perfusione è continuamente gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2. 2: Dialisi buffer e buffer di perfusione sono continuamente dializzati contro l'altro in un tubo di dialisi da una pompa a rulli. 3: througho costante Per questo la dialisi, il buffer di perfusione è arricchito con 9% O 2/5% di CO 2 ed elettroliti livelli sono mantenutiut perfusione. 4: Una pompa rullo spinge il buffer di perfusione verso il rene. 5: Un windkessel rimuove onde peristaltiche e agisce come una trappola bolla. 6: trasduttore di pressione (collegato a 4. (pompa roller) per mantenere una pressione continua pur consentendo flusso liberamente alternata). 7: Durante la perfusione, il rene rimane in una camera umida per 100% di umidità e temperatura di 37 ° C renale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
3. Procedura chirurgica Part 1 (per un diagramma di tutte le legature, vedi Figura 3)
Nota: Eseguire tutte le legature utilizzando 5-0 filo chirurgico.
- Anestetizzare un topo mediante iniezione intraperitoneale (10 ml / g di peso corporeo, 20 mg / ml di ketamina e 1 mg / ml xilazina disciolto in 0,9% NaCl). Confermare la sufficiente profondità di AnesthESIA testando per l'assenza di riflessi retro-piede.
- Fissare il mouse in posizione supina nella camera umida. Proteggere gli occhi con vet unguento. Inserire una siringa da 1 ml di sotto della colonna vertebrale per elevare i vasi lombari.
- Eseguire una laparotomia mediana dalla cresta pubica per l'apertura dello sterno prima la pelle, poi i muscoli addominali, con le forbici.
- Rimuovere l'intestino e posizionarlo sul lato sinistro del laterali del mouse dall'addome.
- Liberare la vescica da tessuto connettivo e di esplorare entrambi gli ureteri e l'uretra.
- Mettere una legatura intorno dell'uretere sinistro (I legature). Chiudilo.
- Inserire una legatura intorno all'uretra (legature II). Chiudilo.
- Posizionare un "laccio" legatura in giro per tutta la vescica (legature III).
- Incidere la vescica 1 mm.
- Incannulare l'apertura cm 2 PE 50 tubi.
- Chiudi legatura III attorno al tubo.
- Tagliare l'uretere sinistro e dell'uretra distale dalle legature. il bladder è ora attaccato al dell'uretere solo a destra e liberi di muoversi.
- Cancellare l'aorta addominale del tessuto connettivo e il grasso.
- Inserire un addominale legatura metà dell'aorta (legature IV).
- Inserire una legatura intorno all'aorta sotto il diaframma tra l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco (legature V).
- Mettere una legatura intorno all'arteria mesenterica superiore (legature VI).
- Inserire un legatura aortica direttamente sotto destra e sopra l'arteria renale sinistra (VII legatura).
- Mettere una legatura attorno al pacchetto caudale vena (cava) (VIII legature). Passare al punto 4.
Figura 3: Schema del Legature poste durante l'intervento chirurgico. Vista dell'addome aperto dopo la laparotomia. L'intestino viene spostato verso sinistra. L e R indicano il rene sinistro e destro. Illinee nere mostrano l'area della rispettiva legatura. Legature prima immissione e poi chiusi, nella sequenza indicata nel testo. X indica la posizione di incisione per dell'aorta cannulazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
4. Adescamento del circuito di perfusione
- Avviare la pompa rotativa e riempire il tubo con perfusato. Fare attenzione a svuotare tutte le bolle d'aria da esso.
- Riempire il dispositivo windkessel a circa la metà del livello con perfusato.
- Calibrare il trasduttore di pressione a 0 mm Hg quando tutti i tubi è riempita e il flusso è 0. Tenere l'ago perfusione a livello renale durante questo periodo.
- Mantenere il flusso ad un livello minimo costante (0,6 ml / min) e passare al punto 5.
5. Procedura chirurgica Parte 2
- Posizionare un morsetto tra la legatura IV e la ramificazione della rena sinistral arteria.
- Fai una piccola incisione nella caudale dell'aorta di legatura IV, avendo cura di non tagliare la parete dorsale.
- Dilata l'apertura in aorta con un dilatatore vascolare.
- Incannulare l'aorta con un ago (2 cm di lunghezza, tirato PE 50), spingendo la punta solo al morsetto.
- Aprire il morsetto.
- Inserire la punta di un ago cranialmente fino a raggiungere il bivio dell'arteria rene destro e l'aorta.
- Chiudere la legatura VII.
- Chiudere la legatura IV.
- Aprite la cassa con le forbici dalla dissezione del diaframma. Con un unico taglio, separare l'aorta, vena cava, cuore e nervi vegetativi. Con questo passo, l'animale viene sacrificato via rapida dissanguamento in anestesia profonda continua.
- Avviare il controllo della pressione della pompa di perfusione. Mantenere la pressione media tra 80 e 100 mmHg.
- Chiudi V. legatura
- Chiudere la legatura VI.
- Chiudere la legatura VIII.
- Libero il diritto rene da tissu connettivoe e la sua incorporazione nella capsula adiposa con le forbici.
- Tagliare l'aorta prossimale di legatura V.
- Tagliare l'arteria mesenterica superiore distale di legatura VI.
- Tagliare il fascio nave rene-out di supporto, avendo cura di non tagliare in vasi stessi.
- Tagliare il fegato al collegamento al rene. Fare attenzione per liberare il rene, ma lasciare una piccola parte del aderenti fegato ad esso, in modo che la vena cava viene mantenuto aperto da esso.
- Prendere il fascio di rene di topo. Rimuovere il mouse dalla camera umida.
- Posizionare un "laccio" legatura attorno al collegamento di fegato e rene (legature IX).
- Incannulare la vena cava con una linea venosa (2 centimetri PE 50).
- Chiudere la legatura IX. deflusso venoso attraverso la linea venosa dovrebbe iniziare immediatamente.
- Chiudere la camera umida.
6. Le analisi a valle
- Durante l'ora successiva, monitorare continuamente il flusso di sangue e intravasculpressione ar 15. Raccogliere deflusso venoso, che può essere utilizzato per l'analisi, ad esempio, renale rilascio di renina 7. Raccogliere le urine per l'analisi della concentrazione di elettroliti e velocità di filtrazione glomerulare 14. Dopo 1 ora di perfusione, i reni possono essere snap-congelati per blotting occidentale o essere fissati per l'imaging approcci 16.
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Representative Results
Con il metodo descritto, isolati reni mouse possono rimanere vitali per almeno 1 ora. Abbiamo testato la vitalità del tessuto dopo 1 ora di perfusione continua con funzionale (flusso ematico renale e la resistenza vascolare, analisi dei gas del sangue del deflusso venoso, velocità di filtrazione glomerulare, urinario frazionata Na + e K + escrezione, e nelle urine osmolalità) e morfologica (elettronico a trasmissione microscopia, TEM) metodi in quattro reni di tipo selvatico topi C57BL / 6. Inoltre, Western blot di proteine marker apicali dei diversi segmenti di tubuli sono state eseguite, confrontando isolati reni perfusi per i reni unperfused degli stessi animali. In tutti gli esperimenti, perfusione pressione costante è stato utilizzato, mantenendo la pressione di perfusione a ~ 100 mmHg (Figura 4). In questi reni, flusso perfusato e resistenza vascolare rimasti stabili per un tempo di 55 min a 15,6 ± 0,4 ml / min * g di peso rene e 35 ± 1,0 mmHg * min / ml, rispettivamente (Figura 4). Una diminuzione del flusso perfusato o un aumento della resistenza vascolare è un parametro sensibile a diminuire vitalità del tessuto e devono essere monitorati durante la perfusione con cura. Gas Sangue e analisi elettrolita in 100 microlitri campioni prelevati 60 minuti dopo l'inizio della perfusione renale rivelato produzione di CO 2 e consumi O 2, quando l'afflusso arterioso è stato confrontato con il deflusso venoso (Tabella 2). Gli altri parametri sono rimasti invariati tra l'arteria e vena (Tabella 2). Particolare attenzione deve essere posta sul rilascio di potassio venosa inalterato, come un aumento può verificarsi durante danni ai tessuti. Velocità di filtrazione glomerulare, valutato tramite FITC-inulina gioco 14, tendeva ad aumentare nel corso del tempo (Figura 4 B), ma questa tendenza non ha raggiunto la significatività. escrezione frazionale di sodio e potassio valutato dopo 55 minuti di perfusioneè maggiore rispetto alla situazione in vivo (Figura 4 C). L'urina osmolalità non è elevata al di sopra della osmolalità del deflusso venoso dopo 55 min di perfusione (Figura 4 D).
Per gli studi morfologici, reni sono stati fissati dopo perfusione in 3% paraformaldeide e glutaraldeide allo 0,1% in tampone di dialisi come precedentemente descritto 17. ultrastruttura renale è stata valutata con TEM. Segmenti glomeruli e S1 di tubuli prossimali sono apparsi in gran parte immutata dopo perfusione (figure 5 A e B). Alcuni, ma non tutti i segmenti S2 / S3 di tubuli prossimali e gli arti ascendenti di spessore che non sono stati vicino ai fasci vascolari mostravano segni di danno d'organo, come descritto in precedenza nel ratto isolato reni perfusi 5 (figure 5 C e D). Anche a ben guardare, tubuli contorti distali e dotti collettori non hanno mostrato evidenti segni di necrosi (Le figure 5 E, F e G). In conclusione, i risultati morfologiche nei reni del mouse rispecchiano la situazione constatata nel ratto isolato rene perfuso 5.
Western blot di proteine marker apicali dei diversi segmenti del nefrone nei reni perfusi isolati (snap-congelati dopo 1 ora di perfusione) rispetto al unperfused reni controlaterale dello stesso animale (snap-congelati prima della comparsa della perfusione) non ha rivelato alterazioni significative. Abbiamo studiato Napi-IIa (che si trova nei tubuli prossimali), NKCC2 (arti ascendenti di spessore), NCC (distale tubuli contorti), ed ENAC (collegamento tubuli / dotti collettori) (figure da 6 A e B).
Figura 4: valutazione della validità funzionale dei reni perfuso per 55 min. A) </ Strong> durante la perfusione pressione costante, la resistenza vascolare e il flusso perfusato è rimasto stabile per 55 min. I primi 15 minuti sono esclusi a causa della variabilità sempre visto durante questo tempo. B) velocità di filtrazione glomerulare (FITC-inulina) di quattro reni valutati dopo 25 e 55 min visualizzata lieve ma non significativo aumento nel corso del tempo. C) escrezione frazionale di sodio e potassio valutata dopo 55 min di perfusione. D) nel plasma e nelle urine venosa osmolalità dopo 55 min di perfusione. n = 4 in tutti gli esperimenti. I dati sono presentati come media ± SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: microscopia elettronica a trasmissione. Rappresentante Morfologia di D Segmenti ifferent Nefrone di perfuso reni ad un punto finale di 1 ora. A) I glomeruli sono intatti. Dettaglio di un podocyte in un glomerulo. Segmento B) S1 di un tubulo prossimale. segmenti S1 sono intatte. Segmento C) S2 / S3 di un tubulo prossimale. Alcuni, ma non tutti i segmenti S2 / S3 di tubuli prossimali sono altamente necrotico. Le cellule appaiono gonfie e mostrano grandi danni intracellulare. Il profilo tubolare viene mantenuta solo dalla membrana basale. D) arto spessa ascendente (TAL). Quelle tals che sono lontani dai fasci vascolari mostrano i primi segni di degenerazione idropica. membrane luminali appaiono assottigliate e fragile. E) tubulo contorto distale (DCT). DCT sono intatte. F) Dettaglio dei ripiegamenti basolaterale di una cella DCT. Fenestrated endotelio, membrana basale, ripiegamenti basolaterale, e mitocondri sono intatte. G) dotto collettore (CD). CD sono intatti.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Western Blot di apicali Marker proteine in isolato Reni perfuso Rispetto al Unperfused reni dagli stessi animali. A) Western blot di reni perfusi per 1 ora e reni unperfused. Napi-IIa è rappresentativo per il tubulo prossimale. NKCC2 è rappresentativo per il tratto ascendente di spessore. NCC e NCC fosforilati a treonina 53 (pT53 NCC) si trovano esclusivamente nel tubulo contorto distale. Alfa e gamma subunità dell'Enac in tutta la loro lunghezza e la loro rispettivi prodotti proteolytically spaccati sono mostrati rappresentante per il collegamento tubulo / dotto collettore. B) Quantificazione di A) non ha rivelato differenze significative tra f reni perfusio 1 ora e reni unperfused. n = 3 in tutti gli esperimenti. I dati sono presentati come media ± SEM e vengono visualizzati i singoli valori. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Composizione di soluzioni e Dialisi tampone. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 2: gas del sangue e analisi di elettroliti di arteriosa afflusso e deflusso venoso di perfuso mouse Reni 60 minuti dopo l'inizio della perfusione (n = 4). I dati sono presentati come media ±SEM.
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Discussion
Il mouse isolato rene perfuso è uno strumento per lo studio della funzione renale in un ambiente controllato ex-vivo per 1 ora, colmando il divario tra esperimenti in vivo su animali intatti, che può essere viziata da l'impatto di numerosi fattori sistemici, e in esperimenti in vitro in nefrone isolati o cellule in coltura, che necessariamente trascurare l'impatto della struttura dell'organo intatta sulla funzione. C'è, alla conoscenza degli autori, non tecnica alternativa con cui eseguire questo compito specifico. Studi biochimici sul tessuto renale, tuttavia, possono essere eseguite in un modo molto più semplice utilizzando fette renali 17. Mentre la tecnica presentata è attualmente utilizzato per lo più per studiare la fisiologia renale, molte nuove applicazioni sono in discussione. Ad esempio, potrebbe essere utilizzato per bioingegneria renale durante la perfusione decellularization e Recellularization 12. Inoltre, prolungata perfusione normotermico di reni prima di transplantation, con la somministrazione di alte dosi di anti-rigetto o del genoma-editing droga nel perfusato, è in fase di studio; anche in ambito clinico 8, 9, 10, 11. Il mouse isolato rene perfuso è un ottimo strumento che potrebbe essere utilizzato per queste applicazioni, in particolare per chiarire il ruolo dei singoli geni con i modelli knockout.
Tre punti sono fondamentali per un esperimento riuscito. Questo documento fornisce laboratori interessate i mezzi per riprodurre il procedimento. Innanzitutto, il buffer deve essere preparato in modo tale che il rene riceve la maggior parte delle sostanze nutritive necessarie per la vitalità prolungata in condizioni riproducibili. Un equilibrio deve essere trovato tra le condizioni completamente controllate (tampone di sintesi) e una condizione di perfusione nativo (sangue intero). Pertanto, l'albumina e eritrociti di mammifero ad un ematocrito del 10% devono essere inclusi. Questo ematocrito rappresenta, nell'esperienza degli autori, il miglior compromesso tra sufficienti tproblema di ossigenazione e bassa viscosità tampone (aumento dell'ematocrito diminuisce il flusso drammaticamente durante la perfusione pressione costante (confrontare i valori presentati in questo documento ai valori nei reni perfusi senza eritrociti 18)). La qualità e la freschezza del eritrociti è critica. Durante le fasi di lavaggio, eritrociti devono essere maneggiati con cura per evitare l'emolisi. Il buffer deve essere preparato fresco il giorno dell'esperimento. In secondo luogo, l'operazione deve essere effettuata da un chirurgo esperto nel più breve tempo possibile. Il chirurgo deve eseguire 6 legature intorno vasi principali che collegano il rene al resto del corpo, mantenendo la perdita di sangue dell'animale al minimo. Per ottenere risultati ottimali, gli interventi chirurgici devono essere realizzati entro 30 minuti. Se la pressione media arteriosa dell'animale gocce, durante l'intervento chirurgico prolungato o da anestesia, inferiore a 60 mmHg, perfusione renale sarà già minimo e il tessuto sarà soggettaa necrosi. Per escludere questo caso, il rene sinistro può essere presa dopo l'intervento chirurgico, quando la perfusione del rene destro è già iniziata, e utilizzato come un testimone non trattato. In terzo luogo, durante il tempo della perfusione del corretto funzionamento dell'apparato perfusione, costituito da un circuito piccolo animale-perfusione normale, deve essere garantita. Mentre il computer esegue la perfusione di per sé, supervisione umana è necessario, ad esempio per controllare bolle nel circuito di perfusione.
I dati rappresentativi forniti consente la valutazione della solidità renale dopo 1 ora di perfusione ex vivo e il confronto del successo tecnica di qualsiasi esecuzione di questo metodo per l'approccio qui descritto. Nel corso di almeno 1 ora, il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, emogasanalisi del deflusso venoso e velocità di filtrazione glomerulare dovrebbero rimanere stabili.
Ci sono alcune limitazioni alla tecnica, che si deve tenere a mente. Anche un kiDney emissione da un intervento chirurgico di maggior successo non può che rimanere valida per un periodo di tempo limitato. Gli autori hanno trovato 1 ora di essere il miglior punto di tempo in cui per fermare la perfusione. Inoltre, mentre la perfusione del rene isolato consente lo studio di isolati tutto l'organo in profondità, è difficile differenziare effetti specifici sulla un tipo di cellula. I reni fisse dopo 1 ora potrebbero presentare difetti nei segmenti S3 di tubuli prossimali e cellule ascendente dell'ansa di spessore, mentre glomeruli, segmenti S1, DCT, e CD dovrebbe rimanere intatto. L'uso obbligatorio di eritrociti, in particolare dagli esseri umani, è legato anche a potenziali rischi (ad esempio, infezioni) per lo sperimentatore.
In sintesi, il mouse isolato rene perfuso è una tecnica utile con cui studiare l'intero organo ex vivo. Come qualsiasi tecnica, presenta alcuni vantaggi e limitazioni. Gli autori ritengono che sia le nuove molteplici applicazioni attualmente sorgere e questo protocollo potrebbe fornire sufficient slancio per altri laboratori di riprodurre questo sforzo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
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