Summary
الماوس معزولة الكلى perfused (MIPK) هي تقنية للحفاظ على الكلى الماوس تحت المجراة سابقا الظروف perfused وظيفية لمدة 1 ساعة. ويرد في مخازن وتقنية جراحية في التفاصيل.
Abstract
الماوس معزولة الكلى perfused (MIPK) هي تقنية للحفاظ على الكلى الماوس تحت المجراة سابقا الظروف perfused وظيفية لمدة 1 ساعة. وهذا شرط أساسي لدراسة علم وظائف الأعضاء من الجهاز معزولة وللعديد من التطبيقات المبتكرة التي قد يكون من الممكن في المستقبل، بما في ذلك decellularization نضح عن الهندسة الحيوية الكلى أو إدارة مكافحة الرفض أو المخدرات تحرير الجينوم في جرعات عالية لرئيس الكلية للزرع. خلال ذلك الوقت من نضح، والكلى يمكن التلاعب بها، ويمكن تقييم وظائف الكلى، ومختلف المواد الصيدلانية تدار. بعد العملية، والكلى يمكن زرعها أو تجهز لعلم الأحياء الجزيئي، وتحليل الكيمياء الحيوية، أو المجهري.
وتصف هذه الورقة الإرواء والتقنية الجراحية اللازمة لنضح خارج الجسم الحي الكلى الماوس. وترد تفاصيل جهاز نضح وقدمت بيانات تظهر الخامسiability من إعداد والكلى: تدفق الدم الكلوي، ومقاومة الأوعية الدموية، والبول بيانات وظيفية، الميكروسكوب الإلكتروني النافذ من شرائح كليون المختلفة وقراءات المورفولوجية، والبقع الغربية من البروتينات نقل شرائح كليون المختلفة وقراءات الجزيئية.
Introduction
وقد نضح معزولة من الأجهزة موضوع جهد مستمر بين فسيولوجي لعقود عديدة 1. هذه التقنية تتيح وظيفة الجهاز، دون التأثيرات الجهازية مثل ارتفاع ضغط الدم، والهرمونات، أو الأعصاب، لدراستها. يعتبر كارل إدوارد Loebell أن يكون أول من وصف نضح الناجح لالكلى معزولة، في عام 1849 2. ومنذ ذلك الحين، شهدت جهاز نضح صقل كبير. قدم فراي وغروبر رئة اصطناعية لالأوكسجين ونابض مضخات نضح المستمر 2. في حين الباحثين في وقت مبكر درس أساسا الكلى من الثدييات وهي كبيرة والخنازير والكلاب 2 3 -The التقرير الأول للاستخدام الكلى الفئران، التي فايس وآخرون. ، كان علامة فارقة في دراسة صغيرة الثدييات جهاز نضح (4). Schurek وآخرون. ذكرت ضرورة إضافة الكريات الحمراء الثدييات إلى الإرواء إذا أنبوبي كلوي كافيةكان الأوكسجين إلى أن يتحقق 5. حاسمة لتجارب طويلة الأمد كانت مقدمة من غسيل الكلى المستمر من المخزن المؤقت من قبل نفس المجموعة البحثية 6. في عام 2003، Schweda وآخرون. كانوا أول من الإبلاغ عن الكلى الماوس وظيفية معزولة perfused (MIPK) 7، والمكرر في وقت لاحق من قبل Rahgozar وآخرون. 18 ويندل وآخرون. 14.
بينما من الناحية الفنية أكثر تحديا من الفئران المعزولة الكلى perfused، واستخدام MIPK يحمل ميزة تمكن من استخدام مجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا. تعرض هذه الورقة على تفاصيل طريقة المؤلفين من أجل perfusing الكلى الماوس معزولة لمدة 1 ساعة. يسمح أسلوب التقييم المستمر لمعدل الكلوي تدفق، ومقاومة الأوعية الدموية، والإفراج عن هرمون، تحليل غازات الدم وتحليل البول، وتطبيق المخدرات. وبعد هذا الإجراء، يمكن معالجتها الكلى للتحليل الجزيئي والكيمياء الحيوية، وتكون ثابتة للفحص المجهري، أوزرعه في الماوس المتلقي (الشكل 1).
الشكل 1: نظرة عامة على احتمال الإدخال / الإخراج إلى الكلى Perfused المعزولة. بغا: تحليل الدم الغاز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هذه التقنية من المرجح أن تلقي اهتماما متزايدا في السنوات القادمة، كما يتم مناقشة العديد من التطبيقات المبتكرة مع فجر لفترات طويلة نضح الكلى سوي الحرارة قبل الزرع (مع أو من دون تطبيق المضادة للرفض أو عقاقير تحرير الجينوم) 8، 9، 10 ، 11، والهندسة الحيوية الكلى كلها من السقالات decellularized 12، وتطبيق جرعات عالية من الأصباغ الفلورية لmultiphoton التصوير 13 14.
ويرد بروتوكول خطوة بخطوة للسماح غيرها من المختبرات لأداء معزولة الماوس نضح الكلى بنجاح. أولا، يتم تحديد تكوين وإعداد المخزن المؤقت. ثم، يتم وصف عملية جراحية في التفاصيل وتعرض الخطوات الحاسمة. ويرد الثالث، البيانات التي تمثل من الإعداد الناجح: تدفق الدم الكلوي، ومقاومة الأوعية الدموية، معدل الترشيح الكبيبي، والكهارل كسور إفراز للجميع القياسات وظيفية من الميكروسكوب الجدوى والإلكترون انتقال مورفولوجية قطاعات كليون مختلفة من الكلى perfused ثابت بعد 1 ساعة من نضح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وصفها في هذه المخطوطة وفقا للقانون السويسري والموافقة عليها من قبل الإدارة البيطرية للكانتون زيورخ، سويسرا.
1. إعداد العازلة
- إعداد حلول 1-4 والحل الهرمون المضاد لإدرار البول (ADH) (الجدول 1).
- إعداد العازلة غسيل الكلى (الجدول 1).
ملاحظة: هذا هو عازلة تستخدم المخزن المؤقت لغسيل الكلى خلال نضح. وفي وقت لاحق، سوف تضعف كريات الدم الحمراء في هذا المخزن المؤقت لتشكيل الإرواء النهائي. - إعداد كرات الدم الحمراء.
- تمييع 250 مل من تركيز كريات الدم الحمراء البشرية (مادة اختبار تم الحصول عليها من بنك الدم المحلي) إلى 500 مل مع العازلة غسيل الكلى. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 8 دقائق. إزالة المنطقة العازلة، والحرص على عدم إزالة أي خلايا الدم الحمراء. تكرار 3X.
- إعداد (ألبومين المصل البقري، BSA) الزلال العازلة.
- في 200 مل من dialysiالصورة العازلة، حل 44 غرام من جيش صرب البوسنة باستخدام بقضيب. تصفية حل مع ورقة الترشيح.
- إعداد الإرواء.
- تصفية كريات الدم الحمراء من الخطوة 1.3.1 من خلال ورق الترشيح في المخزن المؤقت BSA. ملء تصل إلى الحجم الكلي 800 مل مع العازلة غسيل الكلى.
ملاحظة: هذا هو الإرواء النهائي. يجب أن يكون الهيماتوكريت الآن بين 8 و 12٪. سائل الإرواء يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- تصفية كريات الدم الحمراء من الخطوة 1.3.1 من خلال ورق الترشيح في المخزن المؤقت BSA. ملء تصل إلى الحجم الكلي 800 مل مع العازلة غسيل الكلى.
2. المبادرة للغسيل والأوكسجين
- بدوره على حمام ماء المحيطة الخزان أكبر العازلة، أصغر خزان العازلة، وغرفة رطبة (جلب، غرفة صغيرة مزدوجة الجدران إلى 37 درجة مئوية، و 100٪ الرطوبة عقد في وقت لاحق الكلى) إلى 37 درجة مئوية (الشكل 2) .
- ملء خزان مؤقت أكبر مع العازلة غسيل الكلى وخزان أصغر مع الإرواء.
- تشغيل 5٪ CO 2/95٪ O 2 تدفق الغاز إلى المخزن المؤقت لغسيل الكلى.
- التبديل على غسيل الكلى المستمر للسائل الإرواء ضد المخزن المؤقت لغسيل الكلى. احرص على استخدام أنابيب غسيل الكلى المنخفضة للتدفق. انتقل إلى الخطوة 3.
الشكل 2: رسم تخطيطي للحلبة الإرواء. يظهر مخطط المكونات الرئيسية لدائرة نضح واتجاه تدفق العازلة. وتحفظ كل مكونات محاطة الأزرق الداكن عند 37 درجة مئوية مع حمام ماء / الحرارة. 1: فقاعات غسيل الكلى عازلة لا يقل عن 3 أضعاف حجم المخزن المؤقت نضح مستمر مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. 2: يتم مدال غسيل الكلى العازلة والعازلة نضح باستمرار ضد بعضها البعض في أنبوب غسيل الكلى عن طريق مضخة الأسطوانة. 3: ونتيجة لهذا غسيل الكلى، وإثراء المخزن المؤقت نضح مع 9٪ O يتم الاحتفاظ 05/02٪ CO 2 والكهارل مستويات througho المستمرالتحرير الارواء. 4: مضخة بكرة يفجر المنطقة العازلة نضح نحو الكلى. 5: windkessel يزيل موجات تحوي وبمثابة فخ فقاعة. 6: الضغط على (متصلة إلى 4. (مضخة بكرة) للحفاظ على الضغط المستمر مع السماح للتدفق بالتناوب بحرية). 7: طوال التروية، يبقى الكلى في غرفة رطبة للرطوبة الهواء 100٪ و 37 درجة مئوية درجة حرارة الكلى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. الجراحي إجراء الجزء 1 (رسم تخطيطي لجميع الأربطة، انظر الشكل 3)
ملاحظة: إجراء جميع الحروف المركبة باستخدام 5-0 موضوع الجراحي.
- تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق (10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم، و 20 ملغ / مل الكيتامين و 1 ملغ / مل زيلازين يذوب في 0.9٪ كلوريد الصوديوم). تأكيد عمق كاف من anesthتقييم الأثر البيئي من خلال اختبار لغياب ردود الفعل الخلفي القدم.
- إصلاح الماوس في موقف ضعيف في غرفة رطبة. حماية العينين مع مرهم التعليم والتدريب المهني. وضع حقنة 1 مل تحت العمود الفقري لرفع السفن قطني.
- إجراء عملية فتح البطن وسيطة من قمة العانة لافتتاح القص أولا الجلد، ثم عضلات البطن، مع مقص.
- إزالة الأمعاء ووضعه على الجانب الأيسر من جانبي الماوس من البطن.
- تحرير المثانة من النسيج الضام، واستكشاف كل من الحالب ومجرى البول.
- وضع رباط حول الحالب الأيسر (ضمد الأول). أغلقه.
- وضع رباط حول مجرى البول (ضمد الثاني). أغلقه.
- وضع "اسو" رباط حول المثانة كاملة (ضمد الثالث).
- شق المثانة 1 مم.
- يقني؛ يدخل القنية فتح مع 2 سم PE 50 الأنابيب.
- انهيار ضمد الثالث حول الأنبوب.
- قطع الحالب الأيسر والقاصي مجرى البول من الأربطة. هؤلاء الاشخاصالآن تعلق دير إلى الحالب الأيمن فقط وتتحرك بحرية.
- مسح الشريان الأورطي البطني من النسيج الضام والدهون.
- وضع البطن ضمد منتصف الشريان الأورطي (IV رباط).
- وضع رباط حول الشريان الأبهر أسفل الحجاب الحاجز بين الشريان المساريقي العلوي والجذع الاضطرابات الهضمية (V رباط).
- وضع رباط حول الشريان المساريقي العلوي (السادس رباط).
- وضع رباط الأبهر دون الحق مباشرة وفوق الشريان الكلوي الأيسر (رباط السابع).
- وضع رباط حول حزمة الذيلية الوريد (الوريد) (الثامن رباط). انتقل إلى الخطوة 4.
الشكل 3: رسم تخطيطي للالحروف المركبة وضعها خلال جراحة. عرض من البطن مفتوحة بعد فتح البطن. تم نقل الأمعاء إلى اليسار. L و R يشير إلى الكلى اليسار واليمين. التظهر خطوط سوداء مجال ربطة منها. توضع الأربطة أولا ثم أغلقت، في تسلسل معين في النص. يصادف العاشر موقع شق لإقناء؛ إدخال القنية الشريان الأورطي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. الاشعال من حلبة الإرواء
- بدء تشغيل المضخة الدوارة وملء الأنبوب مع الإرواء. الحرص على تفريغ جميع فقاعات الهواء منه.
- شغل الجهاز windkessel إلى حوالي منتصف مستوى مع الإرواء.
- معايرة محول الضغط على 0 ملم زئبق عندما يتم تعبئة جميع الأنابيب وتدفق هو 0. الحفاظ على إبرة نضح على مستوى الكلى خلال هذا الوقت.
- إبقاء تدفق على مستوى الحد الأدنى ثابت (0.6 مل / دقيقة) وانتقل إلى الخطوة 5.
5. الجراحي إجراء الجزء 2
- وضع المشبك بين ضمد الرابع والمتفرعة من رينا اليسارل الشريان.
- إجراء شق صغير في الذيلية الأبهر من ضمد الرابع، مع الحرص على عدم قطع الجدار الظهري.
- تمدد فتح في الشريان الأورطي مع الموسع السفينة.
- يقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي مع إبرة (2 سم، وسحبت PE 50)، ودفع الطرف فقط إلى المشبك.
- فتح المشبك.
- دفع غيض من cranially الإبرة حتى يصل تقاطع الصحيح الشريان الكلوي والشريان الأورطي.
- انهيار ضمد السابع.
- انهيار ضمد الرابع.
- فتح الصدر مع مقص من قبل تشريح الحجاب الحاجز. مع خفض واحد، فصل الشريان الأبهر، الوريد الأجوف والقلب والأعصاب الخضري. مع هذه الخطوة، هو التضحية الحيوانية عن طريق استنزاف السريع تحت التخدير العميق المستمر.
- بدء السيطرة على ضغط مضخة نضح. الحفاظ على الضغط المتوسط بين 80 و 100 مم زئبق.
- انهيار خامسا رباط
- انهيار ضمد السادس.
- انهيار ضمد الثامن.
- الحرة الكلية اليمنى من TISSU الضامه وتضمينها في داخل كبسولة الدهنية مع مقص.
- قطع الشريان الأورطي قريب إلى ضمد V.
- قطع الشريان المساريقي العلوي إلى أقصى حد لضمد السادس.
- قطع حزمة السفينة الداعمة الكلى بها، مع الحرص على عدم قطع في الأوعية أنفسهم.
- قطع الكبد في اتصال الكلى. رعاية لتحرير الكلى، ولكن ترك جزء صغير من تمسكا الكبد لذلك، بحيث يتم الحفاظ على الوريد الأجوف مفتوحة بها.
- اتخاذ حزمة الكلى من الماوس. إزالة الماوس من غرفة رطبة.
- وضع "اسو" رباط حول ربط الكبد والكلى (التاسع رباط).
- يقني؛ يدخل القنية الوريد الأجوف مع خط وريدي (2 سم PE 50).
- انهيار ضمد التاسع. تدفق الوريدي من خلال خط وريدي يجب أن تبدأ على الفور.
- إغلاق غرفة رطبة.
6. تحليل المصب
- خلال ساعة التالية، تراقب باستمرار تدفق الدم وintravasculضغط ع 15. جمع تدفق الوريدي، والتي يمكن استخدامها لتحليل، على سبيل المثال، الكلوي الإفراج الرينين 7. جمع البول لتحليل تركيز بالكهرباء والكبيبي معدل الترشيح 14. بعد 1 ساعة من نضح والكلى يمكن المفاجئة المجمدة لالنشاف الغربية أو أن تكون ثابتة للتصوير النهج 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع طريقة وصفها، يمكن أن الكلى الماوس معزولة لا تزال قابلة للحياة لا يقل عن 1 ساعة. نحن اختبار قابلية الأنسجة بعد 1 ساعة من نضح مستمر مع وظيفية (تدفق الكلوي الدم ومقاومة الأوعية الدموية، وتحليل غازات الدم من التدفق الوريدي، معدل الترشيح الكبيبي، البولية كسور نا + و K + إفراز، والأسمولية البول) والصرفي (الإلكترون انتقال المجهر، تيم) طرق في أربع كلى من wildtype C57BL / 6 الفئران. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء البقع الغربية من البروتينات علامة قمي قطاعات أنبوب صغير مختلفة، مقارنة الكلى perfused معزولة الكلى unperfused من الحيوانات نفسها. في كل التجارب، تم استخدام المستمر نضح الضغط، والحفاظ على ضغط التروية في ~ 100 مم زئبق (الشكل 4). في تلك الكلى، وظل تدفق سائل الإرواء ومقاومة الأوعية الدموية مستقرة على مدى فترة زمنية من 55 دقيقة في 15.6 ± 0.4 مل / دقيقة * غرام من الوزن الكلى و 35 ± 1.0 مم زئبق * دقيقة / مل على التوالي (الشكل 4). انخفاض تدفق سائل الإرواء أو زيادة في المقاومة الوعائية هي معلمة حساسة فيما يتعلق تقليل قابلية الأنسجة وينبغي رصد جميع أنحاء نضح بعناية. كشفت غازات الدم والتحليل بالكهرباء في 100 عينة ميكرولتر أخذ 60 دقيقة بعد بداية التروية الكلوي CO 2 الإنتاج والاستهلاك O 2، عندما تمت مقارنة تدفق الدم إلى تدفق الوريدي (الجدول 2). ظلت العوامل الأخرى على حالها بين الشريان والوريد (الجدول 2). وينبغي التركيز بشكل خاص على دون تغيير إطلاق البوتاسيوم وريدي، كما قد يحدث ارتفاعا خلال تلف الأنسجة. معدل الترشيح الكبيبي، وتقييمها، عن طريق إزالة FITC-سكري 14، تميل إلى زيادة مع مرور الوقت (الشكل 4 ب) ولكن هذا الاتجاه لم يصل إلى مستوى مهم. إفراز كسور من الصوديوم والبوتاسيوم تقييم بعد 55 دقيقة من نضحيتم زيادة مقارنة بالوضع في الجسم الحي (الشكل 4 C). لم يتم رفع البول الأسمولية فوق الأسمولية من تدفق الوريدي بعد 55 دقيقة من نضح (الشكل 4 D).
الدراسات المورفولوجية، كانت ثابتة الكلى بعد نضح في 3٪ امتصاص العرق و 0.1٪ غلوتارالدهيد في المخزن غسيل الكلى كما هو موضح سابقا (17). تم تقييم التركيب الدقيق الكلوي مع تيم. ظهرت الكبيبات وS1 شرائح الأنابيب القريبة دون تغيير إلى حد كبير بعد التروية (الشكلان 5 ألف وباء). بعض، ولكن ليس كل شرائح S2 / S3 من الأنابيب القريبة والأطراف تصاعدي سميكة التي لم تكن قريبة من الحزم الوعائية كانت تظهر علامات للتلف الجهاز، كما هو موضح سابقا في الفئران المعزولة الكلى perfused 5 (الشكلان 5 C و D). حتى على تفتيش قريبة، لم الأنابيب الملتوية البعيدة وجمع القنوات لا تظهر علامات واضحة للنخر (الأرقام 5 E، F، G و). في الختام، النتائج الشكلية في الكلى الماوس تعكس الوضع الموجود في الجرذان عزل الكلى perfused 5.
البقع الغربية من البروتينات علامة قمي للقطاعات كليون مختلفة في الكلى perfused معزولة (المجمدة المفاجئة بعد 1 ساعة من نضح) مقارنة الكلى المقابل unperfused من نفس الحيوان (المفاجئة المجمدة قبل بداية نضح) لم يكشف عن تغيرات كبيرة. درسنا نابي-IIA (الموجود في الأنابيب القريبة)، NKCC2 (أطرافه تصاعدي سميكة)، NCC (الأنابيب الملتوية البعيدة)، وعناق (ربط الأنابيب / جمع مجاري) (شكل رقم 6 A و B).
الشكل 4: تقييم الجدوى الوظيفية للكلى Perfused لمدة 55 دقيقة. أ) </ قوي> وخلال نضح الضغط المستمر، ومقاومة الأوعية الدموية وتدفق سائل الإرواء ظلت مستقرة لمدة 55 دقيقة. يتم استبعاد 15 دقيقة الأولى بسبب التباين الشديد ينظر دائما خلال هذه الفترة. ب) عرض الكبيبي معدل الترشيح (FITC-سكري) أربع كلى تقييمها بعد 25 و 55 دقيقة زيادة كبيرة طفيفة ولكن ليس مع مرور الوقت. C) إفراز كسور من الصوديوم والبوتاسيوم تقييم بعد 55 دقيقة من نضح. D) البلازما الوريدي والبول الأسمولية بعد 55 دقيقة من نضح. ن = 4 في جميع التجارب. وتعرض البيانات على النحو يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: نقل المجهر. ممثل مورفولوجية D قطاعات ifferent كليون من Perfused الكلى عند نقطة نهاية 1 ساعة. أ) الكبيبات هي سليمة. التفاصيل من خلية رجلاء في الكبيبة. جزء B) S1 من أنبوب صغير القريبة. شرائح S1 سليمة. الجزء ج) S2 / S3 من أنبوب صغير القريبة. بعض، ولكن ليس كل شرائح S2 / S3 من الأنابيب القريبة هي الميتة غاية. خلايا تظهر منتفخة وتظهر الأضرار داخل الخلايا الكبيرة. تم الإبقاء على مخطط أنبوبي إلا عن طريق الغشاء القاعدي. D) أطرافهم تصاعدي سميكة (TAL). تلك TALs التي هي بعيدة كل البعد عن الحزم الوعائية تظهر أولى علامات انحطاط مائي. الأغشية اللمعية تبدو ضعيفة وهشة. E) البعيدة نبيب الملتوية (DCT). DCTs سليمة. F) التفاصيل من infoldings basolateral من خلية DCT. منوفذة البطانة، الغشاء القاعدي، infoldings basolateral، والميتوكوندريا سليمة. G) جمع مجاري الهواء (CD). الأقراص المدمجة سليمة.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: البقعة الغربية من قمي ماركر البروتينات في الكلى Perfused المعزولة بالمقارنة مع Unperfused الكلى من الحيوانات نفسها. أ) البقع الغربية الكلى perfused لمدة 1 ساعة والكلى unperfused. نابي-IIA هو ممثل للنبيب الداني. NKCC2 هو ممثل لطرف تصاعدي سميكة. فسفرته NCC وNCC في ثريونين 53 (pT53 NCC) ينحصر وجودها في أنبوبة ملتوية بعيدة. وترد ألفا وجاما مفارز عناق في الطول الكامل وكل منتجاتها المشقوق proteolytically ممثل لربط أنبوب صغير / جمع مجاري الهواء. B) الكمي لأ) لم تكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية بين و الكلى perfusedأو 1 ساعة والكلى unperfused. ن = 3 في جميع التجارب. وتعرض البيانات على النحو يعني ± ووزارة شؤون المرأة وتظهر القيم الفردية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تكوين حلول وغسيل الكلى العازلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
الجدول 2: غازات الدم والتحليل بالكهرباء من الشرايين تدفق وتدفق الوريدي من Perfused ماوس الكلى 60 دقيقة بعد بداية الإرواء (ن = 4). وتعرض البيانات على النحو يعني ±ووزارة شؤون المرأة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الماوس معزولة الكلى perfused هو أداة لدراسة وظائف الكلى في بيئة تسيطر عليها خارج الجسم لمدة 1 ساعة، سد الفجوة بين التجارب المجراة على الحيوانات سليمة، والتي قد تكون معيبة بسبب تأثير العوامل النظامية عديدة، وفي التجارب المختبرية في شرائح كليون معزولة أو الخلايا المستزرعة، التي تهمل بالضرورة تأثير هيكل الجهاز سليمة على وظيفة. هناك، على حد علم الكتاب "، أي تقنية بديلة التي لأداء هذه المهمة المحددة. الدراسات البيوكيميائية على أنسجة الكلى، ومع ذلك، لا يمكن أن يؤديها بطريقة أبسط بكثير باستخدام شرائح الكلى 17. في حين يتم استخدام تقنية عرض حاليا في الغالب لدراسة علم وظائف الأعضاء الكلوي، وتجري حاليا مناقشة العديد من التطبيقات الجديدة. على سبيل المثال، يمكن استخدامه للالهندسة الحيوية الكلى خلال decellularization نضح وrecellularization 12. وبالإضافة إلى ذلك، نضح سوي الحرارة لفترات طويلة من الكلى قبل TRansplantation، مع إعطاء جرعات عالية من المضادة للرفض أو الجينوم تحرير المخدرات في الإرواء، ويجري دراستها. حتى في المرافق الصحية 8، 9، 10، 11. الماوس معزولة الكلى perfused هو أداة ممتازة يمكن استخدامها لهذه التطبيقات، وخاصة لإلقاء الضوء على دور الجينات الفردية مع نماذج خروج المغلوب.
ثلاث خطوات حاسمة لتجربة ناجحة. تقدم هذه الورقة المختبرات المهتمة وسيلة لإعادة إنتاج الإجراء. أولا، يجب أن تكون مستعدة في مثل هذه الطريقة التي يتلقى الكلى معظم العناصر الغذائية اللازمة لبقاء لفترة طويلة في ظل ظروف استنساخه المخزن المؤقت. يجب إيجاد توازن بين الظروف التي تسيطر عليها بالكامل (عازلة الاصطناعية) وحالة التروية الأم (الدم الكامل). لذلك، يجب أن تضمن الزلال وكريات الدم الحمراء الثدييات إلى الهيماتوكريت 10٪. ويمثل هذا الهيماتوكريت، في أصحاب الخبرة، وأفضل حل وسط بين ر كافيةقضية الأوكسجين وانخفاض اللزوجة عازلة (زيادة الهيماتوكريت يقلل تدفق بشكل كبير خلال نضح الضغط المستمر (مقارنة القيم الواردة في هذه الوثيقة على القيم في الكلى perfused دون الكريات الحمراء 18)). جودة ونضارة من الكريات الحمراء أمر بالغ الأهمية. خلال خطوات الغسيل، لا بد من التعامل معها بحذر لمنع انحلال الدم كريات الدم الحمراء. يجب أن تكون على استعداد حديثا في يوم التجربة المخزن المؤقت. ثانيا، تحتاج إلى أن يقوم بها جراح المدربين في أقرب وقت ممكن لعملية جراحية. يحتاج الجراح إلى إجراء 6 الأربطة حول الأوعية الرئيسية التي تربط الكلى إلى باقي الجسم، مع الحفاظ على فقدان الدم من الحيوان إلى أدنى حد ممكن. لأفضل النتائج، ينبغي أن يتم إنجاز التدخلات الجراحية في غضون 30 دقيقة. إذا كان ضغط الدم الشرياني يعني الحيوان يسقط، خلال عملية جراحية طويلة أو بسبب التخدير، وأقل من 60 مم زئبق، ونضح الكلوي تكون على الحد الأدنى، وسوف الأنسجة تكون عرضةإلى نخر. إلى يستبعد ذلك، يمكن أن تؤخذ في الكلية اليسرى بعد الجراحة، عندما بدأت نضح من الكلية اليمنى بالفعل، واستخدامها كعنصر تحكم غير المعالجة. ثالث خلال فترة نضح سير الصحيح للجهاز نضح، تتألف من الدوائر الصغيرة الحيوان نضح القياسية، يحتاج، لا بد من ضمان. في حين يقوم جهاز الكمبيوتر نضح في حد ذاته، والإشراف البشري ضروري، على سبيل المثال للتحقق من وجود فقاعات في الدائرة نضح.
البيانات التمثيلية المنصوص تسمح لتقييم الجدوى الكلى بعد 1 ساعة من خارج الحي نضح والمقارنة من نجاح فني في أي تنفيذ هذا الأسلوب لنهج الموصوفة هنا. أثناء لا يقل عن 1 ساعة، وتدفق الدم الكلوي، ومقاومة الأوعية الدموية، وينبغي أن تظل غازات الدم من التدفق الوريدي ومعدل الترشيح الكبيبي مستقر.
هناك بعض القيود على هذه التقنية، التي يتعين على المرء أن نأخذ في الاعتبار. حتى كيdney إصدار من الجراحة الناجحة يمكن أن يظل قابلا للتطبيق فقط لفترة محدودة. وجد الباحثون 1 ساعة ليكون أفضل نقطة في الوقت الذي وقف نضح. بالإضافة إلى ذلك، في حين نضح في الكلى معزولة يسمح لدراسة الجهاز كله معزولة في العمق، فانه من الصعب التفريق آثار محددة على نوع خلية واحدة. الكلى ثابتة بعد 1 ساعة قد تظهر العيوب في قطاعات S3 من الأنابيب القريبة وسميكة خلايا الطرف الصاعد، في حين الكبيبات، شرائح S1، DCTs، والأقراص المدمجة وينبغي أن تظل سليمة. استخدام الإلزامي من كريات الدم الحمراء، وخاصة من البشر، ويرتبط أيضا إلى المخاطر المحتملة (على سبيل المثال، والالتهابات) لمجرب.
وباختصار، فإن الماوس معزولة الكلى perfused هو تقنية مفيدة مع الذي لدراسة الجهاز كله خارج الحي. مثل أي تقنية، لها مزايا وقيود معينة. يعتقد المؤلفون أن كلا من التطبيقات الجديدة المتعددة التي تنشأ حاليا وهذا البروتوكول يمكن أن توفر sufficienر الزخم للمختبرات أخرى لإنتاج هذا الجهد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
- Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
- Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
- Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
- Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
- Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
- Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
- Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
- Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
- Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
- Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. , (2016).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).
