Summary
鼠标离体灌注肾（MIPK）是用于灌注和1小时官能体外条件下保持一个小鼠肾脏的技术。的缓冲液和外科技术进行详细说明。
Abstract
鼠标离体灌注肾（MIPK）是用于灌注和1小时官能体外条件下保持一个小鼠肾脏的技术。这是研究分离的器官，并为许多创新的应用程序，可能会在未来成为可能，包括灌注脱细胞肾生物工程或抗排斥或基因组编辑药物在高剂量黄金肾脏的管理生理学的一个先决条件用于移植。在灌注时，肾脏可以被操纵，肾功能可以评估，和给药的各种药物。手术后，肾脏可以移植或用于分子生物学，生物化学分析，或显微处理。
本文介绍了灌流，需要鼠标肾脏的体外灌注的手术技术。灌注装置的细节给出并且呈现表示V数据肾脏的制剂iability：肾血流量，血管阻力，和尿的数据作为不同肾段作为形态学读数，和不同肾段作为分子读出的转运蛋白的蛋白质印迹的官能，透射电子显微镜照片。
Introduction
器官的隔离灌注一直生理学家中不断努力的主题几十年1。该技术使器官的功能，而没有全身的影响，如血压，激素，或神经，进行研究。卡尔·爱德华Loebell被认为是第一个所描述的一个孤立肾灌注成功，于1849年2。此后，灌注设备发生了显著细化。弗雷和格鲁伯引入了氧合搏动泵人工肺的连续灌流2。虽然早期的研究人员重点研究大型哺乳动物-即，猪2和狗3使用大鼠肾脏的-the第一份报告，魏斯等人的肾脏。 ，是小型哺乳动物器官灌注4研究的一个里程碑。 Schurek 等。报道添加哺乳动物红细胞到灌流如果有足够的肾小管的必要性氧合要达到5。临界长期实验是由相同的研究组6引进缓冲器的连续透析。在2003年，Schweda 等。是第一个报告功能的鼠标离体灌注肾（MIPK）7，后来被Rahgozar 等精制而成。 18和林德尔等。 14。
虽然在技术上不是孤立肾灌注大鼠更具挑战性，使用MIPK负有能够使用各种各样基因改造的小鼠中的优势。本文介绍了作者的方法的详细信息隔离灌注小鼠肾1小时。该方法允许对肾流量，血管阻力，激素释放，血气分析，尿液分析，以及药物的应用程序的连续评估。以下的方法，肾脏可以用于分子和生化分析进行处理，是固定的显微镜，或移植到受体小鼠（ 图1）。
图1：可能的输入/输出到离体肾的概述。 BGA：血气分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
这种技术可能会得到更多的关注，未来数年，多创新应用正在与长期常温肾脏血流灌注的曙光移植前的讨论（含或不含抗排斥或基因组编辑药物的应用）8，9，10 11，从脱细胞支架12整个肾脏的生物工程，剂量和高剂量荧光染料对多光子成像13应用14中特定基因的作用的理想模型。
一个一步一步的协议，是考虑到让其他实验室成功地执行孤立的小鼠肾脏灌注。首先，组合物和制剂的缓冲液中被指定。然后，手术中详细描述和示出的关键步骤。第三，数据呈现的是，用于展示成功制备的：肾血流量，血管阻力，肾小球滤过率和分数电解质排泄-所有灌注肾脏的不同肾段的形态的生存能力和透射电子显微照片的功能性测量灌注后的1小时固定。
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Protocol
所有涉及这个手稿中描述动物的程序进行了根据瑞士法律和瑞士苏黎世州的兽医行政管理部门批准。
1.缓冲液配制
- 制备溶液1 - 4和抗利尿激素（ADH）溶液（ 表1）。
- 制备透析缓冲液（ 表1）。
注意：这是用作灌注在透析缓冲的缓冲器。以后，红细胞将在这个缓冲液稀释以形成最终灌洗液。 - 红细胞制剂。
- 稀释250毫升人红细胞浓缩至500毫升透析缓冲液（从当地血库获得测试材料）。离心在2000 xg离心8分钟。删除缓冲区，注意不要删除任何红细胞。重复3倍。
- 制备白蛋白（牛血清白蛋白; BSA）的缓冲液中。
- 在200毫升dialysi的的缓冲器中，用搅拌棒溶解44克BSA的。过滤用滤纸将溶液。
- 准备灌注液。
- 从步骤1.3.1通过滤纸进入BSA缓冲过滤红细胞。填充到800毫升的透析缓冲液的总体积。
注意：这是最后的灌注液。血细胞比容现在应该在8和12％之间。灌注液可以储存于4℃多达12小时下进行。
- 从步骤1.3.1通过滤纸进入BSA缓冲过滤红细胞。填充到800毫升的透析缓冲液的总体积。
2.起爆透析和氧合
- 打开周围较大缓冲储水，较小的缓冲液贮存和湿室（一个小的，双壁腔带到37℃和100％湿度稍后握住肾）至37℃的水浴（ 图2） 。
- 填充透析缓冲液的较大的缓冲区贮存器和与灌注液较小贮存器。
- 2/95％O 2的气体流入转动5％CO到透析缓冲液。
- 打开对透析缓冲灌注液的连续透析。小心使用低通量透析管。继续执行步骤3。
图2：灌注回路的示意图。方案示出了灌注回路的主要组成部分和缓冲液流的方向。由深蓝色包围所有部件都保持在37℃的水浴/恒温器。 1：灌注缓冲液中的至少3倍体积的透析缓冲液连续地用95％O 2/5％CO 2鼓泡。 2：透析缓冲液和灌注缓冲液被连续地对在透析管彼此通过一个滚子泵透析。 3：由于这种透析，在灌注缓冲液用9％氧气富集2/5％CO 2和电解质水平保持恒定throughoUT灌注。 4：滚子泵推动朝肾脏灌注缓冲区。 5：删除的Windkessel蠕动波，并作为一个泡沫陷阱。 6：压力传感器（连接到4（滚子泵），以保持连续的压力，同时允许自由交替流）。 7：在整个灌注，肾保持在100％的空气湿度和37℃肾温度的潮湿室中。 请点击此处查看该图的放大版本。
3.手术过程第1部分（适用于所有结扎的示意图，见图3）
注意：请用5-0外科缝线结扎所有。
- 麻醉通过腹膜内注射的小鼠（体重20毫克/毫升氯胺酮和1毫克/毫升甲苯噻嗪溶解在0.9％NaCl中的10微升/克）。确认anesth足够的深度ESIA通过测试后无足反射的。
- 固定鼠标在湿室仰卧位置。保护眼睛与兽医药膏。放置脊柱低于1ml注射器来升高腰椎血管。
- 从耻骨嵴到胸骨开幕先将患处，然后腹肌，用剪刀执行中位数剖腹探查术。
- 除去肠并将其放置在从腹部鼠标侧的左侧。
- 无结缔组织，膀胱，探索两侧输尿管和尿道。
- 周围放置左侧输尿管（结扎I）的结扎。关闭它。
- 将尿道周围（结扎II）连字。关闭它。
- 将围绕整个膀胱（结扎III）一个“套索”连字。
- 切开膀胱1毫米。
- 导管插入与2厘米PE管材50开。
- 关闭结扎III管道周围。
- 剪切从结扎左侧输尿管和尿道远端。该BLAD德现在连接到右输尿管仅自由移动。
- 清除结缔组织和脂肪的腹主动脉。
- 将腹部中期主动脉结扎（结扎IV）。
- 周围放置肠系膜上动脉和腹腔干（结扎Ⅴ）之间的隔膜下方的主动脉结扎。
- 周围放置肠系膜动脉（结扎VI）的结扎。
- 放置一个主动脉结扎正下方的右侧和左侧肾动脉（结扎Ⅶ）以上。
- 周围放置尾静脉包（静脉）（结扎Ⅷ）结扎。继续执行步骤4。
图3：手术时放置在连字的示意图。查看剖腹手术后开腹部。肠道移出到左侧。 L和R指示的左右肾。该黑线显示各个结扎的面积。连字放在前面，然后关闭，在文中给出的顺序排列。 X标记为主动脉插管切口的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
4.灌注回路的引发
- 启动回转泵和填充灌注液管路。小心从它清空所有气泡。
- 该设备的Windkessel填写大约级中旬灌流。
- 校准压力传感器为0毫米汞柱时所有管路被填充和流量为0保持在肾脏水平灌注针在这段时间。
- 保持流动在一个恒定的最低水平（0.6ml /分钟），并继续执行步骤5。
5.手术过程第2部分
- 放置结扎IV和左RENA的分支之间的夹紧升动脉。
- 使结扎IV的主动脉尾一小切口，注意不要切背墙。
- 用扩张血管扩张主动脉开幕。
- 导管插入用针主动脉（2厘米长，拉PE 50），推尖端正好夹。
- 打开夹子。
- 推针颅的前端，直到它到达右肾动脉和主动脉的连接处。
- 关闭结扎七。
- 关闭结扎IV。
- 通过解剖隔膜打开用剪刀胸部。通过单一切口，分离主动脉，腔静脉，心脏和植物神经。与此步骤中，该动物是通过在连续深度麻醉迅速放血处死。
- 启动灌注泵的压力控制。保持80至100毫米汞柱之间的平均压力。
- 关闭结扎V.
- 关闭结扎VI。
- 关闭结扎八。
- 从结缔组织Tissu酒店免费右肾e和它嵌入到用剪刀脂肪囊。
- 切主动脉近端至结扎线V.
- 切肠系膜上动脉远端，以结扎线VI。
- 切肾血管配套捆绑了，小心不要切入血管自己。
- 割肝在连接到肾脏。照顾到释放肾，但将肝粘附的一小部分到它，因此，腔静脉通过它保持打开。
- 取肾捆绑了鼠标。从湿室中取出鼠标。
- 周围放置肝脏和肾脏（结扎IX）的连接的“套索”连字。
- 导管插入与静脉线路（2毫升的PE 50）的下腔静脉。
- 关闭结扎九。通过静脉行静脉流出应立即启动。
- 关闭湿室。
6.下游分析
- 在以下小时，连续监测血流量和intravasculAR压力15。收集静脉流出，它可以被用于分析，例如，肾肾素释放7。收集尿液的电解质浓度及肾小球滤过率14分析。灌注1小时后，肾脏可以管理单元冷冻western印迹或固定成像方法16。
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Representative Results
与所描述的方法，分离小鼠肾可为至少1小时保持存活。我们后官能（肾血流量和血管阻力，静脉流出，肾小球滤过率，尿分数Na +和K +排泄血气分析和尿液摩尔渗透压浓度）和形态（透射电子连续灌注的1小时测试的组织活力显微镜，TEM）的方法，在野生型C57BL / 6小鼠四个肾脏。此外，进行了不同的小管的根尖标记蛋白的蛋白质印迹，隔离灌注肾脏比较同一动物unperfused肾脏。在所有的实验中，使用恒压灌注，保持灌注压力在约100毫米汞柱（ 图4）。在那些肾脏，灌流液流量和血管阻力位在肾重和3的15.6±0.4毫升/分钟* G超过55分钟时间保持稳定5±1.0毫米汞柱*分钟/毫升，分别为（ 图4 A）。灌注液流动或增加血管阻力的减少是与问候减小组织活力并应在整个小心灌注监视一个敏感的参数。当动脉流入物相比，静脉流出（ 表2）血液气体和灌注发作后取60分钟100μl的样品电解质分析表明肾的 CO 2生产和O 2消耗量。其它参数保持动脉和静脉（ 表2）之间保持不变。特别强调要抓好不变静脉释放钾，如组织损伤过程中可能出现的增加。肾小球滤过率，通过FITC标记的菊粉清除14评估，倾向于随时间而增加（ 图4 B）中 ，但这种趋势没有达到显着性。钠和钾的排泄分数55分钟灌注后评估相比， 在体内的情况（ 图4℃）增加。尿渗透压没有后灌注的55分钟（ 图4 D）的静脉流出的渗透压以上升高。
形态学研究，肾脏中的3％多聚甲醛灌注和0.1％戊二醛后在透析缓冲液，如前所述17固定。肾超微结构与TEM评估。近端小管的肾小球和S1段出现灌注（ 图5 A和B）后基本上保持不变。有些，但不是近端小管的所有S2 / S3段和厚升序肢体的未收到维管束被示出器官损伤的迹象，如在大鼠离体灌注肾脏5如前所述（ 图5 C和D）。即使在仔细检查，远曲小管和集合管没有表现出坏死明显的迹象（图5 E，F和G）。总之，在小鼠肾脏形态学结果反映在大鼠离体灌注肾脏5中发现的情况。
相比同动物unperfused对侧肾脏在离体肾脏的不同肾段顶标志蛋白印迹（后灌注1小时快速冷冻）（灌注来临之前快速冷冻）没有发现显著的改变。我们研究NAPI-IIA（位于近端小管），NKCC2（厚升序肢体），NCC（远曲小管），和ENaC的（连接管/集合管）（ 图6 A和B）。
图4： 灌注55分钟肾脏的功能可行性评估。 A）</ STRONG>在恒压灌注，血管阻力及灌液流55分钟保持稳定。前15分钟被排除由于高变异性在此期间，总是看到。 B）的肾小球滤过率的后25和55分钟进行评估4肾脏（FITC-菊粉）显示随时间轻微但不显著增加。 C）的钠和钾的排泄分数后灌注的55分钟进行评估。 D）的静脉血浆和尿液后灌注的55分钟渗透压。 n = 4时在所有实验中。数据表示为平均值±SEM表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5： 透射电子显微镜。的D代表形态灌流肾脏ifferent肾路段在1小时的终点。 A）肾小球都完好无损。在肾小球足细胞一个细节。一个近曲小管的B）S1段。 S1段都完好无损。一个近曲小管C）S2 / S3段。有些，但不是近端小管的所有S2 / S3的片段是高度坏死。细胞出现浮肿，并显示大量细胞内的损伤。管状轮廓仅由基底膜保持。 D）升支粗（TAL）。这些技援贷款是远离维管束显示水样变性的第一个迹象。管腔膜出现变薄，脆弱。 E）远曲小管（DCT）。 DCT的都完好无损。 F），一个DCT单元的基底infoldings的详细。窗孔内皮细胞，基底膜，基底infoldings和线粒体都完好无损。 G）收集管道（CD）。光盘都完好无损。e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图6： 根尖标记蛋白质的蛋白质印迹在离体肾脏相比从相同的动物Unperfused肾脏。 A）肾脏的Western印迹灌注1小时，unperfused肾脏。 NAPI-IIA是近端肾小管代表。 NKCC2为厚上边缘代表。 NCC和NCC磷酸在苏氨酸53（pT53 NCC）在远曲小管中只找到。 ENaC的在其全长和它们各自的蛋白水解切割产物的α和γ亚单位示为连接小管/集合管代表。 B A）的量化）并未透露肾脏灌注F的显著差异或1小时，unperfused肾脏。 n = 3的所有实验。数据表示为平均值±SEM和单个数值被示出。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：解决方案和透析缓冲液的组成。 请点击此处查看该表的放大版本。
表2： 血气和动脉流入的电解质分析和灌注发病后的灌注小鼠肾脏60分钟静脉流出（N = 4）。数据表示为平均值±SEM。
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Discussion
离体灌注肾脏鼠标是用于在受控环境中的体外研究肾功能1小时，架桥在完整的动物体内实验，这可以通过许多全身性因素的影响，是有缺陷的之间的间隙的一个工具，并在体外实验中分离的肾段或培养细胞，这必然忽视完整器官结构对功能的影响。还有就是，以作者的知识，没有替代技术，用以执行这一特定的任务。对肾组织的生化研究，然而，可以在使用肾脏切片17上的更简单的方式执行。而提出的技术目前主要用于研究肾脏生理，许多新的应用正在讨论之中。例如，它可以灌注脱细胞和recellularization 12中用于肾生物工程。此外，现有的肾脏的长期常温灌注到TRansplantation，高剂量抗排斥或基因组编辑药物进入灌流，正在研究中的管理;即使在临床设置8，9，10，11。鼠标离体灌注肾脏是可以用于这些应用中，特别是阐明各个基因的同基因敲除模型中的作用的优秀工具。
三个步骤是一个成功的实验关键。本文提供了重现的程序向有关实验室。首先，缓冲需要的肾接收最必要可重复的条件下长期生存能力的营养素这样的方式来制备。的平衡必须充分控制的条件下（合成缓冲液）和本地灌注状态（全血）之间找到。因此，白蛋白和哺乳动物红细胞至10％的血细胞比容都被包括在内。这血细胞比容表示，在作者的经验，足以t的最佳平衡问题氧合和低粘度的缓冲液（增加红细胞压积下降压力不断灌注过程中显着流量（比较无红细胞18肾脏灌注本文提出将值值））。红细胞的质量和新鲜度是至关重要的。在洗涤步骤，红细胞需要小心处理以防止溶血。缓冲器需要在实验的当天新鲜制备。第二，手术需要由受过训练的医生在最短的时间内进行。外科医生需要执行肾脏周围的连接到身体的其他部分的主要血管6连字，同时保持动物的血液损失降到最低。为获得最佳结果，手术干预应在30分钟内完成。如果动物的平均动脉血压下降，长时间手术期间或由于麻醉，低于60毫米汞柱，肾灌注将已经是最低限度和组织就容易坏死。为了排除这一点，左肾可以在手术后可采取，当右肾灌注已经开始，并用作未处理的对照。第三，在灌注的灌注装置的正确功能，由一个标准的小动物灌注回路的时间，需要确保。当计算机执行其本身的灌注，人力监督是必要的，例如，以检查在灌注回路气泡。
所提供的具有代表性的数据允许肾脏存活率后离体灌注的1小时，并且此方法在本文中描述的方法的任何执行的技术成功的比较评估。在至少1小时，肾血流量，血管阻力，静脉流出和肾小球滤过率的血液气体应保持稳定。
有该技术，其中之一必须记住某些限制。即使きdney从最成功的手术发出只能在有限的时间保持存活。作者发现，1小时是在其停止灌注的最佳时间点。另外，虽然分离肾灌流允许在深度分离的整个器官的研究，这是难以区分在一个细胞类型特异性效应。固定1小时后肾脏可能会显示在近端小管和升支粗细胞的S3段的缺陷，而肾小球，S1段的DCT和CD应该保持不变。强制性使用红细胞，特别是来自人，也与对实验者潜在风险（ 例如 ，感染）。
总之，小鼠离体灌注肾脏是一种有用的技术，用以研究整个器官离体。像的任何技术，它具有一定的优点和局限性。笔者认为，无论是多方面的新的应用所产生的目前这个协议可以提供sufficien其他实验室牛逼势头重现这一努力。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
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