Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Мышь Изолированные перфузировались почки Техника

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

Мышь , изолированных перфузию почек (МИПК) представляет собой метод для поддержания почки мыши в условиях бывших естественных условиях перфузии и функциональных в течение 1 часа. Буферы и хирургическая техника подробно описаны.

Abstract

Мышь , изолированных перфузию почек (МИПК) представляет собой метод для поддержания почки мыши в условиях бывших естественных условиях перфузии и функциональных в течение 1 часа. Это является предпосылкой для изучения физиологии изолированного органа, а также для многих инновационных приложений, которые могут быть возможно в будущем, в том числе перфузионной decellularization для почек биоинженерии или введения анти-отторжения или генома редактирования препаратов в высоких дозах премьер почки для трансплантации. Во время перфузии почек можно манипулировать, функция почек может быть оценена, и различные фармацевтические препараты вводят. После процедуры, почки могут быть пересажены или обработаны для молекулярной биологии, биохимического анализа, или микроскопии.

В данной статье описывается перфузат и хирургической техники , необходимой для экс естественных условиях перфузии почек мыши. Подробная информация о перфузионного устройства приведены данные, показывающие клиновойiability подготовки Почки в: почечный кровоток, сосудистое сопротивление, и мочи данных как функциональных, просвечивающей электронной микрофотографии различных сегментов нефрона как морфологическими считываниями и вестерн-блоттинга транспортных белков различных сегментов нефрона как молекулярного считывания.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Изолированная перфузия органов была предметом постоянных усилий между физиологи в течение многих десятилетий 1. Методика позволяет функцию органа, без системных воздействий, таких как кровяное давление, гормоны, или нервов, чтобы быть изучены. Карл Эдуард Loebell считается первым описал успешное перфузия изолированной почки, в 1849 году 2. С тех пор перфузия аппарат претерпел значительные доработки. Фрей и Грубер представил искусственное легкое для оксигенации и пульсирующих насосов для непрерывной перфузии 2. В то время как ранние исследователи изучали в основном почки крупных млекопитающих, а именно, свиней и собак 2 3 -Первый отчет об использовании почек крыс, Вейсса и др. , Стала важной вехой в изучении перфузии небольшого млекопитающего-органа 4. Schurek и др. сообщили о необходимости добавления к эритроцитам млекопитающих перфузату при наличии достаточных почечных канальцевоксигенации было быть достигнуто 5. Критические для долгосрочных экспериментов было введение непрерывного диализа буфера с помощью той же исследовательской группой 6. В 2003 году Schweda и др. были первыми , чтобы сообщить о функциональной мыши изолированных перфузии почек (МИПК) 7, позже уточнена Rahgozar и др. 18 и Lindell и др. 14.

В то время как технически более сложной, чем крысы, изолированных перфузии почек, использование МИПК имеет то преимущество, что позволяет использовать широкий спектр генетически измененных мышей. В данной статье представлены подробности метода авторов для перфузии изолированных почек мыши в течение 1 часа. Метод позволяет для непрерывной оценки скорости почечного кровотока, сосудистого сопротивления, высвобождение гормонов, анализ газового состава крови, анализ мочи, а также применение лекарственных средств. После процедуры, почки могут быть обработаны для молекулярного и биохимического анализа, должны быть установлены для микроскопии, илипересаживают в мышь - реципиента (рис 1).

Рисунок 1
Рисунок 1: Обзор возможных ввода / вывода к изолированному перфузировались почки. BGA: анализ газов крови. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Этот метод , вероятно , будет получать все большее внимание в предстоящие годы, так как многие инновационные приложения обсуждаются с рассветом длительной нормотермической перфузии почек до трансплантации (с или без применения анти-отторжения или генома редактирования наркотиков) 8, 9, 10 , 11, биоинженерии целых почек от decellularized каркасах 12, и применение высоких доз флуоресцентных красителей для многофотонной томографии 13 14.

Протокол шаг за шагом дается, чтобы другие лаборатории проводить изолированную мыши почки перфузию успешно. Во-первых, состав и приготовление буфера задается. Затем, операция подробно описана и показаны критические шаги. В-третьих, данные представлены, которые являются репрезентативными для успешной подготовки: почечного кровотока, сосудистого сопротивления, скорости клубочковой фильтрации, а дробная электролит экскреции-все, как функциональные измерения жизнеспособности-и просвечивающей электронной микроскопии морфологии различных сегментов нефрона перфузией почек фиксированной после 1 часа перфузии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры, связанные с животными, описанные в этой рукописи были проведены в соответствии со швейцарским законодательством и утверждается ветеринарии кантона Цюрих, Швейцария.

1. Буфер Получение

  1. Готовят растворы 1 - 4 , и раствор антидиуретического гормона (АДГ) (таблица 1).
  2. Подготовка буфера для диализа (таблица 1).
    Примечание: Это буфер, используемый в качестве буфера для диализа во время перфузии. Позже Эритроциты будет разбавлен в этом буфере с образованием конечного перфузата.
  3. подготовка Erythrocyte.
    1. Разбавляют 250 мл концентрата эритроцита человека (тестировалась материала, полученного из местного банка крови) до 500 мл буфера для диализа. Центрифуга при 2000 мкг в течение 8 мин. Удалите буфер, соблюдая осторожность, чтобы не удалить эритроциты. Повторите 3 раза.
  4. Приготовьте альбумин (альбумин бычьей сыворотки БСА) буфера.
    1. В 200 мл dialysis буфера, растворите 44 г БСА с использованием мешалку. Фильтр решение с фильтровальной бумагой.
  5. Подготовить перфузата.
    1. Фильтр эритроцитов, начиная с шага 1.3.1 через фильтровальную бумагу в буфер БСА. Наполните до общего объема 800 мл с помощью буфера для диализа.
      Примечание: Это последний Перфузат. Теперь гематокрита должно быть от 8 до 12%. Перфузат можно хранить в течение до 12 ч при температуре 4 ° С.

2. Инициирование Диализ и оксигенации

  1. Включите водяной бане , окружающей буфер большего размера резервуара, меньший буферный резервуар и влажную камеру (небольшая, с двойными стенками камера доводят до 37 ° С и относительной влажности 100% , чтобы позже провести почка) до 37 ° С (рисунок 2) ,
  2. Заполните буфер большего размера резервуар с буфером диализ и меньший резервуар с перфузату.
  3. Включите 5% CO 2/95% O 2 подачу газа в буфер диализом.
  4. Включение непрерывного диализа перфузату против буфера для диализа. Будьте осторожны, чтобы использовать низкого потока диализной трубки. Перейдите к шагу 3.

фигура 2
Рисунок 2: Схематическое изображение Perfusion Circuit. Схема показывает основные компоненты схемы перфузионной и направление потока буфера. Все компоненты, окруженные темно-синего цвета выдерживают при 37 ° С с водяной бани / термостатом. 1: диализ буфером по крайней мере в 3 раза объем буфера перфузионного непрерывно продувают 95% O 2/5% CO 2. 2: Диализ буфер и буфер перфузию непрерывно диализу против друг друга в диализной трубке с помощью роликового насоса. 3: Из - за этого диализом, буфер перфузия обогащен 9% O 2/5% CO 2 и электролитные уровни поддерживаются постоянными throughoут перфузия. 4: Роликовый насос разгоняет перфузионного буфер к почке. 5: Уиндкессел удаляет перистальтических волн и действует как пузырь ловушку. 6: Датчик давления (подключен к 4 (роликового насоса) , чтобы сохранить постоянное давление, позволяя свободно переменный поток). 7: На протяжении перфузии почек остается во влажной камере в течение 100% влажности воздуха и температуре 37 ° C Температура почек. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Хирургические процедуры Часть 1 (на диаграмме всех лигатур, смотри рисунок 3)

Примечание: Выполните все лигатуры с помощью 5-0 хирургической нити.

  1. Обезболить мышь интраперитонеально (10 мкл / г массы тела, 20 мг / мл кетамина и 1 мг / мл ксилазина, растворенного в 0,9% NaCl). Подтвердить достаточную глубину AnesthОВОСС путем проверки на отсутствие задних ног рефлексов.
  2. Закрепите мышь в положении лежа на спине во влажной камере. Защитите глаза с ветеринаром мазь. Поместите 1 мл шприц ниже позвоночника, чтобы поднять поясничных сосудов.
  3. Выполнить средний лапаротомии от лобковой гребень к грудине открытия первой кожи, то мышцы живота, с помощью ножниц.
  4. Удалить кишечник и поместите его на левой стороне боковой мыши из брюшной полости.
  5. Освободите мочевой пузырь из соединительной ткани и исследовать оба мочеточника и мочеиспускательного канала.
  6. Поместите лигатуры вокруг левого мочеточника (лигатуры I). Закрой его.
  7. Поместите лигатуры вокруг мочеиспускательного канала (лигатуры II). Закрой его.
  8. Поместите "Лассо" лигатуры вокруг всего мочевого пузыря (лигатуры III).
  9. Надрезать мочевого пузыря 1 мм.
  10. Иглу отверстие с 2 см РЕ 50 труб.
  11. Закрыть лигатура III вокруг трубки.
  12. Обрежьте левого мочеточника и мочеиспускательного канала удалена от лигатуры. Bladдер теперь прикреплен к правой мочеточника только и свободно двигаться.
  13. Очистите брюшной аорты соединительной ткани и жира.
  14. Поместите брюшной аорты в середине лигатуры (лигатуры IV).
  15. Поместите лигатуры вокруг аорты ниже диафрагмы между верхней брыжеечной артерии и чревного ствола (лигатура V).
  16. Поместите лигатуры вокруг верхней брыжеечной артерии (лигатуры VI).
  17. Поместите аортального лигатуры непосредственно ниже справа и над левой почечной артерии (лигатура VII).
  18. Поместите лигатуры вокруг хвостового пакета вены (кава) (лигатуры VIII). Перейдите к шагу 4.

Рисунок 3
Рисунок 3: Схематическое изображение лигатур , помещенных во время хирургического вмешательства. Вид на открытой брюшной полости после лапаротомии. Кишечник съехал влево. L и R указывают на левую и правую почку.черные линии показывают площадь соответствующего лигатуры. Лигатуры сначала помещаются, а затем закрыты, в последовательности, указанной в тексте. X обозначает расположение разреза для пункции аорты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

4. Грунтовка перфузионной Circuit

  1. Запустите роторный насос и заполнить трубку с перфузату. Позаботьтесь, чтобы очистить все пузырьки воздуха из него.
  2. Заполните устройство Уиндкессел примерно среднего уровня с перфузату.
  3. Выполните калибровку датчика давления до 0 мм ртутного столба, когда все трубки заполняют и поток 0. Держите перфузионного иглу на уровне почек в течение этого времени.
  4. Держите поток на постоянном минимальном уровне (0,6 мл / мин) и перейти к шагу 5.

5. Хирургическая процедура Часть 2

  1. Поместите зажим между лигатуры IV и разветвлению левого Ренал артерии.
  2. Сделайте небольшой надрез в аорте хвостового лигатуры IV, следя за тем, чтобы не перерезать спинной стенки.
  3. Разбавить отверстие в аорту с расширитель сосуда.
  4. Аорту иглу с иглой (2 см длиной, вытащил PE 50), толкая наконечник только к зажиму.
  5. Откройте зажим.
  6. Вставьте кончик иглы краниально, пока не достигнет стык правой артерии почек и аорты.
  7. Закрыть лигатуры VII.
  8. Закрыть лигатуры IV.
  9. Откройте сундук с ножницами рассечением диафрагмы. С помощью одного разреза, отделяют аорту, полую вену, сердце и вегетативных нервов. С помощью этого шага, животное умерщвляют посредством быстрого обескровливания при непрерывном глубокой анестезии.
  10. Начало регулирования давления перфузионной насоса. Поддерживать среднее давление от 80 до 100 мм ртутного столба.
  11. Закрыть лигатуры В.
  12. Закрыть лигатуры VI.
  13. Закрыть лигатуры VIII.
  14. Свободная правая почка от соединительной Tissuе и его вложение в жировую капсулу с ножницами.
  15. Обрежьте аорту проксимальнее лигатуры В.
  16. Обрежьте брыжеечной артерии дистальнее лигатуры VI.
  17. Разрежьте узелок почки поддерживающие судно из, следя за тем, чтобы не врезаться в самих судах.
  18. Порежьте печень в связи с почками. Позаботьтесь, чтобы освободить почки, но оставить небольшую часть приверженца печени к нему, так что полая остается открытым ею.
  19. Возьмите пучок из почки мыши. Отключив мышь от влажной камере.
  20. Поместите "Лассо" лигатуры вокруг соединения печени и почек (лигатуры IX).
  21. Вводить иглу в полую вену с венозной линии (2 см PE 50).
  22. Закрыть лигатуры IX. Венозный отток через венозную линию следует немедленно начать.
  23. Закройте влажную камеру.

6. Downstream Анализы

  1. В течение следующего часа, непрерывно контролировать поток крови и intravasculдавление 15 соток. Собирают венозного оттока, который может быть использован для анализа, например, почечную высвобождение ренина 7. Сбор мочи для анализа концентрации электролита и клубочковой фильтрации 14. Через 1 час перфузии, почки могут быть быстро замораживают для вестерн - блоттинга или быть установлены для работы с изображениями приближается к 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

С помощью описанной метод, изолированные почки мыши могут оставаться жизнеспособными в течение, по крайней мере 1 часа. Мы протестировали жизнеспособности тканей после 1 ч непрерывной перфузии с функциональной (почечного кровотока и сосудистого сопротивления, анализ газового состава крови венозного оттока, скорости клубочковой фильтрации, недержание дробной Na + и К + экскреции, и осмоляльности мочи) и морфологического (просвечивающей электронной микроскопия, ТЭМ) методы в четырех почках мышей дикого типа C57BL / 6. Кроме того, были проведены Вестерн - блоты из апикальных белков - маркеров различных сегментов канальцев, сравнивая отдельные перфузированных почки unperfused почек тех же самых животных. Во всех экспериментах использовалась постоянная перфузионное давление, поддерживая перфузионное давление при ~ 100 мм рт.ст. (Рисунок 4). В этих почках, Перфузат поток и сосудистое сопротивление оставались стабильными в течение времени 55 мин при 15,6 ± 0,4 мл / мин * г массы почек и 35 ± 1,0 мм рт.ст. * мин / мл, соответственно (рис 4 А). Уменьшение перфузата потока или увеличение сосудистого сопротивления является чувствительным параметром в отношении к снижению жизнеспособности тканей и должна контролироваться по всему перфузией с осторожностью. Газов крови и анализ электролита в 100 мкл образцов , взятых через 60 мин после начала перфузии показал почечную СО 2 производства и потребления O 2, когда приток артериальной сравнивали с венозного оттока (таблица 2). Остальные параметры остались без изменений между артерией и веной (таблица 2). Особое внимание следует уделить неизмененном венозного высвобождения калия, так как увеличение может произойти во время повреждения ткани. Скорость клубочковой фильтрации, оценивали с помощью FITC-Инулин зазор 14, имеет тенденцию к увеличению с течением времени (рисунок 4 B) , но эта тенденция не достигла значения. Фракционной экскреции натрия и калия оценивали после 55 минут перфузииувеличивается по сравнению с ситуацией в естественных условиях (рис 4 C). Моча осмолярность не возвышается над осмоляльностью венозного оттока через 55 мин перфузии (рис 4 D).

Для морфологических исследований, почек были зафиксированы после перфузии в 3% параформальдегида и 0,1% глутарового альдегида в диализной буфере , как описано выше 17. Почечная ультраструктура оценивали с помощью ПЭМ. Клубочков и S1 сегментов проксимальных канальцев появились в основном без изменения после перфузии (рис 5 А и В). Некоторые, но не все сегменты S2 / S3 проксимальных канальцах и толстой восходящей конечности , которые не были близки к сосудистых пучков были с признаками повреждения органов, как было описано ранее в крысиных изолированных перфузией почек 5 (Рисунки 5 C и D). Даже при близком осмотре, дистальных извитых канальцев и собирательных трубочек не показали явные признаки некроза (На рисунках 5 Е, F, и G). В заключение отметим , что морфологические находки в почках мышей отражают ситуацию , найденный в крысиный изолированных перфузируемом почки 5.

Вестерн-блоты из апикальных белков-маркеров различных сегментов нефрона в изолированных увлажненную почек (быстро замораживают после 1 часа перфузии) по сравнению с unperfused контралатеральной почки одного и того же животного (быстро замораживают до начала перфузии) не выявили существенных изменений. Мы изучали Näpi-IIA (расположенный в проксимальных канальцах), NKCC2 (толстые восходящие конечности), НСС (дистальных извитых канальцев) и ENAC (соединяясь канальцы / собирательных трубочках) (рис 6 А и В).

Рисунок 4
Рисунок 4: Оценка функционального Жизнеспособность Почки перфузировались в течение 55 мин. A) </ Сильный> При работе на постоянной перфузии давления, сосудистого сопротивления и перфузата потока оставались стабильными в течение 55 мин. В течение первых 15 мин исключены из-за высокой изменчивости всегда видели в это время. Б) Скорость клубочковой фильтрации (FITC-инулин) из четырех почек оценивали через 25 и 55 мин отображается небольшое , но не существенное увеличение в течение долгого времени. C) фракционной экскреции натрия и калия оценивали через 55 мин перфузии. D) Венозный плазмы и мочи осмоляльности через 55 мин перфузии. п = 4 во всех экспериментах. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: просвечивающей электронной микроскопии. Представитель Морфология D ifferent нефрона Сегменты перфузировались Почки в конечной точке 1 ч. А) клубочки нетронутыми. Деталь подоцита в клубочек. В) S1 сегменте проксимального канальца. сегменты S1 не повреждены. С) S2 / S3 сегмент проксимального канальца. Некоторые, но не все сегменты S2 / S3 проксимальных канальцев сильно некротической. Клетки появляются опухшие и показывают большой внутриклеточный повреждения. Трубчатый контур поддерживается только базальной мембраны. D) толстой восходящей ветви (TAL). Те сталлов, которые далеки от сосудистых пучков показывают первые признаки отечной дистрофии. Просветными мембраны кажутся разбавлять и хрупкими. Е) дистальных извитых канальцев (DCT). ДКП не повреждены. F) Деталь базолатеральных infoldings ячейки DCT. Фенестрированные эндотелий, базальную мембрану, базолатеральных infoldings, и митохондрии нетронутыми. G) собирательных канальцев (CD). Компакт-диски не повреждены.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Вестерн - блот - верхушечного маркерных белков в изолированных перфузировались Почки По сравнению с Unperfused Почки от тех же животных. А) Вестерн - блоты почек перфузии в течение 1 ч и unperfused почек. Näpi-IIa является представителем проксимальных канальцах. NKCC2 репрезентативна для толстой восходящей ветви. НКС и НКК фосфорилируется на треонин 53 (pT53 НКК) исключительно найдены в дистальных извитых канальцев. Альфа и гамма-субъединиц ENaC в их полной длине и их соответствующих протеолитически расщепленные продукты показаны для представителя соединительной трубочки / собирательных канальцев. Б) Количественная А) не выявили существенных различий между почками перфузируемом Fили 1 ч и unperfused почек. п = 3 во всех экспериментах. Данные представлены в виде средних значений ± SEM и отдельные значения показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1
Таблица 1: Состав растворов и диализного буфера. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Таблица 2
Таблица 2: Кровь газа и Электролит анализ артериальных и венозных Приток Отток перфузировались мыши Почки 60 мин после начала перфузии (п = 4). Данные представлены в виде средних значений ±SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мышь , изолированных перфузию почек является инструментом для изучения функции почек в контролируемой среде экс естественных условиях в течение 1 ч, преодоление разрыва между экспериментами в естественных условиях у интактных животных, которые могут быть испорчено под воздействием многочисленных системных факторов, а также в экспериментах пробирке в изолированные сегменты нефрон или культивируемые клетки, которые обязательно пренебрегающие влияние неповрежденной структуры органа на функции. Там не, к знанию авторов, ни одна альтернативная методика, с которой для выполнения этой конкретной задачи. Биохимические исследования на ткань почек, однако, может быть выполнена намного более простым способом , используя почечные срезы 17. В то время как методика представлена ​​в настоящее время используется в основном для изучения физиологии почек, обсуждаются много новых приложений. Например, он может быть использован для почек биоинженерии в течение перфузионной decellularization и recellularization 12. Кроме того, длительное нормотермических перфузии почек, предшествующих трansplantation, с введением высоких доз анти-отторжения или генома редактирования наркотиков в перфузату, изучается; даже в клинических условиях 8, 9, 10, 11. Мышь, изолированных перфузию почек является отличным инструментом, который можно было бы использовать для этих приложений, особенно для выяснения роли отдельных генов с моделями нокаутом.

Три шага имеют решающее значение для успешного проведения эксперимента. Эта статья предоставляет заинтересованным лаборатории со средствами воспроизвести процедуру. Во-первых, буфер должен быть подготовлен таким образом, что почки получает большую часть питательных веществ, необходимых для длительной жизнеспособности в воспроизводимых условиях. Баланс должен быть найден между полностью контролируемых условиях (синтетический буфер) и нативного состояния перфузии (цельной крови). Таким образом, альбумин и эритроцитах млекопитающих к гематокритом 10%, должны быть включены. Это гематокрита представляет, в опыте авторов, наилучший компромисс между достаточным твыпуск оксигенации и низкой вязкости буфера (увеличение гематокрита резко уменьшается текучесть при надавливании постоянной перфузии (сравните значения , представленные в этой статье , к значениям в почках увлажненную без эритроцитов 18)). Качество и свежесть эритроцитов имеет решающее значение. Во время промывки, Эритроциты должны быть обработаны с осторожностью, чтобы предотвратить гемолиз. Буфер должен быть подготовлен свеже на день эксперимента. Во-вторых, операция должна выполняться квалифицированным хирургом в кратчайшие сроки. Хирург должен выполнить 6 лигатуры вокруг магистральных сосудов, соединяющих почки к остальной части тела, сохраняя при этом потери крови животного к минимуму. Для получения оптимальных результатов, хирургические вмешательства должны быть выполнены в течение 30 минут. Если среднее артериальное давление крови животного падает, при длительной операции или из-за анестезии, ниже 60 мм рт.ст., почечную перфузию уже будет минимальным, и ткань будет подверженк некрозу. Чтобы исключить это, левой почки могут быть приняты после операции, когда перфузия правой почки уже началась, и использовали в качестве необработанного контроля. В-третьих, во время перфузии правильного функционирования перфузионной аппарата, состоящего из стандартной схемы малого животного-перфузионного, должно быть обеспечено. В то время как компьютер выполняет перфузию сам по себе, человеческое наблюдение необходимо, например, для проверки на наличие пузырьков в цепи перфузионного.

Представительные данные , предоставленные позволяет для оценки жизнеспособности почек после 1 ч экс виво перфузией и сравнение технического успеха любого исполнения этого метода с подходом , описанным в настоящем документе. В течение не менее 1 ч, почечный кровоток, сосудистое сопротивление, газы крови венозного оттока и скорости клубочковой фильтрации должны оставаться стабильными.

Существуют определенные ограничения на технику, которую надо иметь в виду. Даже киdney, выходящая из самой успешной операции может оставаться жизнеспособным только в течение ограниченного времени. Авторы обнаружили, 1 час, чтобы быть лучшим моментом времени, при котором, чтобы остановить перфузию. Кроме того, в то время как перфузия изолированной почки позволяет исследовать обособленного целого органа в глубину, трудно дифференцировать специфические эффекты на одном типе клеток. Почки фиксированных через 1 час может показать дефекты в S3 сегментах проксимальных канальцев и толстых клеток восходящей ветви, в то время как клубочки, сегменты S1, ДКП, и компакт-диски должны оставаться нетронутыми. Обязательное использование эритроцитов, особенно у людей, также связано с потенциальными рисками (например, инфекции) для экспериментатора.

Таким образом, мыши , изолированные перфузию почек является полезным методом , с которой изучить весь орган исключая виво. Как и любой другой техники, у нее есть определенные преимущества и недостатки. Авторы считают, что как многообразие новых приложений в настоящее время возникают и этот протокол может обеспечить sufficienт импульс для других лабораторий, чтобы воспроизвести эту работу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81, (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123, (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7, (1), 1-11 (1975).
  4. Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196, (5), 1115-1118 (1959).
  5. Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53, (2), 145-155 (1985).
  6. Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16, (3), 377-384 (1979).
  7. Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284, (4), F770-F777 (2003).
  8. Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360, (1), 7-19 (2009).
  9. Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13, (5), 1246-1252 (2013).
  10. Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38, (4), 352-361 (2014).
  11. Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
  12. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19, (5), 646-651 (2013).
  13. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  14. Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
  15. Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100, (4), 556-563 (2007).
  16. Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. (2016).
  17. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8, (10), 1227-1236 (2015).
  18. Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9, (5), 288-296 (2004).
Мышь Изолированные перфузировались почки Техника
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter