Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Musen Isolerad perfusion njure Technique

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

Musen isolerad perfusion njure (MIPK) är en teknik för att hålla en mus njure enligt ex vivo förhållanden perfunderade och funktionella för en timme. Buffertarna och kirurgisk teknik beskrivs i detalj.

Abstract

Musen isolerad perfusion njure (MIPK) är en teknik för att hålla en mus njure enligt ex vivo förhållanden perfunderade och funktionella för en timme. Detta är en förutsättning för att studera fysiologi isolerade organ och för många innovativa tillämpningar som kan vara möjligt i framtiden, inklusive perfusion decellularisering för njur bioteknik eller administration av anti-avvisande eller genomredigering läkemedel i höga doser till prime njuren för transplantation. Under tiden för perfusion, kan njurarna manipuleras, njurfunktionen kan bedömas, och olika läkemedel administreras. Efter ingreppet kan njuren transplanteras eller behandlas för molekylärbiologi, biokemisk analys eller mikroskopi.

Detta dokument beskriver perfusatet och den kirurgiska tekniken som behövs för ex vivo perfusion av mus njurar. Detaljer av perfusionsapparaten är givna och data presenteras som visar viability av njuren förberedelser: renalt blodflöde, vaskulär resistans, och urin data som funktionella, transmissionselektronmikrofotografier av olika nephron segment som morfologiska avläsning och western blöts av transportproteiner av olika nephron segment som molekylär avläsning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den isolerade perfusion av organ har varit föremål för en pågående ansträngning bland fysiologer under många decennier 1. Tekniken gör det möjligt att funktionen av organet, utan systemiska påverkan såsom blodtryck, hormoner, eller nerver, som skall studeras. Carl Eduard Loebell anses vara den första att ha beskrivit framgångsrik perfusion av en isolerad njure, 1849 2. Sedan dess har perfusion apparaten genomgått betydande förfining. Frey och Gruber införde en konstgjord lunga för syresättning och pulserande pumpar för kontinuerlig perfusion 2. Medan tidiga forskare studerade främst njurar stora däggdjur-nämligen, grisar 2 och hundar 3 -Den första rapport om användningen av rått njurar, av Weiss et al. , Var en milstolpe i studiet av små däggdjur-organ perfusion 4. Schurek et al. rapporterade att det är nödvändigt att tillsätta däggdjurs erytrocyter till perfusatet om tillräckligt renal tubulärsyresättning skulle uppnås 5. Kritiskt för långtidsförsök var införandet av kontinuerlig dialys av bufferten av samma forskargrupp 6. År 2003, Schweda et al. var de första att rapportera en funktionell mus isolerad perfusion njure (MIPK) 7, senare förfinats av Rahgozar et al. 18 och Lindell et al. 14.

Även tekniskt mer utmanande än råtta isolerad perfusion njure, användningen av MIPK bär fördelen att möjliggöra användningen av ett brett spektrum av genetiskt förändrade möss. Detta dokument presenterar detaljerna i författarnas metod för perfusion isolerade mus njurar under 1 timme. Metoden gör det möjligt att fortlöpande bedömning av njurflöde, kärlmotståndet, hormonfrisättning, gas blodanalys, urinanalys och tillämpningen av droger. Genom att följa förfarandet, kan njurarna behandlas för molekylär och biokemisk analys, fastställas för mikroskopi, ellertransplanteras in i en mottagare mus (fig 1).

Figur 1
Figur 1: översikt över möjliga Input / Output till den isolerade perfusion njure. BGA: gasanalys blod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Denna teknik sannolikt kommer att få allt större uppmärksamhet under de kommande åren, eftersom många innovativa tillämpningar diskuteras med början av långvarig normotermisk njure perfusion före transplantation (med eller utan tillämpning av anti-avvisande eller genomredigering droger) 8, 9, 10 11, bioteknik av hela njurar från decellulariserade byggnadsställningar 12 och tillämpningen av höga doser av fluorescerande färger för multifotonavbildning 13 14.

Ett steg-för-steg-protokollet ges för att låta andra laboratorier för att utföra isolerade mus njure perfusion framgångsrikt. Först sammansättning och beredning av bufferten anges. Därefter operationen beskrivits i detalj och de kritiska steg visas. För det tredje, data presenteras som är representativa för en lyckad beredning: renalt blodflöde, vaskulär resistens, glomerulusfiltration och bråk elektrolyt utsöndring-alla som funktionella mätningar av lönsamhets-och transmissionselektronmikrofotografier av morfologin hos olika nephron segment av perfunderade njurar fast efter en timme av perfusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla som deltar i djurförsök som beskrivs i detta manuskript genomfördes enligt schweizisk lag och godkänts av veterinär administration av kantonen Zürich, Schweiz.

1. Buffert Framställning

  1. Bereda lösningar 1 - 4 och antidiuretiskt hormon (ADH) lösning (tabell 1).
  2. Förbereda dialysbufferten (tabell 1).
    OBS: Detta är den buffert som används som dialysbufferten under perfusionen. Senare kommer erytrocyterna spädas i denna buffert för att bilda den slutliga perfusatet.
  3. beredning erytrocyt.
    1. Späd 250 ml av humant erytrocyt koncentrat (testat material som erhållits från den lokala blodbanken) till 500 ml med dialysbuffert. Centrifugera vid 2000 x g under 8 min. Ta bufferten, var noga med att inte ta bort några erytrocyter. Upprepa 3x.
  4. Förbered albumin (bovint serumalbumin; BSA) buffert.
    1. I 200 ml dialysis buffert, upplösa 44 g BSA med hjälp av en omrörare. Filtrera lösningen med filterpapper.
  5. Förbered perfusatet.
    1. Filtrera erytrocyter från steg 1.3.1 genom filterpapper i BSA-buffert. Fyll upp till en total volym av 800 ml med dialysbuffert.
      OBS: Detta är den slutliga perfusatet. Hematokriten bör nu vara mellan 8 och 12%. Perfusatet kan förvaras i upp till 12 h vid 4 ° C.

2. Initiera Dialys och Syresättning

  1. Slå på vattenbadet som omger större buffertreservoaren, mindre buffertbehållaren, och den fuktiga kammaren (en liten, dubbelväggig kammare bringas till 37 ° C och 100% fuktighet för senare hålla njuren) till 37 ° C (Figur 2) .
  2. Fyll större buffertreservoaren med dialysbufferten och mindre behållare med perfusatet.
  3. Slå på 5% CO2 / 95% O2 gasinflödet till dialysbufferten.
  4. Slå på kontinuerlig dialys av perfusatet mot dialysbuffert. Var noga med att använda låg-flux dialysrör. Gå vidare till steg 3.

figur 2
Figur 2: Schematisk bild av perfusionskretsen. Schema visar de viktigaste komponenterna i perfusionskretsen och inriktning av det buffertflöde. Alla komponenter som omges av mörkblå hålls vid 37 ° C med ett vattenbad / termostat. 1: Dialys buffert av minst 3 gånger volymen av den perfusionsbuffert kontinuerligt bubblas med 95% O2 / 5% CO2. 2: Dialys buffert och perfusionsbuffert kontinuerligt dialyseras mot varandra i ett dialysrör med en rullpump. 3: På grund av denna dialys, är perfusionsbuffert berikad med 9% O2 / 5% CO2 och elektrolytnivåer hålls konstanta landet överUT perfusion. 4: En valspump driver perfusionsbuffert mot njuren. 5: En windkessel bort peristaltiska vågor och fungerar som en bubbelfälla. 6: Tryckgivare (ansluten till 4. (rullpump) för att hålla ständig press samtidigt som fritt växlande flöde). 7: Under perfusionen förblir njuren i en fuktig kammare för 100% luftfuktighet och 37 ° C njure temperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Kirurgisk procedur Del 1 (för ett diagram över alla ligaturer, se figur 3)

Obs: Utför alla ligaturer som använder 5-0 kirurgisk tråd.

  1. Söva en mus genom intraperitoneal injektion (10 pl / g kroppsvikt, 20 mg / ml ketamin och ett mg / ml xylazin upplöst i 0,9% NaCl). Bekräfta tillräckligt djup av AnesthESIA genom att testa för frånvaro av bakre fot reflexer.
  2. Fixera musen i liggande ställning i den fuktiga kammaren. Skydda ögonen med veterinär salva. Placera en 1 ml spruta nedanför ryggraden för att upphöja de lumbala kärlen.
  3. Utför en median laparotomi från blygd krönet till bröstbenet öppningen först huden, så magmusklerna, med en sax.
  4. Ta tarmen och placera den på vänster sida av musen i sidled från buken.
  5. Frigör blåsan från bindväv och utforska både urinledare och urinrör.
  6. Placera en ligatur runt den vänstra urinledaren (ligatur I). Stäng det.
  7. Placera en ligatur runt urinröret (ligatur II). Stäng det.
  8. Placera en "lasso" ligatur runt hela blåsan (ligatur III).
  9. Incisionsfilm blåsan 1 mm.
  10. Cannulate öppningen med 2 cm PE 50 slang.
  11. Nära ligatur III runt slangen.
  12. Skär den vänstra urinledaren och urinröret distalt från ligaturer. den bladder nu knuten till höger urinledaren endast och fritt rörliga.
  13. Rensa bukaortan hos bindväv och fett.
  14. Placera en buken mitten aorta ligatur (ligatur IV).
  15. Placera en ligatur runt aorta under membranet mellan den överlägsna mesenterica och celiaki stammen (ligatur V).
  16. Placera en ligatur runt den överlägsna mesenterica (ligatur VI).
  17. Placera en aorta ligatur direkt under höger och ovanför den vänstra njurartären (ligatur VII).
  18. Placera en ligatur runt kaudalvenen paketet (cava) (ligatur VIII). Gå vidare till steg 4.

Figur 3
Figur 3: Schematisk bild av Ligaturer placerade under kirurgi. Vy över den öppna buken efter laparotomi. Tarmen förflyttas ut åt vänster. L och R indikerar vänstra och högra njuren. Desvarta linjerna visar den del av respektive ligatur. Ligaturer placeras först och sedan stängs, i den ordning som anges i texten. X markerar platsen för snittet för aorta kanyle. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Fyllning av perfusionskretsen

  1. Starta rotationspumpen och fylla slangen med perfusatet. Var noga med att tömma alla luftbubblor från det.
  2. Fyll windkessel enheten till ungefär mid-level med perfusat.
  3. Kalibrera givaren tryck till 0 mm Hg när alla slangar är fylld och flöde är 0. Håll perfusionen nålen vid njurnivå under denna tid.
  4. Håll flödet vid en konstant minimal nivå (0,6 ml / min) och fortsätt till steg 5.

5. Kirurgisk procedur Del 2

  1. Placera en klämma mellan ligatur IV och förgreningen av den vänstra Renal artär.
  2. Gör ett litet snitt i aorta caudal av ligatur IV, var noga med att inte skära rygg väggen.
  3. Dilate öppningen i aorta med en kärldilatator.
  4. Kanylera aortan med en nål (2 cm lång, drog PE 50), driver spets precis till klämman.
  5. Öppna klämman.
  6. Skjut nålspetsen kranialt tills den når föreningspunkten av den högra njuren artären och aorta.
  7. Stäng ligatur VII.
  8. Stäng ligatur IV.
  9. Öppna kistan med en sax genom att dissekera membranet. Med ett enda snitt, separera aorta, hålvenen, hjärta och vegetativa nerver. Med detta steg djuret avlivas via snabb blodtappning under kontinuerlig djup anestesi.
  10. Starta tryckstyrning av perfusion pump. Bibehålla medeltrycket mellan 80 och 100 mmHg.
  11. Nära ligatur V.
  12. Stäng ligatur VI.
  13. Stäng ligatur VIII.
  14. Gratis höger njure från bind tissue och dess inbäddning i adipös kapsel med en sax.
  15. Skär aorta proximalt till ligatur V.
  16. Skär den överlägsna mesenterica distalt till ligatur VI.
  17. Skär njuren bärande fartyg bunt ut, var noga med att inte skära in i kärlen själva.
  18. Skär levern vid anslutningen till njuren. Ta hand för att frigöra njuren, men lämna en liten del av levern vidhäftande till det, så att vena cava hålls öppen av den.
  19. Ta njuren knippet ur musen. Ta bort musen från den fuktiga kammaren.
  20. Placera en "lasso" ligatur runt anslutningen av lever och njure (ligatur IX).
  21. Cannulate vena cava med en venkateter (2 cm PE 50).
  22. Stäng ligatur IX. Venösa utflödet genom venkateter bör omedelbart börja.
  23. Stänga den fuktiga kammaren.

6. Nedströms Analyser

  1. Under den följande timmen, kontinuerligt övervaka blodflödet och intravascular tryck 15. Samla venöst utflöde, som kan användas för analys av till exempel njur reninfrisättning 7. Samla urin för analys av elektrolyt koncentration och glomerulär filtrationshastighet 14. Efter en timme av perfusion, njurar kan snäpp frysas för western blotting eller fastställas för avbildning 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med den metod som beskrivs, kan isolerade mus njurar förbli livskraftig under minst en timme. Vi testade vävnadens viabilitet efter en timme av kontinuerlig perfusion med funktionell (renal blodflöde och vaskulär resistens, blodgasanalys av venös utflöde, glomerulusfiltration, urinbråk Na + och K + utsöndring, och urinosmolaliteten) och morfologiska (transmissionselektron mikroskopi, TEM) metoder inom fyra njurar av vildtyp C57BL / 6-möss. Dessutom var western blottar av apikala markörproteiner av olika tubuli segment utförs jämföra isolerade perfunderade njurar till unperfused njurar av samma djur. I alla experiment var konstant tryck perfusion används, hålla perfusionstryck vid ~ 100 mmHg (Figur 4). I dessa njurar, förblev perfusatet flöde och vaskulär resistens stabil under en tid av 55 minuter vid 15,6 ± 0,4 ml / min * g njurvikt och 35 ± 1,0 mmHg * min / ml, respektive (Figur 4 A). En minskning av perfusatet flöde eller en ökning av kärlmotståndet är en känslig parameter med avseende på minskande vävnadsviabilitet och bör övervakas genom hela perfusionen med omsorg. Blodgas och elektrolyt analys i 100 | j, l prov tagna 60 minuter efter igångsättningen av perfusionen avslöjade renal CO 2 produktion och O 2 konsumtion, när det arteriella inflödet jämfördes med det venösa utflödet (tabell 2). De andra parametrarna är oförändrat mellan artär och ven (tabell 2). Särskild vikt bör läggas vid oförändrat venös kalium release, som en ökning kan ske under vävnadsskada. Glomerulusfiltration bedömde via FITC-inulin clearance 14 tenderat att öka med tiden (Figur 4 B) men denna trend nådde inte signifikans. Fractional utsöndring av natrium och kalium utvärderas efter 55 minuters perfusionökas jämfört med in vivo situation (Figur 4 C). Urinosmolaliteten är inte förhöjd ovanför osmolalitet venösa utflödet efter 55 min av perfusion (Figur 4 D).

För morfologiska studier, var njurar fast efter perfusion i 3% paraformaldehyd och 0,1% glutaraldehyd i dialysbuffert som tidigare beskrivits 17. Renal ultra bedömdes med TEM. Glomeruli och S1 segment av proximala tubuli verkade i stort sett oförändrat efter perfusion (figur 5 A och B). Vissa, men inte alla S2 / S3 segment av proximala tubuli och de tjocka stigande lemmar som inte var nära att kärlknippena var visar tecken på organskada, såsom beskrivits tidigare i råtta isolerade perfuserade njurar 5 (figur 5 C och D). Även vid nära inspektion, gjorde distala veckade tubuli och samla kanaler inte visar tydliga tecken på nekros (Figurerna 5 E, F och G). Sammanfattningsvis morfologiska fynd i mus njurar spegla den situation som konstaterats hos råtta isolerade perfuserade njuren 5.

Western-blottar av apikala markörproteiner av olika nephron segmenten i isolerade perfunderade njurar (snap-frysta efter en timme av perfusion) jämfört med unperfused kontra njurar av samma djur (snap-frysta före uppkomsten av perfusion) visade inte betydande förändringar. Vi studerade NaPi-IIa (i proximala tubuli), NKCC2 (tjocka stigande lemmar), NCC (distala veckade tubuli), och ENAC (anslutning tubuli / upptagning kanaler) (figur 6 A och B).

figur 4
Figur 4: Bedömning av funktionella livskraft njurar perfusion under 55 min. A) </ Strong> Under konstant tryck perfusion, vaskulär resistans och perfusatet flöde förblev stabil under 55 min. De första 15 minuter är uteslutna på grund av den stora variationen alltid sett under denna tid. B) glomerulär filtrationshastighet (FITC-inulin) av fyra njurar bedöms efter 25 och 55 minuter visade svag men inte signifikant ökning över tid. C) Fraktionerad utsöndring av natrium och kalium utvärderas efter 55 min av perfusion. D) Venös plasma och urin osmolalitet efter 55 min av perfusion. n = 4 i alla experiment. Data presenteras som medelvärden ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: transmissionselektronmikroskopi. Representativ morfologi av D ifferent Nephron Segment av perfusion Njurar vid en slutpunkt 1 tim. A) Glomeruli är intakta. Detalj av en podocyte i en glomerulus. B) S1-segmentet av en proximal tubulus. S1 segment är intakta. C) S2 / S3-segmentet av en proximal tubulus. Vissa, men inte alla S2 / S3 segment av proximala tubuli är mycket nekrotisk. Celler verkar svullen och visa stor intracellulär skada. Den rörformiga kontur underhållas av basalmembranet. D) tjocka uppåtstigande extremiteten (TAL). De tals som är långt från kärlknippena visar de första tecknen på hydropisk degeneration. Luminala membranen verkar förtunnas och bräcklig. E) distala tubuli (DCT). DCT är intakta. F) Detalj av de basolaterala infoldings av en DCT-cell. Fenestrated endotel, basalmembran, basolaterala infoldings och mitokondrier är intakta. G) Samla kanal (CD). CD-skivor är intakta.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Western blöt av Apical markörproteiner i isolerade perfuserade njurar Jämfört med Unperfused Njurar från samma djur. A) Western-blottar av njurar perfusion i 1 h och unperfused njurar. NaPi-IIa är representativ för den proximala tubuli. NKCC2 är representativ för den tjocka uppåtgående skänkeln. NCC och NCC fosforylerades vid treonin 53 (pT53 NCC) uteslutande finns i distala tubuli. Alfa- och gamma subenheter av ENAC i sin fulla längd och deras respektive proteolytiskt kluvna produkter visas representant för anslutnings tubuli / samlingskanal. B) Kvantifiering av A) inte visar på betydande skillnader mellan njurar perfusion feller en timme och unperfused njurar. n = 3 i alla experiment. Data presenteras som medelvärden ± SEM och individuella värden visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1: Sammansättning av lösningar och dialysbuffert. Klicka här för att se en större version av denna tabell.

tabell 2
Tabell 2: Blod Gas och Elektrolyt Analys av Arteriell Inflöde och venös Utflöde av perfuserade Mus Njurar 60 min efter starten av Perfusion (n = 4). Data presenteras som medelvärden ±SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musen isolerade perfunderade njuren är ett verktyg för att studera njurfunktionen hos en kontrollerad miljö ex vivo för en timme, att överbrygga klyftan mellan in vivo experiment i intakta djur, som kan vara bristfällig av effekterna av ett stort antal systemrelaterade faktorer, och in vitro-experiment isolerade nephron segment eller odlade celler, som med nödvändighet försummar effekten av intakt organstruktur på funktion. Det finns, till författarnas kännedom finns ingen alternativ teknik som för att utföra denna specifika uppgift. Biokemiska studier på njurvävnad, emellertid kan utföras på ett mycket enklare sätt med användning av njur skivor 17. Medan tekniken presenteras för närvarande används främst för att studera njur fysiologi, många nya tillämpningar diskuteras. Till exempel kan den användas för njur bioteknik under perfusion decellularisering och recellularization 12. Dessutom långvarig normotermisk perfusion av njurar tidigare transplantation, med administrering av höga doser av anti avslag eller genom redigering droger i perfusatet, studeras; även i kliniska situationer 8, 9, 10, 11. Musen isolerade perfunderade njuren är ett utmärkt verktyg som kan användas för dessa applikationer, i synnerhet för att belysa betydelsen av enskilda gener med knockout-modeller.

Tre steg är avgörande för ett lyckat experiment. Detta dokument ger intresserade labb med möjlighet att reproducera förfarandet. Först måste bufferten vara beredd på ett sådant sätt att njuren tar emot de flesta av de näringsämnen som behövs för långvarig överleva under reproducerbara förhållanden. En balans måste hittas mellan fullt kontrollerade förhållanden (syntetisk buffert) och en infödd perfusion tillstånd (helblod). Därför har albumin och däggdjurs erytrocyter till en hematokrit av 10% som skall ingå. Detta hematokrit representerar i författarnas erfarenhet, den bästa kompromissen mellan tillräcklig tfråga syresättning och låg buffert viskositet (ökande hematokrit minskar flödet dramatiskt under tryck konstant perfusion (jämför värden som presenteras i detta dokument till värden i njurar perfunderade utan erytrocyter 18)). Kvalitet och färskhet av erytrocyter är kritisk. Under tvättningsstegen, erytrocyter måste hanteras med omsorg för att undvika hemolys. Bufferten måste beredas på dagen för experimentet. För det andra måste operationen utföras av en utbildad kirurg inom kortast möjliga tid. Kirurgen måste utföra 6 ligaturer runt de viktigaste fartyg som förbinder njuren till resten av kroppen, samtidigt som djurets blodförlust till ett minimum. För bästa resultat bör kirurgiska ingrepp ske inom 30 minuter. Om det genomsnittliga arteriella blodtrycket hos djuret sjunker under långvarig operation eller på grund av anestesi, under 60 mmHg, njurperfusion kommer redan att vara minimal och vävnaden kommer att vara benägnatill nekros. För att utesluta detta, kan den vänstra njuren tas efter operationen, när perfusion av den högra njuren redan har börjat, och användes som en obehandlad kontroll. För det tredje, under tiden för perfusion fungerar korrekt perfusion apparaten, som består av en vanlig liten djur perfusionskretsen, måste säkerställas. Medan datorn utför perfusionen av sig själv, är mänsklig övervakning behövs, till exempel för att kontrollera om det finns bubblor i perfusionskretsen.

De representativa data som gör det möjligt för bedömning av njur viabilitet efter 1 h av ex vivo perfusion och jämförelsen av den tekniska framgången för någon exekvering av denna metod för att det tillvägagångssätt som beskrivs häri. Under åtminstone en timme, renalt blodflöde, vaskulär resistens, blodgaser i venösa utflödet och glomerulär filtrationshastighet bör förbli oförändrade.

Det finns vissa begränsningar för tekniken, som man måste hålla i minnet. Även en kiDney som utgår från de mest framgångsrika operation kan bara förbli livskraftig under en begränsad tid. Författarna fann en timme för att vara den bästa tiden punkt, vid vilken för att stoppa perfusion. Dessutom, medan perfusion av isolerade njuren möjliggör för studien av den isolerade helt organ på djupet, är det svårt att skilja specifika effekter på en celltyp. Njurar fast efter en timme kan visa fel i S3 segment av proximala tubuli och tjocka uppåtstigande extremiteten celler, medan glomeruli, S1 segment, DCT, och CD-skivor bör förbli intakt. Obligatorisk användning av erytrocyter, särskilt från människor, är också kopplat till potentiella risker (t.ex. infektioner) för försöks.

Sammanfattningsvis är den mus isolerad perfunderade njuren en användbar teknik med vilken att studera helt organ ex vivo. Precis som alla teknik, har det vissa fördelar och begränsningar. Författarna menar att både de många nya program som uppstår och detta protokoll kan ge sufficient momentum för andra laboratorier för att återskapa detta arbete.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81, (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123, (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7, (1), 1-11 (1975).
  4. Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196, (5), 1115-1118 (1959).
  5. Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53, (2), 145-155 (1985).
  6. Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16, (3), 377-384 (1979).
  7. Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284, (4), F770-F777 (2003).
  8. Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360, (1), 7-19 (2009).
  9. Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13, (5), 1246-1252 (2013).
  10. Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38, (4), 352-361 (2014).
  11. Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
  12. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19, (5), 646-651 (2013).
  13. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  14. Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
  15. Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100, (4), 556-563 (2007).
  16. Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. (2016).
  17. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8, (10), 1227-1236 (2015).
  18. Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9, (5), 288-296 (2004).
Musen Isolerad perfusion njure Technique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter