Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. tamponlar ve cerrahi teknik ayrıntılı olarak tarif edilmiştir.

Abstract

Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. Bu izole organ ve perfüzyon böbrek biyomühendislik için Decellularization veya anti-reddi veya asal böbrek yüksek dozlarda genom düzenleme ilaç uygulaması da dahil olmak üzere gelecekte mümkün olabilir pek çok yenilikçi uygulamalar için fizyolojisi eğitimi için bir ön koşuldur nakli için. perfüzyon süre boyunca, böbrek, böbrek fonksiyonu değerlendirilebilir, manipüle ve çeşitli ilaç tatbik edilebilir. İşlemden sonra, böbrek nakledilen veya moleküler biyoloji, biyokimya analizi, ya da mikroskopi için işlenir.

Bu yazıda perfüzat ve fare böbrekler ex vivo perfüzyon için gerekli cerrahi teknik anlatılmaktadır. perfüzyon aparatı detayları verilen ve veri v gösteren sunulmuşturböbreğin hazırlama iability: morfolojik okumalar ve moleküler okuma farklı nefron bölümlerinin taşıyıcı proteinlerin Western blotlar farklı nefron bölümlerinin işlevsel transmisyon elektron mikroskobuyla böbrek kan akışı, vasküler direnç ve idrar verileri.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Organların izole perfüzyon onlarca yıl 1 fizyolog arasında sürekli bir çaba konusu olmuştur. tekniği, kan basıncı, hormonlar, ya da sinirler gibi sistemik etkileri olmadan, organın işlevini sağlayan, çalışılacak. Carl Eduard Loebell 1849 2, izole edilmiş böbrek başarıyla perfüzyon tarif eden ilk olarak kabul edilir. O zamandan beri, perfüzyon aparatı önemli arıtma uğramıştır. Frey ve Gruber sürekli perfüzyon 2 oksijenasyon ve pulsatil pompalar için yapay akciğer tanıttı. Erken araştırmacılar özellikle büyük memeliler-yani, domuzlar 2 ve köpekler 3 sıçan böbreklerinde kullanımı -the ilk rapor, Weiss ve ark ait böbrekler okudu iken. Küçük memeli organ perfüzyon 4 çalışmada bir dönüm noktası oldu. Schurek ve ark. Yeterli böbrek tübüler eğer perfüzat memeli eritrosit ekleme gerekliliğini bildirdioksijen 5 elde edilebilir amaçlanmıştır. Uzun vadeli deneyler için kritik Aynı araştırma grubu 6 ile tampon sürekli diyaliz tanıtım oldu. 2003 yılında, Schweda ve ark. Daha sonra Rahgozar ve arkadaşları tarafından rafine fonksiyonel fare izole perfüze böbrek (MIPK) 7, rapor için ilk idi. 18 ve Lindell ve diğ. 14.

perfüze böbrek izole sıçan daha teknik olarak daha zor olsa da, MIPK kullanımı genetik olarak değiştirilmiş farelerin geniş bir yelpazede kullanımını sağlayan avantajını taşımaktadır. Bu kağıt 1 saat boyunca izole fare böbrekleri perfüze için yazarların yöntemin ayrıntılarını sunar. yöntem böbrek akış hızı, damar direnci, hormon salınımı, kan gazı analizi, idrar analizi ve ilaçların uygulama sürekli değerlendirme sağlar. prosedür takip edilerek, böbrekler, moleküler ve biyokimyasal analiz için işlenebilir mikroskopi için sabit ya daBir alıcı fare içine nakledilen (Şekil 1).

Şekil 1
Şekil 1: İzole perfüze Böbrek Olası Giriş / Çıkış bakış. BGA: Kan gazı analizi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Birçok yenilikçi uygulamalar ile (veya anti-ret veya genom düzenleme ilaçların uygulama olmadan) 8, 9 nakilden önce uzun süreli normotermik böbrek perfüzyon şafak ile tartışılmaktadır olarak bu tekniğin büyük olasılıkla, 10, önümüzdeki yıllarda artan ilgi alacaksınız , 11, hücresizleştirilmiş iskeleler 12 gelen bütün böbreklerin Bioengineering ve multiphoton görüntüleme 13 floresan boyalar yüksek dozlarda uygulanması 14 sırasında belirli genlerin rolünü araştırmak için ideal bir modeldir.

Bir adım-adım protokolü diğer laboratuarlar başarıyla izole fare böbrek perfüzyon gerçekleştirmek için izin verilir. İlk olarak, bileşim, ve tampon hazırlanması belirtilir. Daha sonra, cerrahi ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve kritik adımlar gösterilmektedir. Üçüncü olarak, veri başarılı bir hazırlık temsil ettiğini sunulmuştur: renal kan akımı, damar direnci, glomerüler filtrasyon hızı ve fraksiyonel elektrolit atılımı hepsi perfüze böbreklerin farklı nefron segmentlerinden morfolojisi canlılık-ve transmisyon elektron mikroskobuyla olarak fonksiyonel ölçümler perfüzyon 1 saat sonra sabit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yazıda anlatılan hayvanları da içeren tüm işlemler İsviçre hukukuna göre ve Zürih, İsviçre Kantonu veteriner idaresi tarafından onaylanmış gerçekleştirilmiştir bulundu.

1. Tampon Hazırlama

  1. 4 ve antidiüretik hormon (ADH) çözeltisi (Tablo 1) - çözümleri 1 hazırlayın.
  2. Diyaliz tamponu (Tablo 1) hazırlayın.
    NOT: Bu perfüzyon sırasında diyaliz tamponu olarak kullanılmıştır tampondur. Daha sonra, eritrositler son perfüzat oluşturmak için bu tampon içinde seyreltilir.
  3. Eritrosit hazırlanması.
    1. insan eritrosit konsantresi diyaliz tamponu ile 500 ml (yerel kan bankasından elde edilen test materyal) 250 ml sulandırmak. 8 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüjleyin. herhangi eritrositler kaldırmak için dikkatli olmak, tamponu çıkarın. 3x tekrarlayın.
  4. tampon; albümini (BSA sığır serum albümini) hazırlayın.
    1. dialysi, 200 mls tamponu, bir karıştırma çubuğu kullanılarak BSA 44 g çözülür. filtre kağıdı ile çözüm Filtre.
  5. perfüzat hazırlayın.
    1. BSA tampon içine filtre kağıdı ile adım 1.3.1 den eritrositler Filtre. Diyaliz tamponu ile 800 ml arasında bir toplam hacme kadar doldurun.
      NOT: Bu son perfüzyon olduğunu. hematokrit Şimdi 8 ile% 12 arasında olmalıdır. Perfüzat 12 saat kadar 4 ° C'de saklanabilir.

2. başlatılması Diyaliz ve Oksijenizasyon

  1. Daha büyük bir tampon rezervuar, daha küçük bir tampon rezervuar ve nemli bir odada 37 ° C (küçük, çift cidarlı sonra böbrek tutmak için 37 ° C ve% 100 bağıl neme getirdi) çevreleyen su banyosu üzerinde çevirin (Şekil 2) .
  2. Diyaliz tamponu ile daha büyük bir tampon rezervuar ve perfüzat ile birlikte küçük bir doldurun.
  3. Diyaliz tamponu% 5 CO 2 /% 95 O 2 gaz girişi çevirin.
  4. diyaliz tamponuna karşı perfüzat sürekli diyaliz açın. Düşük akı diyaliz tüp kullanmak için özen gösterin. Adım 3'e geçin.

şekil 2
Şekil 2: Perfüzyon Devre şematik çizimi. Şema perfüzyon devresinin ana bileşenleri ve tampon akış yönünü gösterir. lacivert çevrili tüm bileşenler bir su banyosu / termostat ile 37 ° C'de tutulur. 1: perfüzyon tamponu en az 3 kez hacmi Diyaliz tamponu sürekli olarak% 95 O 2/5% CO2 ile köpürtülür. 2: Diyaliz tamponu ve perfüzyon tampon maddesi sürekli bir silindir pompa ile bir diyaliz tüpü içinde birbirlerine karşı diyaliz edilir. 3: Bu diyalize perfüzyon tampon maddesi% 9 O ile zenginleştirilmiştir nedeniyle 2/5% CO2 ve elektrolit seviyeleri tutulur, sabit throughout perfüzyon. 4: Bir silindir pompa böbrek doğru perfüzyon tampon sevkeder. 5: Bir windkessel peristaltik dalgalar kaldırır ve bir baloncuk kapanı gibi davranır. 6: Basınç detektörler (serbest dalgalı akış izin verirken 4. (silindir pompasına bağlı) sürekli baskı tutmak için). 7: perfüzyon boyunca, böbrek% 100 hava nemi ve 37 ° C, böbrek sıcaklığında bir nem odasında tutulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Cerrahi Prosedür Bölüm 1 (tüm bitişik harfler bir diyagram için, bakınız Şekil 3)

Not: 5-0 cerrahi iplik kullanarak tüm bitişik harfler gerçekleştirin.

  1. periton içi enjeksiyon ile bir fare (% 0.9 NaCI içinde çözülmüştür vücut ağırlığı, 20 mg / ml ketamin ve 1 mg / ml ksilazin 10 ul / g) anestezisi. Analg yeterli derinliği onaylayınArka ayak reflekslerin yokluğu test ederek esia.
  2. nemli odasında yatar pozisyonda fare sabitleyin. Veteriner merhem ile gözleri koruyun. lomber damarları yükseltmek için omurga altına 1 ml şırınga yerleştirin.
  3. makasla ilk sternum açılış cilt, daha sonra karın kasları, kasık tepesinin bir medyan laparotomi gerçekleştirin.
  4. bağırsak çıkarın ve karın fare yanal sol tarafına yerleştirin.
  5. bağ dokusu mesaneyi boşaltmak ve üreterler ve üretrayı hem de keşfetmek.
  6. Sol üreter (bağ I) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Kapat onu.
  7. üretra (bağ II) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Kapat onu.
  8. Bütün mesane (bağ III) etrafında bir "kement" bitişik harfleri yerleştirin.
  9. Mesaneyi 1 mm İnsizyon.
  10. 2 cm PE 50 tüpü ile açıklığa kanüle.
  11. boru etrafında yakın bağ III.
  12. bitişik harfler sol üreter ve üretra distalinde kesti. bladder şimdi sadece ve serbestçe hareket sağ üreter takılır.
  13. Bağ dokusu ve yağ abdominal aorta temizleyin.
  14. abdominal orta aort bitişik harfleri (bağ IV) yerleştirin.
  15. superior mezenterik arter ve çölyak gövde (bağ V) arasındaki diyafram altında aort etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin.
  16. superior mezenterik arter (bağ VI) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin.
  17. doğrudan aşağıda sağda ve sol renal arter (bağ VII) Yukarıdaki aort bitişik harfleri yerleştirin.
  18. kaudal ven paketi (cava) (bağ VIII) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Adım 4 ile devam edin.

Şekil 3,
Şekil 3: Cerrahi sırasında yerleştirilen Bitişik Harfler şematik çizimi. Laparotomi sonrası açık karın görünümü. bağırsak sola dışarı taşınır. L ve R, sol ve sağ böbrek göstermektedir.siyah çizgiler ilgili ligature alanını gösterir. Harfler önce yerleştirilmiş ve daha sonra metin içinde verilen sırada, kapatılır. X aort kanülasyon için kesi yerini işaretler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Perfüzyon Devre 4. Hazırlama

  1. Döner Pompayı başlatın ve perfüzat ile tüp doldurun. ondan tüm hava kabarcıklarını boşaltmak için özen gösterin.
  2. perfüzat ile birlikte yaklaşık olarak orta-seviyeye windkessel cihazı doldurun.
  3. Tüm boru dolu ve akış bu süre içinde böbrek düzeyinde perfüzyon iğne tutun 0'dır olduğunda 0 mm Hg basınç dönüştürücü ayarlayın.
  4. sabit asgari düzeyde (0.6 ml / dk) akışını tutmak ve Adım 5 geçin.

5. Cerrahi Prosedür Bölüm 2

  1. ligature IV ve sol Rena dallanma arasında bir kelepçe yerleştirinl arter.
  2. dorsal duvarı kesme özen, bağ IV aort kaudal küçük bir kesi yapmak.
  3. Bir gemi dilatör ile aort açıklığı dilate.
  4. Bir iğne ile aort cannulate sadece kelepçe ucu iterek, (2 cm uzunluğunda, PE 50 çekti).
  5. kelepçesini açın.
  6. Doğru böbrek arter ve aort kavşak ulaşıncaya kadar iğne cranially ucu itin.
  7. Kapat bağ VII.
  8. Kapat bağ IV.
  9. diyafram diseksiyon ile makas ile göğüs açın. Tek bir kesim ile, aort, vena kava, kalp ve vejetatif sinir ayırın. Bu adımla birlikte, hayvan sürekli derin anestezi altında hızlı kan kaybından yoluyla kurban.
  10. perfüzyon pompa basınç kontrolü başlatın. 80 ve 100 mmHg arasında ortalama basıncı koruyun.
  11. Yakın bağ V.
  12. Kapat bağ VI.
  13. Kapat bağ VIII.
  14. Bağ Tissu'dan ücretsiz sağ böbrekE ve makasla adipoz kapsül içine gömme.
  15. V. ligature için proksimal aort Cut
  16. VI ligature için distal superior mezenterik arter kesin.
  17. gemiler kendileri oyulmuş değil özen, böbrek destekleyici damar demeti kesin.
  18. böbrek bağlantısında karaciğer kesin. böbrek serbest özen gösterin, fakat vena kava onun tarafından açık tutulur, böylece ona karaciğer yapışık küçük bir kısmını bırakın.
  19. fare dışarı böbrek desteyi alıp. Nemli odasından fareyi çıkarın.
  20. karaciğer ve böbrek (bağ IX) bağlantısı etrafında bir "kement" bitişik harfleri yerleştirin.
  21. venöz hat (2 cm PE 50) ile vena kava cannulate.
  22. Kapat bağ IX. venöz hattı üzerinden venöz çıkış derhal başlamalıdır.
  23. nemli bir odada kapatın.

6. Alt Analizler

  1. Aşağıdaki saat boyunca, sürekli kan akışını ve intravascul izlemekar basıncı 15. Örneğin analizi için kullanılabilir kan çıkışı, renal renin salınımını 7 toplayın. Elektrolit konsantrasyonu ve glomerüler filtrasyon hızı 14 analiz için idrar toplayın. Perfüzyon 1 saat sonra, böbrekler Western blot ek dondurulabilir veya görüntüleme için sabit 16 yaklaşır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

yöntem tarif ile, izole edilmiş fare böbrekleri, en az 1 saat boyunca canlı kalabilir. Fonksiyonel (böbrek kan akımı ve damar direnci, venöz çıkış, glomerüler filtrasyon hızı, idrar fraksiyonel Na + ve K + atılımını kan gazı analizi ve idrar osmolalitesi) ve morfolojik (iletim elektron sürekli perfüzyon 1 saat sonra doku canlılığını test vahşi tip C57BL / 6 fareden oluşan dört böbreklerde mikroskobu, TEM) yöntemleri. Ayrıca, farklı tübül bölümlerinin apikal markör proteinlerin Western lekeleriyle, aynı hayvan unperfused böbreklere izole perfüze böbrekler karşılaştırma yapıldı. Tüm deneylerde, sabit basınçlı perfüzyon ~ 100 mmHg (Şekil 4) perfüzyon basıncı muhafaza kullanılmıştır. Bu böbreklerde perfüzat akışı ve vasküler direnç, böbrek ağırlığı ve 3 15.6 ± 0.4 ml / dak x g'de 55 dakika bir süre boyunca stabil kalmıştır5 ± 1.0 mm Hg * dak / ml idi (Şekil 4A). Perfüzat akışı veya vasküler dirençte bir artış bir azalma, doku canlılığını azaltılması ve bakım ile perfüzyon boyunca izlenmelidir açısından hassas bir parametredir. Arteriyel girişi venöz çıkış (Tablo 2) ile karşılaştırıldığında ne zaman kan gazı ve perfüzyon başladıktan sonra 60 dakika alınan 100 ul örneklerinde elektrolit analizleri, böbrek CO 2 üretimi ve O 2 tüketimi saptandı. Diğer parametreler arter ve ven (Tablo 2) ile aynı kaldı. bir artış doku hasarı sırasında oluşabilecek özel vurgu değiştirilmemiş venöz potasyum salınımı konulmalıdır. FITC inulin temizlenmesi 14 üzerinden değerlendirilen Glomerüler filtrasyon hızı, zamanla (Şekil 4 B) artış eğilimi ama bu eğilim anlamlı değildi. sodyum ve potasyum fraksiyonel atılımı perfüzyon 55 dakika sonra değerlendirildiin vivo durumu (Şekil 4 ° C) ile karşılaştırıldığında artar. İdrar osmolalitesi perfüzyon 55 dakika (Şekil 4 D) sonra venöz çıkışı osmolalitesi yüksekte değildir.

Daha önce 17 açıklandığı gibi morfolojik çalışmalar için, böbrekler diyaliz tamponu içinde% 3 paraformaldehid perfüzyon ve% 0.1 glutaraldehit sonra tespit edildi. Böbrek ultrastrüktür TEM ile değerlendirildi. Proksimal tübüller glomeruli ve S1 segmentleri perfüzyon (Şekil 5 A ve B) uygulanmasından sonra büyük ölçüde değişmeden ortaya çıktı. Bazı ama damar demetleri yakın değildi proksimal tübüllerin tüm S2 / S3 segmentleri ve kalın artan bacaklarda sıçan izole perfüze böbreklerde 5 daha önce açıklandığı gibi organ hasarı belirtileri gösteren edildi değil (Şekil 5 C ve D). Hatta yakın incelenmesi üzerine, distal kıvrımlı tübüller ve toplama kanalları (nekroz belirgin belirtileri yoktuŞekil 5, E, F, ve G). Sonuç olarak, fare böbrek morfolojik bulgular sıçan izole perfüze böbrek 5. bulundu durumun ayna.

izole edilmiş perfüze böbrek farklı nefron bölümlerinin apikal markör proteinlerin Western blotlar aynı hayvanın unperfused karşı böbrekler göre (perfüzyon 1 saat sonra hızlı bir şekilde dondurulup) önemli bir değişiklik göstermemiştir (perfüzyonun başlamasından önce hızlı bir şekilde dondurulup). Biz (Şekil 6 A ve B) (kanalları toplama / tübüller bağlantı) (proksimal tübüllerde bulunur) NaPi-IIa, NKCC2 (kalın artan bacaklarda), KKK (distal kıvrımlı tübüller) ve ENAC okudu.

Şekil 4,
Şekil 4: 55 dakika perfüze Böbrekler Fonksiyonel Canlılığına değerlendirilmesi. A) <sabit basınç perfüzyon, vasküler direnç ve perfüzat akışı sırasında / strong> 55 dakika boyunca sabit kalmıştır. İlk 15 dakika nedeniyle her zaman bu süre içinde görülen yüksek değişkenliğe hariç tutulmuştur. B) Glomerüler filtrasyon hızı 25 ve 55 dakika sonra değerlendirilen dört böbrekler (FITC inulin) zamanla hafif ama önemli bir artış göstermiştir. Sodyum ve potasyum C) Kesirli atılım perfüzyon 55 dakika sonra değerlendirildi. Perfüzyon 55 dakika sonra D) Venöz plazma ve idrar osmolalitesi. n = 4, tüm deneylerde. Veri ± SEM olarak sunulmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: Transmisyon Elektron Mikroskobu. D Temsilcisi Morfoloji 1 saat bir sonu Point Perfüze Böbreklerin ifferent Nefron Bölümleri. A) glomerulusların sağlam. Bir glomerulus bir Podosit detayı. Bir proksimal tübül B) S1 segmenti. S1 bölümleri sağlam. Bir proksimal tübül C) S2 / S3 segmenti. Bazı ancak proksimal tübüllerin tüm S2 / S3 segmentleri yüksek nekrotik bulunmaktadır. Hücreler şişmiş görünür ve büyük hücre içi hasarı göstermektedir. boru şeklindeki anahat sadece bazal membran tarafından yapılmaktadır. D) Kalın artan ekstremite (TAL). damar demetleri uzak olanlar tals hidropik dejenerasyon ilk belirtileri gösteriyor. Lüminal membranlar inceltilmiş ve kırılgan görünür. E) Distal kıvrık tübül (DCT). DCTler sağlam. F) Bir DCT hücrenin bazolateral infoldings Detay. Fenestralı endotel, bazal membran, bazolateral infoldings ve mitokondri sağlamdır. G) kanal (CD Toplama). CD'ler sağlam.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: aynı hayvanların Unperfused böbreklere göre izole edilmiş serpilmiş Böbrekler Apikal Marker proteinlerin Batı lekeleri. A) böbreklerin Western blot 1 saat ve unperfused böbrekler için perfüze. NaPi-IIa proksimal tübül için temsilcisidir. NKCC2 kalın artan uzuv için temsilcisidir. NCC ve NCC sadece uzak tübülde bulunan treonin 53 (pT53 KKK) fosforile. tam uzunlukta ENaC'nın ve kendi proteolitik bölünmüş ürünlerin alfa ve gama alt birimleri bağlayan borucuk / toplama kanalı için temsilcisine gösterilmiştir. B A) Niceleme) böbrekler perfüze f arasında önemli farklılıklar ortaya koymamıştır1 saat ve unperfused böbrekler veya. n = 3, tüm deneylerde. Veriler ortalama ± SEM ve bireysel değerler gösterilmektedir olarak sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tablo 1
Tablo 1: Çözümler ve Diyaliz Tampon Bileşimi. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 2
Tablo 2: Kan Gazı ve Arter Girişi Elektrolit Analiz ve Perfüzyon Onset sonra Perfüze Fare Böbrekler 60 dakika venöz Çıkışlar (n = 4). ± anlamına gibi veriler sunulmuşturSEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Perfüze böbrek izole fare çok sayıda sistemik faktörlerin etkisi ile kusurlu olabilir sağlam hayvanlarda in vivo deneyler arasındaki köprü, 1 saat boyunca kontrollü bir ortamda ex vivo böbrek fonksiyonunu incelemek için bir araçtır ve in vitro deneylerde izole nefron segmentleri veya mutlaka fonksiyonu bozulmamış organ yapısı etkisini ihmal kültürlü hücreler. , Yazarların bilgisine, hiçbir alternatif bir teknik bu özel görevi vardır gerçekleştirmek için bir. Böbrek dokusu üzerinde biyokimyasal çalışmalar, böbrek dilimleri 17 ile çok daha basit bir şekilde gerçekleştirilebilir. sunulan teknik şu anda böbrek fizyolojisi incelemek için çoğunlukla kullanılırken, birçok yeni uygulamalar tartışılmaktadır. Örneğin, perfüzyon Decellularization ve recellularization 12 boyunca böbrek biyomühendislik için kullanılabilir. Buna ek olarak, önceki böbreklerin uzun süreli normotermik perfüzyon tr içinansplantation anti-ret veya genom düzenleme perfüzat içine uyuşturucu, çalışılmaktadır yüksek dozlarda verilmesi ile; Hatta klinik 8, 9, 10, 11'de. Fare izole perfüze böbrek özellikle nakavt modelleri ile bireysel genlerin rolü aydınlatmak için, bu uygulamalar için kullanılabilecek mükemmel bir araçtır.

Üç adımda başarılı bir deney için kritik öneme sahiptir. Bu yazıda prosedürünü yeniden oluşturma araçları ile ilgilenen laboratuarları sağlar. İlk olarak, bir tampon, böbrek tekrarlanabilir koşullar altında uzun süreli canlılık için gerekli besinlerin en alır bir şekilde hazırlanması gerekmektedir. Bir denge tamamen kontrollü koşullar (sentetik tampon) ve bir yerli perfüzyon koşulu (tam kan) arasında bulunması gerekir. Bu nedenle,% 10 Hematokrit albümin ve memeli eritrositler dahil edilmesi gerekir. Bu hematokrit, yazarların deneyim, yeterli t arasındaki en iyi dengeyi temsilSorun oksijenlenme ve düşük tampon viskozitesi (hematokrit (eritrositler 18 olmadan perfüze böbreklerde değerlere bu yazıda sunulan değerleri karşılaştırmak basınç sabit perfüzyon sırasında dramatik akış azalır artan)). Eritrositlerin kalitesi ve tazeliği önemlidir. yıkama adımları sırasında, eritrositler hemoliz önlemek için dikkatle ele alınması gerekir. Tampon Deney gününde taze hazırlanmış olması gerekir. İkinci olarak, ameliyat mümkün olan en kısa süre içinde eğitimli cerrah tarafından yapılması gerekmektedir. Cerrah minimuma hayvanın kan kaybının tutarken, vücudun geri kalanına böbrek bağlayan ana damarların etrafında 6 Ligatürleri yerine getirmesi gerekir. En iyi sonuçlar için, cerrahi girişimler 30 dakika içinde tamamlanması gerekir. hayvanın ortalama arteriyel kan basıncı anestezi uzun süre cerrahi sırasında veya görevden dolayı, düşerse, 60 mmHg altında, böbrek perfüzyon zaten az olacak ve doku eğilimli olacaknekrozu. Bu dışlamak için, sol böbrek sağ böbreğin perfüzyon çoktan başlamış ve tedavi edilmemiş bir kontrol olarak kullanılan zaman, ameliyattan sonra alınabilir. Üçüncü olarak, standart bir küçük hayvan perfüzyon devresinin aşağıdakilerden oluşan perfüzyon perfüzyon cihazına doğru işleyişi, bir süre boyunca temin edilmesi gerekmektedir. Bilgisayar başına perfüzyon gerçekleştirirken örnek perfüzyon devresindeki kabarcıkları kontrol etmek için, insan denetim gereklidir.

Sağlanan temsili veriler 1 ex vivo perfüzyon saat ve burada tarif edilen yaklaşıma bu yöntemin herhangi bir icra teknik başarısının karşılaştırılması sonrasında böbrek canlılığının değerlendirilmesi için izin verir. en az 1 saat, renal kan akışı, damar direnci sırasında venöz çıkış ve glomerüler filtrasyon hızı, kan gazları stabil kalmalıdır.

tek akılda tutmak zorunda tekniği, bazı sınırlamalar vardır. Hatta bir Kien başarılı ameliyattan çıkan dney can yalnızca sınırlı bir süre için geçerli kalır. Yazarlar perfüzyon durdurmak için en iyi zaman noktası olması 1 saat bulundu. izole böbrek perfüzyon derinlemesine izole bütün organın çalışma için izin verirken Buna ek olarak, bir hücre tipine spesifik etkileri ayırt etmek zordur. glomerül, S1 kesimleri, DCTler ve CD'ler bozulmadan kalması gerekirken 1 saat sonra sabit Böbrekler, proksimal tübüllerde ve kalın artan uzuv hücrelerinin S3 segmentlerinde kusurları gösterebilir. Özellikle insanlarda eritrosit zorunlu kullanımı, aynı zamanda deneyi için potansiyel riskleri (örneğin, enfeksiyonlar) ile bağlantılıdır.

Özetle, fare izole perfüze böbrek bütün organı ex vivo incelemek için yararlı bir tekniktir. herhangi bir teknik gibi, belirli avantajları ve sakıncaları vardır. Yazarlar hem manifoldu yeni uygulamalar şu anda ortaya çıkan ve bu protokol sufficien sağlayabilir inanıyoruzdiğer laboratuarlar için t ivme bu çabayı çoğaltmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81, (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123, (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7, (1), 1-11 (1975).
  4. Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196, (5), 1115-1118 (1959).
  5. Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53, (2), 145-155 (1985).
  6. Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16, (3), 377-384 (1979).
  7. Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284, (4), F770-F777 (2003).
  8. Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360, (1), 7-19 (2009).
  9. Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13, (5), 1246-1252 (2013).
  10. Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38, (4), 352-361 (2014).
  11. Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
  12. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19, (5), 646-651 (2013).
  13. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  14. Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
  15. Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100, (4), 556-563 (2007).
  16. Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. (2016).
  17. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8, (10), 1227-1236 (2015).
  18. Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9, (5), 288-296 (2004).
Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter