Abstract
انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) على تفاصيل تنظيم الخلوية والتركيب الدقيق. ومع ذلك، وتحليل تيم من السكان الخلية نادرة، وخاصة الخلايا في تعليق مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يزال محدودا نظرا لاشتراط وجود عدد الخلايا عالية أثناء إعداد العينات. هناك عدد قليل من cytospin أو أحادي الطبقة نهج لتحليل تيم من عينات نادرة، ولكن هذه الأساليب تفشل في الحصول على بيانات كمية كبيرة من عدد محدود من الخلايا. هنا، يتم وصف نهج بديل ورواية لإعداد العينات في الدراسات تيم لسكان الخلية النادرة التي تمكن من تحليل الكمي.
عدد الخلايا منخفضة نسبيا، أي 10000 HSCs، وقد استخدمت بنجاح لتحليل تيم مقارنة ملايين الخلايا التي تستخدم عادة لدراسات تيم. على وجه الخصوص، تم تنفيذ ايفانز تلطيخ الأزرق بعد امتصاص العرق، غلوتارالدهيد (PFA-GA) تثبيت لتصور ااا خلية صغيرةالسماح، الأمر الذي سهل مبنية الاغاروز. وقد لوحظت مجموعات من الخلايا عديدة في قطاعات رقيقة جدا. كانت الخلايا التشكل الحفاظ عليها بشكل جيد، وكانت التفاصيل فائقة الهيكلية للالميتوكوندريا جولجي المعقدة وعدة مرئية. يسمح هذا البروتوكول كفاءة، وسهلة وقابلة للتكرار تحضير عينات من عدد الخلايا منخفضة، ويمكن استخدامها لتحليل تيم النوعي والكمي على السكان الخلية نادرة من العينات البيولوجية محدودة.
Introduction
وقد تم كشف النقاب عن تفاصيل فائقة الهيكلية وشبه العضيم بصفة أساسية من الخلايا بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (تيم) دراسات من الأنسجة أو الكريات خلية 1،2. القطع الصلبة من أنسجة يمكن استخدامها بسهولة للدراسات المجهر الإلكتروني. ومع ذلك، تيم يحلل 1،3 على الخلايا في تعليق تظل صعبة وتتطلب أعداد الخلايا عالية، أي الملايين من الخلايا. وبسبب هذا، تحليلات فائقة الهيكلية للسكان الخلية نادر في التعليق، وعلى سبيل المثال، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يتم تقييمها بسهولة. فشلت محاولات متعددة لتحليل تيم من العينات النادرة باستخدام cytospin أو أحادي الطبقة النهج للحصول على بيانات كمية كبير من عدد محدود من الخلايا. وهكذا، فإن اشتراط وجود عدد الخلايا عالية يحد من استخدام هذه الأداة القوية لفهم تفاصيل التركيبية التحت خلوية من السكان الخلية نادرة.
والقيد الرئيسي للدراسات تيم مع عدد محدود من الخلاياالصورة في تعليق هو توطين الخلايا للمعالجة، وبالتالي، لا تزال الدراسات تيم من خلايا محدودة مع بخاصة الأحجام الصغيرة الصعبة. وقد تم اعتماد عدة أساليب بديلة لمواجهة هذا القيد: جيش صرب البوسنة / bisacrylamide (BSA-BA) البلمرة بوساطة من تعليق خلية، وتلطيخ الخلايا مع صبغة لجعلها مرئية على دعم رقيقة بما coverslips، وتيم يحلل من الاستعدادات cytospin 4-6. ومع ذلك، تم تحقيق نجاح محدود جدا، كما تم العثور على عدد قليل جدا من الخلايا في الفروع بعد فائقة باجتزاء. التحدي الرئيسي المتمثل في تحديد الخلايا المتفرقة استمرت لأحادي الطبقة الخلية لا تزال في معظمها غير مرئية في هلام طدت لباجتزاء. وعلاوة على ذلك، وإعداد cytospin من الخلايا قد يغير منظمتهم الخلوية بسبب انتشار الخلايا وهشاشة بنية الخلية. وبالتالي، هذه العيوب المتأصلة تستدعي نهجا جديدا لإجراء دراسات تيم من السكان الخلية نادرة مع أكثرالتناسق. للتغلب على هذه المشكلة، التي وصفناها رواية وعينة بديلة طريقة التحضير للدراسات تيم من السكان الخلية نادرة 7.
هنا، نحن الإبلاغ عن كفاءة بروتوكول إعداد نموذج لأداء تيم من العينات البيولوجية النادرة مع النتائج النوعية والكمية متسقة. تم إجراء ايفانز تلطيخ الأزرق بعد تثبيت لتوطين بيليه خلية صغيرة من الخلايا انخفاض عدد، أي 10000 نخاع العظم الجذعية المكونة للدم والخلايا الاولية التي لولاها بقيت غير مرئية، وكان جزءا لا يتجزأ من بيليه إلى الاغاروز قبل عمليات الجفاف والراتنج التضمين. هذه الطريقة مجموعات الخلايا معا، ويمكن تحليل كفاءة التركيب الدقيق وتنظيم التحت خلوية من الخلايا الجذعية المكونة للدم (يدعى لين - هيئة السلع التموينية-1 + ج كيت + Flt3 - CD34 -، شهادة الثانوية العامة)، نادر 0.2 - السكان الخلية 0.5٪ في نخاع العظام. هذا الموالية التجريبيtocol يمكن أن تكون مفيدة لإجراء دراسات فائقة الهيكلية والحصول على النتائج الكمية على العديد من السكان نادر لكنه مهم للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الحيوان المؤسسية في مؤسسة أبحاث سينسيناتي للأطفال. لهذه الدراسة، تم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظام من C57BL / 6 الفئران الفطرية الذين تتراوح أعمارهم بين 2-4 أشهر. الفرز الخلية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد تلطيخ BM مع صناع سطح مختلفة بما في ذلك النسب، ج كيت، هيئة السلع التموينية-1، واستخدمت Flt3 وCD34 لتنقية شهادة الثانوية العامة على أساس Lin- هيئة السلع التموينية-1 + ج + كيت Flt3 - CD34 - النابضة استراتيجية كما وصف بروتوكول قياسي قبل 8.
تنبيه: وتستخدم عدة مواد كيميائية شديدة السمية أثناء هذا الإجراء. هذه هي سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد. يرجى ارتداء القفازات والملابس الواقية. العمل في غطاء الدخان بينما كان يعمل مع هذه المواد الكيميائية.
1. الخلايا، التثبيت، تلطيخ وقبل التضمين
- نوع 10000 الخلايا الجذعية المكونة للدم (باستخدام لين - هيئة السلع التموينية-1
- تدور باستمرار HSCs فرزها في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام جهاز للطرد المركزي مع دلاء أرجوحة بها. إزالة المتوسطة من قبل التطلع لطيف وترك 200 ميكرولتر المتوسطة في أنابيب في كل خطوة. في هذه المرحلة، لا يزال بيليه خلية غير مرئية في الأنبوب.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.2 مل من محلول تثبيتي 2X في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة 1،9.
- جعل الحل تثبيتي الطازجة قبل استخدامها. في 1X، ويتألف الحل من 3٪ امتصاص العرق و 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة كاكوديلات.
- الطرد المركزي الخلايا في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية باستخدام أجهزة الطرد المركزي مع دلاء البديل التدريجي.
- غسل الخلايا مع 600 ميكرولتر من العازلة 0.1 M كاكوديلاتباستخدام الطرد المركزي وترك العازلة 200 ميكرولتر في الأنبوب بعد الطرد المركزي.
- وصمة عار على الخلايا الثابتة بإضافة 200 ميكرولتر من 2 ملغ حل / مل من إيفانس الأزرق في المخزن كاكوديلات واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. سوف تكون ملونة الخلايا الأزرق.
- غسل الخلايا 3 مرات مع 600 ميكرولتر من 0.1 M عازلة كاكوديلات باستخدام الطرد المركزي وترك العازلة 200 ميكرولتر في الأنبوب في كل مرة.
- إعادة تعليق الخلايا في 200 العازلة ميكرولتر ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 0.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة باستخدام جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول. إزالة العازلة بلطف من دون إزعاج الآن مرئية بيليه خلية صغيرة، وترك عازلة 50 ميكرولتر في الأنبوب.
- إضافة 200 ملغ انصهار منخفضة الاغاروز إلى 5 مل من 0.1 M عازلة كاكوديلات في أنبوب 15 مل عن حل الاغاروز 4٪. إذابة الاغاروز عن طريق نقل أنبوب إلى الماء المغلي في زجاجة 100 مل والحفاظ فاتر حتى استخدامها.
- إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ انصهار منخفضة حل الاغاروز في 0.1 M cacodylaالشركة المصرية للاتصالات عازلة لتعليق الخلية في أنبوب 0.5 مل وعلى الفور أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية باستخدام أعلى الجدول الطرد المركزي.
- بعد التأكد من أن الخلايا مكعبات في الجزء السفلي من أنبوب 0.5 مل في الاغاروز شبه صلبة بعد الطرد المركزي، ونقل على الفور الأنبوب إلى 4 درجات مئوية أو الثلج لمدة 20 دقيقة لترسيخ الاغاروز. هذه الخطوة هي حرجة للغاية، وبيليه خلية مرئية صغير في هذه النتائج خطوة في كتلة جيدة من الخلايا تحت المجهر الالكتروني.
- نقل بعناية الاغاروز طدت تحتوي على بيليه خلية من الأنبوب إلى 35 مم البلاستيك طبق بتري تحتوي العازلة باستخدام 27 إبرة G 3،10.
- تقليم الاغاروز المتصلبة التي تحتوي على بيليه خلية في قطعة واحدة من حوالي 1-2 ملم مع مشرط. نقل قطعة الاغاروز التي تحتوي على بيليه الخلية إلى أنبوب 1.5 مل جديد.
- يغسل 2-3 مرات باستخدام 600 ميكرولتر من العازلة 0.1 M كاكوديلات عن طريق إضافة وإزالة العازلة باستخدام ماصة دون الطرد المركزي. استخدام هذه القطعة الاغاروز التي تحتوي على بيليه خلية للخطوة التالية. في هذه الخطوة، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
2. المعاملة بالأوزميك، الجفاف، تضمين
- إزالة المنطقة العازلة كاكوديلات من أنبوب 1.5 مل مع بيليه الخلية التي تحتوي على الاغاروز باستخدام ماصة. إضافة 1.0 مل من 1٪ أكسيد الأوزميوم الثماني (أوسو 4) حل في غطاء الدخان، واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
- يغسل ثلاث مرات مع 600 ميكرولتر من 0.1 M عازلة كاكوديلات ونقل العينة إلى 20 مل الزجاج التلألؤ قنينة مع غطاء.
- معالجة عينة من الجفاف، تسلل وتضمينها في الراتنج (على سبيل المثال، LX-112) مع تغييرات المسلسل من الحلول التالية في لوحة 6 جيدا. نقل الاغاروز قطعة خلية بيليه باستخدام ملقط.
- تزج العينة في 25٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة.
- تزج العينة في 50٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة.
- تزج العينة في 75٪ الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة.
- تزج العينة في 95٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة.
- تزج العينة في الإيثانول بنسبة 100٪ في RT لمدة 15 دقيقة، مرتين.
- تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (3: 1) في RT لمدة 30 دقيقة.
- تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (1: 1) في RT لمدة 30 دقيقة.
- تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (1: 3) في RT لمدة 30 دقيقة.
- تزج العينة في الراتنج النقي في RT لمدة 60 دقيقة، مرتين.
- نقل العينة إلى الجزء السفلي من الهرم طرف العفن على شكل المطاط باستخدام ملقط بعناية وإضافة الراتنج أكثر نقاء على رأس عينة لملء القالب. احتضان العينة على 60 درجة مئوية لمدة 72 ساعة للبلمرة الراتنج.
- إزالة هرم راتنج بلمرة من القوالب قبل التواء في قالب من المطاط. وينبغي أن تكون كتلة سوداء صغيرة من الخلايا مرئية في هرم راتنج بلمرة، كما هو موضح سابقا 7. إرفاق هرم راتنج بلمرة على اسطوانة تصاعد استخدام cyanoacrylate.
معشوقة = "jove_title"> 3. باجتزاء ونقل المجهر
- تقليم كتلة الهرم بشفرة حلاقة وسكين الماس بعد تصاعد كتلة على مشراح-فائقة. جعل قصيرة شكل شبه منحرف واسعة مع الجزء العلوي والجزء السفلي من كتلة موازية لبعضها البعض، ومع الجانبين الزاوية بالتساوي. هذا الشكل من الهرم يساعد لباجتزاء المسلسل.
- وعلاوة على ذلك، وتقليم كتلة حول الخلية بيليه مع سكين الماس وإزالة الأجزاء البلاستيكية حول الخلية بيليه الاغاروز قطعة.
- قطع 1 ميكرون المقاطع باستخدام وسيلة مشراح جدا. نقل 1 ميكرون المقاطع من قارب الماء لشريحة زجاجية باستخدام أداة رمش وأداة حلقة معدنية كما ذكرت سابقا 7. نقل المقاطع على الشرائح والشرائح نقل إلى صفيحة ساخنة (37 درجة مئوية) لمدة التجفيف.
- إضافة قطرة من طولويدين حل الأزرق إلى أقسام باستخدام حقنة مجهزة 0.22 ميكرون تصفية واحتضان لمدة 3 دقائق. شطف الشرائح مع الماء المقطر ولوآخرون الأقسام تجف. تحقق مع المجهر الضوئي لتحديد موقف من الخلايا.
- قطع المقاطع رقيقة جدا (70-100 نانومتر) باستخدام سكين الماس. نقل 2-3 أقسام على شبكات 200 شبكة من القارب المياه إلى طبق بيتري الزجاج باستخدام أداة رمش.
- نقل الزجاج طبق بتري تحتوي على شبكات مع أقسام لوحة الساخنة عند 30 درجة مئوية لتجف أقسام لمدة 30 دقيقة.
- وصمة عار على شبكات مع قطرات من 1٪ خلات اليورانيل في RT لمدة 10 دقيقة ثم يشطف في الماء المقطر 6-8 مرات. وصمة عار مع رينولدز يؤدي سيترات، في RT لمدة 5 دقائق ويشطف في الماء المقطر 6-8 مرات. نقل الزجاج طبق بتري تحتوي على شبكات لوحة الساخنة عند 37 درجة مئوية لتجف أقسام.
- تحليل المقاطع باستخدام المجهر الإلكتروني، في 80 كيلو فولت 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول فعال وثابت لإعداد نموذج لأداء تحليل تيم من يوصف انخفاض عدد الخلايا. ساعد بعد تثبيت تلطيخ مع ايفانز الأزرق ونقل الخلايا إلى أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لتصور بيليه خلية صغيرة 7. المعاملة بالأوزميك مع tetraoxide الأوسيميوم في الاغاروز أدى إلى سهولة اكتشاف من بيليه الخلية الظلام خلال الجفاف والتضمين.
وأكدت أقسام شبه رقيقة من الكتل التي تحتوي على خلية بيليه الصغير مجموعة من خلايا عديدة معا (الشكل 1A و 1B). قطعت أقسام رقيقة جدا من منطقة عنقودية خلية وتحليلها تحت المجهر الإلكتروني (الشكل 1C). التشكل وبنية فوقية من هذه الخلايا تم الحفاظ عليها بشكل جيد (1D الشكل). وأظهرت صورة مجهرية الإلكترون من الخلايا الفردية تفاصيل عالية على داخل الخلاياهياكل جدا (الشكل 1E). وعلاوة على ذلك، أظهرت ارتفاع التكبير (50،000X) صور هيكل المحفوظة جيدا وسلامة عضيات شبه الخلوية، مثل الميتوكوندريا (الشكل 1F).
الشكل 1: صورة تحليل تحت الضوء والمجهر الإلكتروني. (A) منخفضة صورة التكبير من حقل الممثلين طولويدين القسم الملون الأزرق من 1 ميكرون سمك تحت المجهر الضوئي. (ب) ضوء صورة المجهر تبين التشكل سليمة من الخلايا في الكتلة بعد طولويدين تلطيخ الأزرق من 1 ميكرون سمك الباب. (ج) المجال الشامل من الكتلة خلية لاحظ تحت المجهر الالكتروني بعد تلطيخ مع خلات اليورانيل ويؤدي سترات (D) وحيد LT-شهادة الثانوية العامة تحت المجهر الالكتروني (E) magnif العاليصورة ication من شهادة الثانوية العامة تبين الهياكل التحت خلوية. (F) ارتفاع صورة التكبير من الميتوكوندريا من HSPC. شريط النطاق: A / B، 100 ميكرون. C، 10 ميكرون. D، 2 ميكرون. E / F، 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمكن هذه الطريقة تحليل تيم على أرقام الهواتف المحمولة المنخفضة، باستخدام ايفانز تلطيخ الأزرق والاغاروز التضمين في توطين بيليه خلية صغيرة خلال الجفاف، التضمين الراتنج والعمليات باجتزاء. الأهم من ذلك أنها تحتفظ مجموعات الخلايا معا، ويحافظ على الخلية فائقة هيكل، الذي أمر مرغوب فيه لفحص خلايا متعددة لتقدير حجم البيانات.
في دراسات تيم، بيليه الخلية التي تحتوي ملايين الخلايا في كثير من الأحيان اللازمة لالغرز كفاءة إلى الاغاروز / الجيلاتين المصفوفة ولغسيل والجفاف وتسلل إلى الحصول على بيانات من خلايا عديدة. وقد اعتمد الباحثون تجميد تعليق خلية في راتنج بلمرة BSA-bisacrylamide، وتلطيخ للالطبقات الوحيدة على دعم رقيقة، أو cytospins لتحليل تيم على أرقام الهواتف المحمولة منخفضة / عينات نادرة 4-6. ومع ذلك، فإنه لا يزال مهمة شاقة في توطين وقطع الخلايا تحت TEM بسبب توزيع متفرق من الخلايا داخل المصفوفة والتعديلات المحتملة للمورفولوجيا الخلايا، وذلك بسبب انتشار والانقسام بين الخلايا أثناء إعداد cytospin التي غالبا ما يتطلب إعادة تضمين قبل باجتزاء. وعلاوة على ذلك، لا يزال أحادي الطبقة الصعبة للتوطين لباجتزاء 11. وهكذا، فإن بيليه الخلية حتى من العينات البيولوجية النادرة من عدد الخلايا منخفض هو أسهل بكثير لتحليل تيم 1.
ويمثل هذا الأسلوب ميزة كبيرة لأساليب نشرت السابقة 4،5 من حيث تحليل فائقة الهيكلي النوعي والكمي من عينات محدودة. معا، ويصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لتوطين الكريات خلية لتيم ايفانز باستخدام اللون الأزرق، مما يجعل تجهيز العينات من أرقام الهواتف المحمولة منخفضة سهلة للتيم لتمكين تحليل البيانات النوعية والكمية. عادة، وإعداد نموذج لتيم يتطلب عددا أكبر من الخلايا مما هو مطلوب عادة لالمجهر الضوئي، نظرا للخطوات متعددة في تجهيز العينات وأو تيم والتوجيه السليم للزنزانة لقطع في المكان المناسب 1،10.
ومن المعروف أن بعد تثبيت المعاملة بالأوزميك توفر أفضل النقيض من ذلك في الصور، ولا سيما تلك الأغشية وجزيئات الجليكوجين تحت مجهر الكتروني 9، ومزيد من تلطيخ الدعم مع خلات اليورانيل، وصمة عار نسبيا غير محددة للبروتينات، ويؤدي سترات أن البقع الأغشية، والأحماض النووية والجليكوجين. ومع ذلك، المعاملة بالأوزميك يكاد يكون من المستحيل لأداء مع العينات البيولوجية النادرة في تعليق بعد ما قبل التضمين في جيش صرب البوسنة-BA بسبب احتمال كبير لخسارة عينة خلال باجتزاء وسواد المصفوفة. وهكذا نوعية من الميكروسكوب الإلكتروني تعرض للخطر في دراسات سابقة 4،9. هنا أدت المعاملة بالأوزميك إلى سواد بيليه الخلية مع تغيير طفيف في لون الاغاروز. وبالتالي، يسمح هذا البروتوكول المعاملة بالأوزميك بعد قبل التضمين في الاغاروز من أجل توفير النقيض جيدة في تيم ايمالأعمار.
وكانت مجموعات الخلايا من السهل جدا لتحليل مع المجهر الإلكتروني باستخدام هذا الأسلوب. ساعد تلطيخ قبل مع ايفانز الأزرق في توطين الكريات خلية صغيرة أثناء إعداد العينات دون أن يؤثر تفاصيل خلية فرعية العضيم. ويوفر هذا الأسلوب نهجا بديلا لإعداد نموذج لأداء بنجاح تحليل تيم من أرقام الهواتف المحمولة منخفضة. في هذه الطريقة، تم إجراء التحليل تيم فعال باستخدام الخلايا صغيرة الحجم (5-8 ميكرون). وبالتالي، يمكن بسهولة أن تعتمد هذا النهج حتى مع انخفاض عدد الخلايا (~ 1000 الخلايا) من الخلايا الكبيرة مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية. على الرغم من إيفانس الأزرق لم تؤثر تفاصيل خلية فرعية العضيم في هذه الدراسة، لم يتم اختباره استخدام ايفانز الأزرق للالمناعية الذهب المجهر الإلكتروني مع أرقام الهواتف المحمولة منخفضة.
معا، وصفت وسيلة فعالة لإعداد العينات لإجراء دراسات تيم من عدد الخلايا منخفضة. ويتطلب إجراء دراسات تيم للكشف حرجةمعلومات ل على التشكل وهياكل جدا من الخلايا. وبالتالي، معلومات فائقة الهيكلية في كثير من الأحيان في عداد المفقودين في مختلف السكان الخلية نادرة. وهذا البديل ونهجا جديدا لإعداد العينات تكون مفيدة لإجراء دراسات تيم من أية مجموعة من السكان الخلية نادرة. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا الأسلوب البيانات الكمية والنوعية من تحليل مجموعات الخلايا. كما يقدم المجهر الإلكتروني تفاصيل غير مسبوقة للخلية فائقة هيكل وتنظيم، وسوف تكون هذه الطريقة مفيدة جدا لفهم العديد من العمليات البيولوجية على المفتاح، ولكن نادر، سكان الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D.
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
