Summary
Een unieke rattenlever hilaire clamp model ontwikkeld voor het bestuderen van de effecten van farmacologische moleculen bij het verbeteren van ischemie-reperfusieletsel. Dit model omvat directe canulatie van het portaal toevoer naar het segment ischemische lever via een tak van de poortader, zodat hij direct hepatische afgifte.
Abstract
Major lever chirurgie met instroom occlusie, en levertransplantatie, vereisen een periode van warme ischemie, en een periode van reperfusie leidt tot ischemie / reperfusie (I / R) letsel met talloze negatieve gevolgen. Potentiële I / R schade in marginale organen bestemd voor levertransplantatie uitmaken van de lopende donor tekort secundair aan een verminderde orgaan bezettingsgraad. Een grote behoefte bestaat om de lever I / R schade onderzoeken om het effect ervan op transplantaatfunctie bij transplantatie mediëren. Rattenlever hilaire klem modellen worden gebruikt om het effect van verschillende moleculen op lever I / R schade onderzocht. Afhankelijk van het model, zijn deze moleculen geleverd via inhalatie, epidurale infusie, intraperitoneale injectie, intraveneuze toediening of injectie in de perifere ader mesenterica superior. Een rattenlever hilaire klem model werd ontwikkeld voor het bestuderen van de effecten van farmacologische moleculen bij het verlichten van I / R schade. de described model rattenlever hilaire klem omvat directe canulatie van het portaal levering aan de lever ischemische segment via een zijtak van de poortader, zodat hij direct segmentale hepatische afgifte. Onze benadering is om ischemie te induceren in de linker laterale en middelste lobben gedurende 60 min, gedurende welke tijd de bestudeerde stof wordt toegediend. In dit geval, gepegyleerd superoxide dismutase (SOD-PEG), een vrije radicaal scavenger, direct geïnfuseerd in de ischemische segment. Deze reeks experimenten toont aan dat infusie van PEG-SOD is beschermend tegen lever I / R schade. Voordelen van deze benadering omvatten directe injectie van het molecuul in het ischemische segment daaruit voortvloeiende verlaging in distributievolume en vermindering van systemische bijwerkingen.
Introduction
Major lever chirurgie met instroom occlusie, en levertransplantatie, vereisen een periode van warme ischemie, en een periode van reperfusie leidt tot ischemie / reperfusie (I / R) letsel 1. De gevolgen van I / R schade in de lever zijn uitgebreid 1, 2, 3 beschreven. Gevolgen van I / R schade beschreven in de literatuur omvatten: het genereren van reactieve zuurstofspecies, initiatie van de inflammatorische cascade waaronder activering van neutrofielen, Kupffer-cellen en endotheliale cellen, activering van het heem oxygenase systeem en activatie van Toll-like receptoren, een onbalans tussen endotheline en stikstofmonoxide activering van nucleaire factor-kB en stimulering van pro-inflammatoire cytokine en adhesiemoleculen synthese 1, 2, 3. Deze proinflammatoire gebeurtenissen kunnen lead apoptose, necrose, orgaanfalen en uiteindelijk orgaanfalen 3.
I / R schade in organen die bestemd zijn voor levertransplantatie kan leiden tot vroegtijdige transplantaatverlies en draagt bij aan de huidige donor tekort marginaal organen zijn gevoeliger voor schade 3. Er zijn momenteel 15.226 potentiële ontvangers op de wachtlijst voor levertransplantatie in de Verenigde Staten 4 en slechts 5950 lever transplantaties werden uitgevoerd in 2015 5. Als gevolg van deze extreme beperkingen in de beschikbaarheid van organen, onderzoek het verkennen van de lever I / R schade is nodig om graft function en orgel gebruik te optimaliseren.
Diermodellen vroeger lever I / R schade studie omvatten rat hilaire klem modellen en ratten levertransplantatie modellen. Er zijn een verscheidenheid van rat hilar klem modellen die nu in gebruik is. De meest voorkomende is er een waarin de poortader, leverslagader en gal duct toevoeren van het linker laterale en middelste lobben geklemd gebruikt microchirurgische klemmen 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 gedurende 30 tot 60 min 6, 7, 10, 13, 14, en vervolgens een periode van reperfusie van 60 min 24 uur 7, 9, 10, 13, 14 wordt toegelaten. De linker laterale en middelste lobben van de rattenlever omvatten ongeveer 70% van de hepatische parenchym 9. Sommige protocollen ontworpen om ischemische preconditionering studie omvatten intermitterende klemming van het hilar vaartuigenof de achterste ledematen voorafgaand aan een langere ischemie geïnduceerd door klemmen de hilaire vaten 9, 13. Er zijn ook verschillende modificaties in de literatuur beschreven. De eerste is om de poortader en leverslagader toevoeren van het linker laterale en middelste lobben klem, maar exclusief de galwegen 15. Een tweede modificatie aan totale hepatische ischemie induceren door het klemmen van de poortader en leverslagader galkanaal vóór de scheiding 16, 17, 18, 19, 20. Een derde modificatie omvat klemming van de hilaire vaten rechts kwab gedurende 30 tot 60 min 8. Een extra modificatie omvat het klemmen van de vaatbundels in één achterpoot om letsel te induceren in de lever 13, 21 Figuur 1A-D.
Rattenlever hilaire klem modellen werden gebruikt om het effect van verschillende moleculen en verbindingen op lever I / R studie. Afhankelijk van het model gebruikte deze moleculen zijn geleverd via inhalatie 11, epidurale infusie 12, intraperitoneale injectie 17, 18, 21, 22, intraveneuze toediening 10, 14, 15, 19, 23, 24 of injectie in de ader perifere mesenterica superior 8 .
Het model voor rattenlever hilaire klem die in dit verslag includes directe canulatie van het portaal levering aan het ischemische segment via een zijtak van de poortader (figuur 2), waardoor directe segmentale hepatische afgifte van farmacologische stoffen onder studie. Onze benadering is om ischemie te induceren in de linker laterale en middelste lobben gedurende 60 min, gedurende welke tijd een infusie van de bestudeerde stof, in casu gepegyleerd superoxide dismutase, een vrije radicaal scavenger 25, direct geïnfuseerd in de ischemische segment . Bloedmonsters worden genomen voorafgaand aan inductie van ischemie en 120 min na reperfusie. Op dit punt wordt de rat opgeofferd en monsters worden genomen van links mediaan lobben. Bovendien worden monsters genomen uit de rechter kwab te dienen als een interne controle.
Er zijn tal van voordelen aan deze aanpak. Allereerst, wanneer de farmacologische stof bestudeerde direct worden geïnjecteerd in het ischemische volume segment of distributie is vrij laag vergeleken met het distributievolume van injectie in de systemische circulatie van de peritoneale ruimte. Bovendien is deze benadering vermindert, maar elimineert niet de mogelijkheid van systemische bijwerkingen.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care en Gids van de National Research Council voor de Humane zorg en gebruik van proefdieren (IACUC) en heeft de goedkeuring door de Ohio State University IACUC commissie ondergaan.
1. Eerste set-up
- Opstelling van de chirurgische microscoop en de operatiekamer (Figuur 3, Figuur 4). Zet alle apparatuur, waaronder die voor het onderhoud van anesthesie en bewaken van de vitale functies. Schakel de elektrochirurgische unit en opwarming pad. Positioneer de infuuspomp bij de operatietafel.
- Opstellen 10 ml vloeistof voor inhalatie isofluraan (molecuulgewicht 184,5) in de anesthesie spuit en plaats deze in de anesthesie apparaat.
- Set-up een 200 ml houder met vloeibare stikstof bij de operatietafel en andere bij de centrifuge wanneer bloedmonsters worden verwerkt.
- Posvulle de chirurgische instrumenten, 4-0 en 7-0 gevlochten zijden hechtdraad, steriele wattenstaafjes, 4x4 non-woven sponzen, 5 ml spuiten en 27 gauge insuline injectiespuiten bij de operatietafel.
- Bereid de isofluraan kamer en zorgen voor voldoende isofluraan wordt bijgebracht de anesthesie-inductie afgiftesysteem.
2. Inductie van anesthesie
- Vóór de behandeling van de rat die op de volgende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM): chirurgisch masker, chirurgische handschoenen en wegwerp toga.
- Weeg de rat en registreer het gewicht.
OPMERKING: Sprague Dawley ratten worden gebruikt. - Plaats de rat in de anesthesie kamer en zet de isofluraan en zuurstof. Induceren anesthesie met de isofluraan kamer.
- Klem Buikhaar het dier met een elektrische tondeuse om voor schonere blootstelling (Figuur 5).
- Leg het dier opnieuw in de isofluraan kamer voor een additioNal één minuut. Voer een teen knijpen om de diepte van de anesthesie te controleren.
3. Procedure
- Plaats de rat met de neus van het dier in de neuskegel en vier ledematen geïmmobiliseerd met beperkingen of tape op de opwarming pad.
- Verder verdoving middels de anesthesie afgiftesysteem, neuskegel en isofluraan anesthesie met 3,6% voor dieren met een gewicht tussen 200 en 250 g en 4% voor dieren van meer dan 250 g. Bevestig diepte van de anesthesie door het uitvoeren van een teen knijpen en een huid snufje.
- Voeg een abdominale incisie schaambeen naar zwaardvormig door de huid met behulp van een scherpe schaar (figuur 6).
- Maak een insnijding in het buikvlies langs de linea alba van schaambeen tot zwaardvormig en voer de buik zorg niet naar de blaas of darmen beschadigen. De lever ook vast aan het buikvlies voren bij de zwaardvormig proces zorgen dat het vrijkomen voorafgaand aan het insnijden van de buikwand in deze area.
- Maak een dwarse incisie door de huid en het buikvlies op het niveau van de onderrand van de juiste kwab van de lever.
- Draai de narcose minder is dan 1,6% voor dieren met een gewicht tussen 200 en 250 g en 2% voor dieren van meer dan 250 g.
- Trek de zwaardvormig met behulp van een gekromde mosquito klem.
- Plaats rib oprolmechanisme trekken de ribben zo ver mogelijk van de middellijn (figuur 7). Snijd de falciform, diafragma en maag ligamenten. Flip de lever met behulp van bevochtigde steriele wattenstaafjes.
- Snijd extra ligamenten als nodig is om de toegang tot de porta krijgen. Voeren viscerale rotatie zoutoplossing bevochtigd gaas (figuur 7).
- Verwijder het losse bindweefsel dat over het portaal hilus met een scherpe of stompe dissectie. Verwijder het losse bindweefsel die over de lengte van de poortader.
- Tang te duwen via losmazig tkwestie posterior om de ader links portal, slagader en galwegen het maken van een raam en zet 4-0 Potts hechtdraad, maar niet cinch naar beneden (Figuur 8).
- Duidelijk uit de losse bindweefsel boven de achterste afslag naar de poortader die komt op ongeveer het niveau van de rechter nier. Deze ader zal worden gebruikt voor infusen.
- Trek 0,5 ml bloed uit de vena cava inferior (IVC) met een insulinespuit (figuur 9). Plaats de 0,5 ml bloed in een klein flesje, centrifugeer bij 135 xg gedurende 12 min. Proberen af te voeren serum.
- Als een duidelijke lijn niet duidelijk tussen de rode bloedcellen en serum, probeer gecentrifugeerd gedurende nog 2-3 min bij 135 x g. Tap serum en in een flesje voor alanine-aminotransferase (ALT). Snap bevriezen dit exemplaar door deze direct in vloeibare stikstof.
- Snij twee stukken van 7-0 hechtdraad en plaats nabij de ader die wordt gebruikt canuletie. Plaats de eerste 7-0 lus rond deze geest zo ver mediaal mogelijk. Binden deze lus en gebruiken te trekken met behulp van een gekromde mosquito klem (Figuur 10). Plaats een tweede 7-0 lus op de ader die zal worden gebruikt voor infusen in de buurt van de kruising met de poortader en plaats een gelijkspel, maar niet cinch naar beneden.
- Bereid de infusiepomp met een 5 ml spuit met 3 ml reagens. Prime de slang.
- Klem vena distale poort via een microchirurgische klem.
Opmerking: Dit zal bloeden te verminderen wanneer de ader wordt ingesneden voor canulatie. - Snijd een 0,5 mm opening in de ader tussen de 7-0 verblijf hechtdraad en het snijpunt met de poortader via kleine microchirurgische schaar. Met 27-0 katheter naar links portale veneuze systeem (figuur 11, figuur 12) canule. Een katheter voorbij de vertakking van de linker en rechter poortaderen.
- Controleer de plaatsing van de canule door Infusing 1 ml normale zoutoplossing en let op de linker laterale en middelste lobben van de lever blancheren. Handmatig controleren of catheter voorbij de take-off van de ader recht portaal, maar niet verder dan de take-off van de poortader het voeden van de mediaan kwab.
- Cinch beneden de Potts hechtdraad en start ischemie tijd. Draai 7-0 hechtdraad rond ader en 27-0 katheter op zijn plaats houden en verwijder de klem uit de ader distale poort.
- Start de infusie van polyethyleenglycol-superoxidedismutase (SOD-PEG, 0,00067 g / ml) met de infusiepomp. Start het infuus zo dicht mogelijk bij het begin van de ischemische tijd.
4. Monitoring
- Doorgaan om de vitale functies van het dier gedurende de infusie te controleren. Lever 2 ml 0,9% normale zoutoplossing of 2 ml PEG-SOD (0,00067 g / ml) opgelost in 0,9% normale zoutoplossing gedurende 15 min.
5. reperfusie
- Laat een uur om van het begin van de ischemic tijd. Dit is 1-uur warme ischemie tijd.
- Verwijder het Potts hechtdraad. Verwijder het 27-0 katheter. Cinch beneden de 7-0 hechtdraad rond de ader. Let op de tijd. Dit markeert het moment van reperfusie.
6. Monstername
- Trek 0,5 ml bloed uit de IVC 120 min na reperfusie. Teken het bloed langzaam om te voorkomen dat het lyseren van rode bloedcellen. Langzaam druppelen van het bloed in een flesje. Zorgen dat bloeden uit de IVC wordt gecontroleerd na elke bloedafname.
- Bij voortgezet bloeden druk zachtjes met een steriel wattenstaafje of een kleine 1 cm bij 1 cm doorsnede-uit gaas.
- Centrifugeer bij 135 xg gedurende 12 min. Indien geen voldoende scheiding niet wordt verkregen, probeer nog eens 2-3 minuten bij 135 x g.
- Leg de helft van het serum in een flacon voor latere verwerking voor ALT. Snap bevriezen deze monsters.
7. Euthanasie
- Terwijl de rat onder verdoving nog stuurde de IVC en superior vena cava (SVC) en controleren totdat de bloedstroom, ademhaling en hartslag staakt.
- Insnijden het membraan en voer een korte hepatectomie door insnijden van het membraan in een cirkel en insnijden extra bindweefsel dat het aansluiten van de lever naar de peritoneale holte blijft. Verwijder de lever uit de peritoneale holte.
- Neem vier monsters van de linker en de mediaan lobben van de lever en vier monsters van de juiste kwab van de lever. De monsters moeten zo groot mogelijk zijn en de grootte wordt beperkt door de hoeveelheid beschikbare leverweefsel. Plaats deze in kleine, gelabelde flesjes, en snap bevriezing van de vloeibare stikstof. Gebruik deze voor latere verwerking voor weefsel adenosinetrifosfaat (ADP), malondialdehyde (MDA) en glutathion (GSH).
8. Post-experiment Analyse
- Bepalen glutathion (GSH), malondialdehyde (MDA) en alanine aminotransferase (ALT) activiteiten leverweefsel en serummonsters de diagnostische kitsvolgens de instructies van de fabrikant.
- Homogeniseren het leverweefsel met lysis buffer en gekwantificeerd onder toepassing van een Bradford-assay. Analyseren weefsel lysaat door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel elektroforese en immunoblotanalyse met behulp van antilichamen tegen gesplitst capase-3 en actine. Kwantificeren western blots uitgevoerd met algemeen beschikbare software.
Representative Results
Dit experiment werd uitgevoerd met 2 groepen van n = 3 ratten per. Drie ratten levers werden geïnjecteerd met 2 ml normale zoutoplossing (NS) met de infusiepomp gedurende 15 min. Drie ratten levers werden geïnjecteerd met 2 ml normale zoutoplossing (NS) gemengd met gepegyleerd superoxide dismutase (SOD-PEG, 0,00067 g / ml) met de infusiepomp gedurende 15 min. Zoals beschreven in het bovenstaande voorschrift werden bloedmonsters genomen pre-hilaire klem en 120 min na reperfusie. Bovendien, na afloop van 120 min reperfusie vier leverweefsel werden genomen van links mediaan lobben en vier levermonsters werden uit de juiste kwab van de rattenlever.
Serum alanineaminotransferase (ALT) werd gemeten pre-hilaire klem en 120 min na reperfusie in control (NS) en experimentele (PEG-SOD) dieren. Er was een significant verschil tussen de ALT controleniveau (NS)dieren pre-hilaire klem en 120 min na reperfusie. Er was een significant verschil tussen de ALT controleniveau (NS) en proefdieren (PEG-SOD) en 120 minuten (Figuur 13A). Weefsel malonaldehyde (MDA) werd gemeten voor de controle (NS) en experimentele (PEG-SOD) dieren in zowel de rechter als linker lobben van de lever. MDA weefsel in de rechter kwab (zonder hilaire klem) met controle-injectie (NS) en experimentele injectie (PEG-SOD) vertoonden geen significant verschil. Linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) weefsel MDA control injectie (NS) is significant verschillend rechter kwab (zonder hilaire clamp) p <0,001. Linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) heeft duidelijk verschillende weefsels MDA control injectie (NS) versus experimentele injectie (PEG-SOD) p <0,005 (Figuur 13B). Weefsel glutathion (GSH) werd gemeten en weefsel glutathion in rechter kwab (zonder hilaire klem) met controle-injectie (NS) and experimentele injectie (PEG-SOD) vertoonden geen significant verschil. Linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) weefsel GSH met controle-injectie (NS) is significant verschillend rechter kwab (zonder hilaire klem) met controle-injectie (NS) p <0,05. Linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) heeft duidelijk verschillende weefsels glutathion met controle-injectie (NS) versus experimentele injectie (PEG-SOD) p <0,005 (Figuur 13C). Western blot werd uitgevoerd vergelijken rechter en linker lob van controledieren en toont verhoogde gesplitst caspase-3 in de linker kwab na hilaire klem en reperfusie (Figuur 13D). Een tweede Western blot werd uitgevoerd vergelijken links lobben dieren behandeld met controle en met PEG-SOD (figuur 13E). Dit demonstreert verminderde gesplitst caspase-3 in het leverweefsel van dieren behandeld met PEG-SOD. Densitometrie werd ook uitgevoerd MONSTRAting dat het niveau van gesplitst caspase-3 in leverweefsel aanzienlijk de linker versus rechter kwab van controledieren (Figuur 13F) wordt verhoogd. Bij vergelijking van de linker kwab leverweefsel proefdieren toegediend met PEG-SOD en linker kwab leverweefsel controledieren, doordrenkt met normale zoutoplossing, demonstreert densitometrie significant verlaagd gesplitst caspase-3 bij dieren behandeld met PEG-SOD vergeleken met dieren behandeld met controle (Figuur 13G).
Figuur 1: Anatomische illustraties. A. Anatomische illustratie van de rattenlever. B. Anatomische illustratie van de rattenlever. Het portaal pedikel links en mediaan lobben van de lever wordt vastgeklemd. De linker en middelste lobben zijn ischemisch. C. Anatomischeillustratie van de rattenlever. Het portaal pedikel links kwab wordt vastgeklemd. De linker kwab ischemische. D. Anatomische illustratie van de rattenlever. Het portaal pedikel rechts kwab wordt geklemd en de rechter kwab ischemische.
Figuur 2: Anatomische illustraties. Anatomische illustratie van de rattenlever met portale ader gecanuleerd via een zijtak. Het portaal pedikel links en mediaan lobben van de lever wordt omgeven door een hechtdraad en een microvaatje klem is gebruikt strakker rond de vaatbundels. De linker en middelste lobben zijn ischemisch.
Figuur 3: instrumentinstellingen. Dit cijfer toont aan th e instrument set-up.
Figuur 4: Operating Room Set-up. Deze figuur toont de operatiekamer set-up. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Het opmaken van Buikhaar. Deze figuur toont het trimmen van de buik haar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
load / 54729 / 54729fig6.jpg"/>
Figuur 6: Immobilisatie en huidincisie. Deze figuur toont de immobilisatie van de rat en de huid incisie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Rib Retractor plaatsing en ingewanden. Deze figuur toont de rib retractor plaatsing en het verwijderen van de ingewanden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Plaats ment voor hechtingen. Deze figuur toont de plaatsing van de hechtdraad. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: Blood Draw van de Vena Cava inferior. Dit cijfer toont aan bloed trekken uit de inferieure vena cava. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: Vein Branch afgebonden en ingetrokken. Deze figuur toont ader aftakken gebonden en teruggetrokken. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 11: Proces Canulatie. Deze figuur toont het proces van infusen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 12: Canulatie. Deze figuur toont de canule. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 13: Representatieve resultaten: Direct Segmentale Intrahepatische Levering van Pegylated-superoxidedismutase Met behulp van een Rat Hilar Clamp Model. NS = normale zoutoplossing. PEG-SOD = gepegyleerd superoxide dismutase, ALT = alanine aminotransferase, MDA = malondialdehyde. A. serumalanineaminotransferase (ALT, mU / ml) vergeleken tussen pre-hilaire klem en 120 min na reperfusie. Er is een significant verschil tussen de controle (NS) vooraf hilaire klem en controle (NS) en 120 min na reperfusie (p <0,001). Ook is er een significant verschil tussen de controle (NS) en experimentele groepen (PEG-SOD) en 120 min na reperfusie (p <0,05). T-toets van een student werd gebruikt. Fout balken geven standaarddeviatie. B. Weefsel malondialdehyde in rechter kwab (zonder hilaire klem) met controle-injectie (NS) eend experimentele injectie (PEG-SOD) vertoonden geen significant verschil. Linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) weefsel malondialdehyde met controle-injectie (NS) is significant verschillend rechter kwab (zonder hilaire clamp) p <0,001. Linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) heeft duidelijk verschillende weefsels malonaldehyd met controle-injectie (NS) versus experimentele injectie (PEG-SOD) p <0,005. T-toets van een student werd gebruikt. Fout balken geven standaarddeviatie. C. Weefsel glutathion in rechter kwab (zonder hilaire klem) met controle-injectie (NS) en experimentele injectie (PEG-SOD) vertoonden geen significant verschil. Linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) weefsel met glutathion control injectie (NS) is significant verschillend rechter kwab (zonder hilaire klem) met controle-injectie (NS) p <0,05. Linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) heeft duidelijk verschillende weefsels met glutathion control injection (NS) versus experimentele injectie (PEG-SOD) p <0,005. T-toets van een student werd gebruikt. Fout balken geven standaarddeviatie. D. Western blot demonstreren verhoogde gesplitst caspase-3 in leverweefsel van de linker kwab (post-hilaire klem en reperfusie) versus de rechter kwab (zonder hilaire clamp) controledieren (normale zoutoplossing). E. Western blot demonstreert verminderde gesplitst caspase-3 in leverweefsel van dieren behandeld met PEG-SOD in vergelijking met dieren die met controle (normale zoutoplossing). F. niveau van gesplitst caspase-3 in leverweefsel significant verhoogd in post-hilaire klem en reperfusie dieren (p <0,05). T-toets van een student werd gebruikt. Fout balken geven standaarddeviatie. G. In vergelijking linker kwab leverweefsel van proefdieren (doordrenkt met PEG-SOD) en linker kwab leverweefsel controledieren (doordrenkt met normale zoutoplossing), wordt significant verlaagd gesplitst caspase-3 in eenij dieren behandeld met PEG-SOD in vergelijking met dieren die met controle (normale zoutoplossing). T-toets van een student werd gebruikt. Fout balken geven standaarddeviatie.
Discussion
Deze reeks experimenten toonden dat injectie van PEG-SOD in de linker en middelste lobben leidde tot een significante daling in de afgifte van ALT, lipideperoxidatie van celmembranen (MDA) en het onderhoud van glutathion (GSH) in vergelijking met controles (normale zoutoplossing ). Leverweefsel transaminasen zoals alanineaminotransferase (ALT) zijn vastgesteld markers van hepatocellulaire schade. De afname van ALT wanneer de linker kwab geïnjecteerd met PEG-SOD suggereert een beschermend effect van PEG-SOD. Verhoogde weefsel MDA geeft verhoogd lipidenperoxidatie en wordt beschouwd als een marker van oxidatieve stress en weefselbeschadiging. Overproductie van reactieve zuurstofsoorten leidt tot een hogere productie van MDA 26. De significante vermindering van MDA weefsel in de linker en middelste lobben van het dier na injectie met PEG-SOD toont een beschermend effect van PEG-SOD. Dit is in overeenstemming met de huidige kennis die PEG-SOD beschermt de cellen tegen beschadigingveroorzaakt door gedeeltelijk gereduceerde reactieve zuurstofsoorten 27. Bovendien, in aanwezigheid van reactieve zuurstofspecies, glutathion disulfide gereduceerd glutathion (GSH) 28. Het onderhoud van GSH in de linker en middelste lobben van de lever geïnjecteerd met PEG-SOD verder versterkt het beschermende effect van PEG-SOD. Bovendien is aangetoond dat er een toegenomen gesplitst caspase-3, een product van apoptose, in het weefsel blootgesteld aan ischemie-reperfusieschade. De daling van gesplitst caspase-3 in de linker kwab bij behandeling met PEG-SOD suggereert dat PEG-SOD leidt tot een afname in apoptose.
Superoxide dismutase (SOD) is een essentieel enzym in de detoxificatie van reactieve zuurstofsoorten. Het enzym katalyseert de omzetting van beide superoxide anionen tot waterstofperoxide en water. Het enzym catalase zet dan waterstofperoxide in water en zuurstof volledig met behulp 25. De halfwaardetijd vannatief SOD beperkt het gebruik ervan in experimentele modellen tot de ontwikkeling van geconjugeerde polyethyleenglycol-superoxidedismutase (SOD-PEG). Conjugatie van SOD polyethyleenglycol verhoogt de halfwaardetijd van 6 min tot 14 h. Nguyen et al. aangetoond in staat te lipideperoxidatie milderen hepatische ischemie bij een rattenmodel gebruikt systemische afgifte 29.
Er zijn een verscheidenheid van mogelijke wijzigingen van de techniek hier beschreven en sommige zijn eerder beschreven in de literatuur. Afhankelijk van het gebruikte model molecules zijn bezorgd via inhalatie 11, epidurale infusie 12, intraperitoneale injectie 17, 18, 21, 22, intraveneuze toediening 10, 14, 15
Er zijn een aantal cruciale stappen in dit protocol. De belangrijkste is de canule van de poortader. Zorg moet worden genomen dat het gat in de ader cut niet te groot is. Het weefsel is zeer elastisch en het gat te vergroten op zichzelf. We adviseren om te beginnen door het snijden van een gat dat is 0,5 mm met de microchirurgische schaar. De canule kan worden toegevoerd door de opening met een instrument waarmee een grotere flexibiliteit dan wanneer proberen om dit gedeelte van de procedure uit te voeren met de hand. Bovendien, terwijl aanvankelijk voeden van de canule, moet direct gericht op de vertakking van de linker en rechter poortaderen vermijden poking een gat in de achterwand van de ader. Wanneer de cannule tip de vertakking bereikt, kan vervolgens worden ingebracht in de linker ader specifiekebondgenoot. Zodra de canule in de vena linkerportaal, die zowel links als mediaan lobben levert wordt toegevoerd, kan de positie handmatig worden bevestigd door voelen in de ader. De positie kan ook worden bevestigd door het injecteren van een kleine hoeveelheid koude zoutoplossing en het zien van het blancheren effect op de bijgeleverde segmenten van de lever.
De lever hilaire klem bij ratten verschaft een reproduceerbare en stabiele platform voor het aantonen van hepatische ischemie-reperfusieletsel. Variabele hilaire clamp modellen zijn gebruikt door onderzoekers om de beschermende effecten van anti-oxidanten en andere kleine moleculen 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 bestuderen. Nuttige variaties omvatten welke vaartuigen zijn clamp ed, welk segment ischemische worden gemaakt, ongeacht of de galwegen wordt opgenomen en de duur van de periode van reperfusie 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Bovendien, als dit model wordt gebruikt om het effect van toediening van een molecule de toedieningsweg bestuderen ook heterogeen 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Er zijn verschillende voordelen van de beschreven aanpak. Ten eerste directe canulatie van het portaal levering aan de ischemische segment staat een rechtstreekse segmentale hepatische afgifte van de farmacologische stof bestudeerde. Hierdoor kan het gebruik van andere lobben van de lever als een interne controle. Ten tweede, segmentale hepatische cannulatie zorgt voor een verminderde verdelingsvolume van het molecuul bestudeerd. Deze benadering vermindert daardoor het risico op systemische bijwerkingen de stof wordt direct geïnjecteerd in de lever interessante segment. direct canulatie van de lever segment zorgt voor de stof af te geven pre-ischemie, Intra-ischemie of post-ischemie. Dit zorgt voor een studie van het effect van het molecuul op elk punt in de ischemie-reperfusie letsel cyclus. Met de toegenomen lengte van de ischemische en een hogere mate van letsel extra mogelijkheid op de leverregeneratie studeren beschikbaar zou zijn.
Er zijn ook enkele beperkingen van deze aanpak. De eerste is de start-up kosten. De aankoop van een chirurgische microscoop kan een belangrijke start-up kosten voor een lab dat niet reeds men bezitten. Deze techniek kan het moeilijk of onmogelijk zonder een microscoop. De tweede is de leercurve de tijd. Hoewel deze procedure is relatief eenvoudig is het vereist enige oefening en het is waarschijnlijk dat een beginner een aanzienlijk aantal procedures zal nodig hebben om een expert te worden.
Kortom, dit model zorgt voor een reproduceerbare, eenvoudig en kosteneffectief platform om de lever ischemie-reperfusie letsel te bestuderen. Hoewel in het protocol beschreven polyethyleen glycol-superoxide dismutase, een vrije radicaal scavenger 25, werd geïnfuseerd, kan dit model worden gebruikt om een verscheidenheid van verschillende farmacologische stoffen doordringen om hun effecten op I / R schade aan de lever te evalueren.
Disclosures
Alle auteurs melden dat ze geen mededelingen.
Acknowledgments
We willen graag Dennis Mathias erkennen voor zijn illustratieve werk. Dit werk werd ondersteund door NIH T32AI 106704-01A1 en T. Flesch Fund for Organ Transplantation, perfusie, Engineering and Regeneration aan de Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| 27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| GenieTouch | Kent Scientific | ||
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4 x 4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5 mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Other Instruments | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Mosquito Clamps | Generic | ||
| Analysis | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
| Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
| Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
| Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |
References
- Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
- Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
- Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
- OPTN. Overall by Organ. Current US Waiting List. , https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
- OPTN. Transplants in the US by Recipient ABO. , https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
- Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
- Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
- Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
- Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
- Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
- Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363 (2016).
- Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
- Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
- Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
- Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
- Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
- Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
- Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. , 601-607 (2015).
- Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. , 3196431 (2016).
- Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
- Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. , (2015).
- Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
- Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
- Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. http://www.biotek.com/assets/tech_resources/ROS%20White%20Paper.pdf 1-14 (2012).
- Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
- Carlberg, I., Mannervik, B.
- Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).
