Summary
En unik rottelever hilar klemme modell ble utviklet for å studere virkningen av farmakologiske molekyler ved forbedring av iskemi-reperfusjonsskade. Denne modellen inkluderer direkte kanylering av portalen tilførselen til den iskemiske leveren segmentet via en gren av portvenen, slik at for direkte hepatisk levering.
Abstract
Større hepatisk kirurgi med tilsig okklusjon, og levertransplantasjon, nødvendiggjøre en periode av varm ischemi, og en periode med reperfusjon som fører til iskemi / reperfusjon (I / R) skade med utallige negative konsekvenser. Potensiell I / R-skade i marginale organer bestemt for levertransplantasjon bidrar til den aktuelle donor mangel sekundært til en redusert organ utnyttelsesgrad. Et stort behov eksisterer for å utforske hepatisk I / R-skade for å mediere sin virkning på organfunksjon i transplantasjon. Rottelever hilar klem modeller blir brukt til å undersøke effekten av forskjellige molekyler på hepatisk I / R-skade. Avhengig av modellen, har disse molekyler er levert ved hjelp av inhalering, epidural infusjon, intraperitoneal injeksjon, intravenøs injeksjon eller injeksjon i den perifere mesenteriske vene. En rottelever hilar klemme modell er utviklet for bruk i å studere virkningen av farmakologiske molekyler i lindring av I / R-skade. den described modell for rottelever hilar Klemmen innbefatter direkte kanylering av portalen tilførselen til den iskemiske hepatisk segmentet via en sidegren av portvenen, slik at for direkte segmental hepatisk levering. Vår tilnærming er å indusere ischemi i venstre side og median fliker i 60 minutter, under hvilken tid substansen som studeres er tilført. I dette tilfellet, pegylert-superoksiddismutase (PEG-SOD), en fri-radikal scavenger blir infusert direkte inn i det ischemiske segmentet. Denne serie av forsøk viser at infusjon av PEG-SOD er beskyttende mot hepatisk I / R-skade. Fordelene ved denne tilnærming med direkte injeksjon av molekylet inn i det ischemiske segment med en derav følgende senkning i distribusjonsvolum og reduksjon av systemiske bivirkninger.
Introduction
Større hepatisk kirurgi med tilsig okklusjon, og levertransplantasjon, nødvendiggjøre en periode av varm ischemi, og en periode med reperfusjon som fører til iskemi / reperfusjon (I / R) skade 1. Konsekvensene av I / R-skade i leveren er blitt beskrevet i stor utstrekning 1, 2, 3. Konsekvenser av I / R-skade er beskrevet i litteraturen, omfatter: generering av reaktive oksygenforbindelser, initiering av den inflammatoriske kaskade inkludert aktivering av nøytrofile celler, Kupffer-celler og endotelceller, aktivering av hem oksygenase-systemet og aktivering av toll-lignende reseptorer, en ubalansen mellom endotelin og nitrogenoksid, aktivering av nukleær faktor-kB, og fremming av proinflammatorisk cytokin og adhesjonsmolekyl syntese 1, 2, 3. Disse pro-inflammatoriske hendelser kan lead til apoptose, nekrose, organdysfunksjon og eventuell organsvikt 3.
I / R-skade på organer bestemt for levertransplantasjon kan føre til tidlig tap av transplantat og bidrar til den aktuelle donor mangel som marginale organer er mer utsatt for skade 3. Det er for tiden 15,226 potensielle mottakere på venteliste for levertransplantasjon i USA 4 og bare 5950 levertransplantasjoner ble utført i 2015 fem. På grunn av denne ekstreme begrensning i organ tilgjengelighet, forskning utforsker lever I / R skade er nødvendig for å optimalisere organfunksjon og orgel utnyttelse.
Dyremodeller som brukes til å studere hepatisk I / R-skade er Rat hilar klem modeller og rottelever-transplantasjonsmodeller. Det finnes en rekke rotte hilar fastspenningsmodeller for tiden er i bruk. Den vanligste er en der portvenen, leverpulsåren og galle duct levere de venstre laterale og median fliker er fastspent ved hjelp av mikroklemmer 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 i 30 til 60 min 6, 7, 10, 13, 14, og deretter en periode av reperfusjon fra 60 min til 24 timer 7, 9, 10, 13, 14 er tillatt. I den venstre laterale og median fliker av rottelever omfatte omtrent 70% av leverparenkym 9. Noen protokoller som er utviklet for å studere ischemisk prekondisjonering omfatte periodisk klemming av hilar fartøyeneeller den bakbenet før en lengre periode med ischemi fremkalt ved sammenklemming av hilar fartøy 9, 13. Det finnes også flere modifikasjoner som er beskrevet i litteraturen. Den første er å klemme portvenen og leverarterien levere de venstre laterale og median fliker, men utelukker gallegangen 15. En annen modifikasjon er å indusere total hepatisk iskemi ved fastklemming av portvenen, rarterien og gallegang før deres inndeling 16, 17, 18, 19, 20. En tredje modifikasjon omfatter klemming av hilar fartøyer til høyre lapp i 30 til 60 min 8. En ytterligere modifikasjon omfatter klemming av vaskulære bunten i et bakben for å fremkalle skade på leveren 13, 21 figur 1A-D.
Rottelever hilar klem modeller har blitt anvendt for å studere effekten av forskjellige molekyler og forbindelser på hepatisk I / R. Avhengig av den modell som brukes i disse molekylene er blitt levert ved hjelp av inhalering 11, epidural infusjon 12, intraperitoneal injeksjon 17, 18, 21, 22, intravenøs administrering 10, 14, 15, 19, 23, 24 eller injeksjon i den perifere mesenteriske vene 8 .
Modellen for rottelever hilar klemme beskrevet i denne rapporten inklues direkte kanylering av portalen tilførselen til iskemisk segmentet via en sidegren av portvenen (figur 2), som gjør det mulig for direkte segmental hepatisk levering av farmakologisk forbindelse som studeres. Vår tilnærming er å indusere ischemi i venstre side og median fliker i 60 minutter, under hvilket tidsrom en infusjon av substansen som undersøkes, i dette tilfellet, pegylert-superoksid dismutase, en fri-radikal scavenger 25 blir infusert direkte inn i det ischemiske segmentet . Blodprøver tas før induksjon av ischemi og ved 120 minutter etter reperfusjon. På dette punkt, blir dyrene avlivet og sampler tas fra de venstre og median fliker. I tillegg ble prøver tatt fra den høyre flik for å tjene som en intern kontroll.
Det er mange fordeler med denne tilnærmingen. Først og fremst, når den farmakologiske substansen som studeres kan injiseres direkte inn i det ischemiske segmentet volumet of fordeling er ganske lav sammenlignet med volumet av fordelingen av injeksjon inn i den systemiske sirkulasjon eller bukhulen. I tillegg gir denne fremgangsmåten reduserer, men ikke eliminerer, muligheten for systemiske bivirkninger.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene fra Institutional Animal Care og National Research Council Veiledning for Humane Stell og bruk av forsøksdyr (IACUC) og har gjennomgått godkjenning av Ohio State University IACUC komiteen.
1. Innledende oppsett
- Oppsett kirurgisk mikroskop og operasjonsstuen (Figur 3, Figur 4). Slå på alt utstyr inkludert at for å opprettholde anestesi og overvåke vitale tegn. Slå på elektroenheten og oppvarming pad. Plasser infusjonspumpe nær operasjonsbordet.
- Utarbeide 10 ml flytende isofluran for inhalasjon (molekylvekt 184,5) i anestesi sprøyte og plassere den i anestesi enhet.
- Sett opp en 200 ml beholder med flytende nitrogen nær operasjonsbordet, og en annen nær sentrifugen hvor blodprøver vil bli behandlet.
- Position den kirurgiske instrumenter, 4-0 og 7-0 flettet silkesutur, sterilt bomullspinner, 4x4 ikke-vevet svamper, 5 ml sprøyter, og 27 måler insulinsprøyter nær operasjonsbordet.
- Klargjør isofluran kammeret og sørge for at tilstrekkelig isofluran er innpodet i anestesi induksjon leveringssystemet.
2. Induksjon av anestesi
- Før du tar rotta satt på følgende personlig verneutstyr (PVU): kirurgiske maske, kirurgiske hansker, og disponibel kappe.
- Vei rotte og registrere vekten.
MERK: bør brukes Sprague Dawley rotter. - Plasser rotte i anestesikammer og slå på isofluran og oksygen. Indusere anestesi med isofluran kammeret.
- Klips dyrets buk hår ved hjelp av en elektrisk hårklipper for å tillate renere eksponering (figur 5).
- Plasser dyret tilbake i isofluran kammer for et additional ett minutt. Utføre en tå klype for å kontrollere dybden av anestesi.
3. Prosedyre
- Plasser rotte med dyrets nese i den koniske nese og fire ekstremiteter immobiliserte med stoppere eller bånd på varmepute.
- Fortsett anestesi ved bruk av anestesi leveringssystem, nesekonus og isofluran med bedøvelse ved 3,6% for dyr som veier mellom 200 og 250 g og 4% for dyr som veier mer enn 250 g. Bekrefte anestesidybden ved å utføre en tå klemme og en hud klemme.
- Foreta en midtlinjen abdominalsnitt fra pubis til xifoid gjennom huden ved hjelp av en skarp saks (figur 6).
- Lag et snitt i bukhinnen langs linea alba fra pubis til xiphoid og skriv magen tar seg ikke å skade blæren eller tarmen. Som leveren også fester seg til peritoneum anteriorly nær xiphoid prosessen, å sikre at det frigjør før incising bukveggen i dette area.
- Foreta en tverrgående snitt gjennom huden og peritoneum på nivå med den nedre kant av den høyre flik av leveren.
- Snu anestesi ned til 1,6% for dyr som veier mellom 200 og 250 g og 2% for dyr som veier mer enn 250 g.
- Trekk xifoid prosessen ved hjelp av en buet pinsett.
- Sted ribbe sårhaker trekke ribbene så langt fra hverandre som mulig fra midtlinjen (figur 7). Skjær falciform, phrenic og mage leddbånd. Vend leveren opp med fuktede sterile bomullspinner.
- Skjær flere leddbånd som er nødvendig for å få tilgang til porta. Utføre visceral rotasjon med saltvann fuktet gas (figur 7).
- Fjern løst bindevev liggende portalen hilum bruke skarp eller stump disseksjon. Fjern løst bindevev liggende lengden på portvenen.
- Bruk pinsett til å presse gjennom den løse binde tproblemet posterior til venstre portvenen, arterie og gallegang lage et vindu og plassere 4-0 Potts sutur men ikke cinch ned (Figur 8).
- Klare av løst bindevev liggende den bakre gren til portalen blodåre som kommer inn på omtrent nivået av høyre nyre. Dette vene vil bli brukt for kanylering.
- Tegn 0,5 ml av blod ut fra den nedre vena cava (IVC) med en insulinsprøyte (figur 9). Plasser 0,5 ml blod i en liten ampulle, sentrifuger ved 135 xg i 12 min. Forsøk på å trekke ut serum.
- Hvis en distinkt linje ikke kan bli verdsatt mellom røde blodlegemer og serum, prøve å sentrifugere i ytterligere 2 - 3 minutter ved 135 x g. Tegn av serum og plasser i en ampulle for alanin-aminotransferase (ALT). Snap fryse denne prøven ved å anbringe den direkte i flytende nitrogen.
- Klipp to stykker av 7-0 sutur og sted i nærheten av venen som skal brukes for kanylesjon. Plasser først 7-0 sløyfe rundt denne vene så langt medial som mulig. Bind denne løkke og bruke den til å trekke tilbake ved hjelp av en buet pinsett (figur 10). Sett en annen 7-0 sløyfe på venen som skal brukes for kanylering nær skjæringspunktet med portvenen og plassere en uavgjort, men ikke cinch ned.
- Tilberede infusjonspumpe med en 5 ml sprøyte med 3 ml av reagens. Prime slangen.
- Spenn distale portalvenen ved hjelp av en mikroklemme.
MERK: Dette vil redusere blødning når venen blir radert for kanylering. - Skjær et 0,5 mm hull i venen i mellom 7-0 oppholdet sutur, og dens skjæringspunkt med den portvenen ved hjelp av små mikro saks. Bruk 27-0 kateter til cannulate venstre portvenesystemet (figur 11, figur 12). Sett kateteret forbi delinger av venstre og høyre portalen årer.
- Sjekk plassering av kanylen ved Infusing 1 ml av normal saltløsning og se for venstre side og median fliker i leveren til Blanch. Manuelt bekrefte at kateteret er forbi take-off av den rette portvenen, men ikke utover take-off av portvenen fôring median lapp.
- Cinch ned Potts sutur og begynne iskemi tid. Stram 7-0 sutur rundt venen og 27-0 kateter for å holde den på plass og fjerne klemmen fra den distale portvenen.
- Start av infusjonen av polyetylenglykol-superoksiddismutase (PEG-SOD, 0,00067 g / ml) ved hjelp av infusjonspumpe. Starte infusjonen så nært som mulig til starten av iskemisk tid.
4. Overvåking
- Fortsett å overvåke dyrets vitale hele infusjonen. Lever 2 ml 0,9% normal saltoppløsning eller 2 ml av PEG-SOD (0,00067 g / ml) oppløst i 0,9% normalt saltvann over en periode på 15 min.
5. Reperfusjon
- Tillat en time å gå fra begynnelsen av iischemiske tid. Dette er 1-h av varm ischemi tid.
- Fjern Potts sutur. Fjern 27-0 kateteret. Cinch ned 7-0 sutur rundt venen. Merk tiden. Dette markerer tidspunktet for reperfusjon.
6. Fortsatt Sampling
- Tegn 0,5 ml av blod ut av den IVC ved 120 minutter etter reperfusjon. Tegn blodet sakte for å unngå lysere røde blodceller. Langsomt dryppe blodet inn i en ampulle. Sikre at blødning fra IVC styres etter hver blodprøvetaking.
- Hvis det fortsetter å blø trykk forsiktig med en steril bomullspinne eller en liten 1 cm x 1 cm seksjon kuttet fra gasbind.
- Sentrifuger ved 135 xg i 12 min. Dersom tilstrekkelig separasjon ikke er oppnådd, prøve ytterligere 2 - 3 minutter ved 135 x g.
- Plasser halvparten av serumet i en ampulle for senere behandling for ALT. Snap fryse disse prøvene.
7. Avlivning
- Mens rottene fremdeles er under anestesi kutte IVC og superior vena cava (SVC) og overvåke til blodstrømmen, åndedrett og hjerteslag opphøre.
- Langsgående snitt i membranen og utføre en kort hepatektomi ved incising membranen i en sirkel og incising ytterligere bindevev som gjenstår å koble leveren til bukhulen. Fjern leveren fra bukhulen.
- Ta fire prøver fra venstre og median fliker av leveren og fire prøver fra høyre leverlapp. Prøvene bør være så stor som mulig, og deres størrelse vil være begrenset av mengden av tilgjengelig levervev. Plassere disse i små, merkede ampuller, og smekk fryse i flytende nitrogen. Bruke disse for senere behandling for vev adenosintrifosfat (ADP), malondialdehyd (MDA) og glutation (GSH).
8. Post-eksperiment Analyse
- Bestemme glutation (GSH), malondialdehyd (MDA) og alaninaminotransferase (ALT) aktivitet i levervevet og serumprøver ved bruk av diagnostiske kitsi henhold til produsentens instruksjoner.
- Homogenlevervevet med lyseringsbuffer og kvantifisere ved hjelp av en Bradford-analysen. Analyser vev lysat ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese og immunoblot ved anvendelse av antistoffer mot spaltede Capase-3 og aktin. Kvantifisere vestlige blotter utført med offentlig tilgjengelig programvare.
Representative Results
Dette forsøk ble utført med 2 grupper av n = 3 rotter hver. Tre rottelever ble injisert med 2 ml fysiologisk saltvann (NS) med infusjonspumpe over en periode på 15 min. Tre rottelever ble injisert med 2 ml fysiologisk saltvann (NS) blandet med pegylert-superoksiddismutase (PEG-SOD, 0,00067 g / ml) sammen med infusjonspumpe over en periode på 15 min. Som beskrevet i den ovennevnte protokoll, ble blodprøver tatt før hilar klemme og ved 120 minutter etter reperfusjon. I tillegg, etter fullføring av 120-minutters reperfusjon av fire lever vevsprøver ble tatt fra venstre og median knaster og fire leverprøver ble tatt fra den høyre flik av rottelever.
Serum (ALAT) ble målt pre-hilar klemme og ved 120 minutter etter reperfusjon i kontroll (NS) og eksperimentelle (PEG-SOD) dyr. Det var en signifikant forskjell mellom den ALT nivået av kontroll (NS)Dyrene forhånds hilar klemme og ved 120 minutter etter reperfusjon. Det var en signifikant forskjell mellom ALT nivået av kontroll (NS) og forsøksdyr (PEG-SOD) ved 120-min (Figur 13A). Tissue malonaldehyd (MDA) ble målt for kontroll (NS) og eksperimentelle (PEG-SOD) dyr i både høyre og venstre fliker i leveren. Tissue MDA i høyre lapp (ikke-hilar klemme) med kontrollinjeksjon (NS) og eksperimentell injeksjon (PEG-SOD) viser ingen signifikant forskjell. Venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) vev MDA med kontrollinjeksjon (NS) er signifikant forskjellig fra høyre lapp (non-hilar klemme) p <0,001. Venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) har vesentlig forskjellige nivåer av vev MDA med kontrollinjeksjon (NS) versus eksperimentell injeksjon (PEG-SOD) p <0,005 (figur 13B). Tissue glutation (GSH) ble målt og vev glutation i høyre lapp (ikke-hilar klemme) med kontrollinjeksjon (NS) ennd eksperimentelle injeksjon (PEG-SOD) viser ingen signifikant forskjell. Venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) vev GSH med kontrollinjeksjon (NS) er signifikant forskjellig fra høyre lapp (non-hilar klemme) med kontrollinjeksjon (NS) p <0,05. Venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) har vesentlig forskjellige nivåer av glutation vev med kontrollinjeksjon (NS) versus eksperimentell injeksjon (PEG-SOD) p <0,005 (figur 13C). Western blot ble utført sammenligne høyre og venstre flik av kontrolldyr og demonstrerer øket spaltet caspase-3 i den venstre lapp etter hilar klemme og reperfusjon (figur 13D). En andre western blot ble utført for å sammenligne de venstre fliker av dyr behandlet med kontroll og med PEG-SOD (figur 13E). Dette viser redusert spaltet for caspase-3 i levervev fra dyr behandlet med PEG-SOD. Densitometry ble også utført demonstrasjonenting at nivået av spaltet caspase-3 i levervev er betydelig økt i den til venstre i forhold til høyre flik av kontrolldyrene (figur 13F). Ved sammenligning av den venstre flik levervev hos forsøksdyr, infusert med PEG-SOD, og venstre flik levervev fra kontrolldyrene, fylt med normal saltløsning, demonstrerer densitometri signifikant redusert spaltet for caspase-3 hos dyr behandlet med PEG-SOD sammenlignet med dyr behandlet med kontroll (figur 13G).
Figur 1: Anatomiske illustrasjoner. A. Anatomisk illustrasjon av rottelever. B. Anatomisk illustrasjon av rottelever. Portalen pedicle til venstre og median fliker av leveren er festet. Venstre og median fliker er iskemisk. C. Anatomiskillustrasjon av rottelever. Portalen pedicle til venstre flik er fastklemt. Den venstre lapp er ischemisk. D. Anatomisk illustrasjon av rottelever. Portalen pedicle til høyre lapp klemmes fast og høyre lapp er ischemisk.
Figur 2: Anatomiske illustrasjoner. Anatomisk illustrasjon av rottelever med portalvenen ble kanylert via en sidegren. Portalen pedicle til venstre og median fliker av leveren er omgitt av en sutur og en microvessel klemme har blitt brukt til å stramme seg rundt den vaskulære bunten. Venstre og median fliker er iskemisk.
Figur 3: Instrument Set-up. Denne figuren viser th e instrumentoppsett.
Figur 4: Drifts Room Set-up. Denne figuren viser operasjonsstuen satt opp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Trimming av Abdominal Hair. Denne figuren viser trimming av mage hår. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
belastning / 54729 / 54729fig6.jpg"/>
Figur 6: Immobilisering og snitt i huden. Denne figuren viser immobilisering av rotte og huden innsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Rib Retractor Plassering og sløying. Denne figuren viser rib retractor plassering og sløying. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Place ment for sutur. Denne figuren viser plasseringen av sutur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Blood Draw fra vena cava inferior. Denne figuren viser blodprøvetaking fra vena cava inferior. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: Vein Branch bundet av og trekkes tilbake. Denne figuren viser vene gren bundet av og tilbaketrukket. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: Prosess kanylering. Denne figuren viser prosessen med kanylering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12: kanylering. Denne figuren viser kanylering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13: Representant Resultater: Direkte Segment Intrahepatisk Levering av pegylert-peroksyddismutase Ved hjelp av en rotte hilar Clamp Model. NS = vanlig saltvann. PEG-SOD = pegylert-superoksid dismutase, ALT = alanin-aminotransferase, MDA = malondialdehyd. A. Serum (ALAT, mU / ml) sammenlignet mellom pre-hilar klemme og 120 minutter etter reperfusjon. Det er en signifikant forskjell mellom kontroll (NS) pre-hilar klemme og kontroll (NS) ved 120 minutter etter reperfusjon (p <0,001). Det er også en signifikant forskjell mellom kontroll (NS) og eksperimentelle grupper (PEG-SOD) ved 120 minutter etter reperfusjon (p <0,05). En t-test ble brukt. Feilstolpene representerer standardavvik. B. Vevspreparering malondialdehyd i høyre lapp (ikke-hilar klemme) med kontrollinjeksjon (NS) end eksperimentelle injeksjon (PEG-SOD) viser ingen signifikant forskjell. Venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) vev malondialdehyd med kontrollinjeksjon (NS) er signifikant forskjellig fra høyre lapp (non-hilar klemme) p <0,001. Venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) har vesentlig forskjellige nivåer av vev malonaldehyd med kontrollinjeksjon (NS) versus eksperimentell injeksjon (PEG-SOD) p <0,005. En t-test ble brukt. Feilstolpene representerer standardavvik. C. Tissue glutathione i høyre lapp (ikke-hilar klemme) med kontrollinjeksjon (NS) og eksperimentell injeksjon (PEG-SOD) viser ingen signifikant forskjell. Venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) vev glutation med kontrollinjeksjon (NS) er signifikant forskjellig fra høyre lapp (non-hilar klemme) med kontrollinjeksjon (NS) p <0,05. Venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) har vesentlig forskjellige nivåer av glutation vev med kontroll injeksjon moln (NS) versus eksperimentell injeksjon (PEG-SOD) p <0,005. En t-test ble brukt. Feilstolpene representerer standardavvik. D. Western blot som viser teknologiens spaltet for caspase-3 i levervev fra venstre lapp (post-hilar klemme og reperfusjon) versus høyre lapp (ikke-hilar klemme) i kontrolldyrene (normal saltløsning). E. Western blot demonstrere redusert spaltet for caspase-3 i levervev fra dyr behandlet med PEG-SOD sammenlignet med dyr behandlet med kontroll (normal saltløsning). F. Nivå av spaltet caspase-3 i levervev er betydelig økt i post-hilar klemme og reperfusjon dyr (p <0,05). En t-test ble brukt. Feilstolpene representerer standardavvik. G. Ved sammenligning venstre flik levervev hos forsøksdyr (infusert med PEG-SOD) og venstre flik levervev fra kontrolldyrene (infusert med normal saltløsning), der er betydelig redusert spaltet for caspase-3 i enimals behandlet med PEG-SOD sammenlignet med dyr behandlet med kontroll (normal saltløsning). En t-test ble brukt. Feilstolpene representerer standardavvik.
Discussion
Denne serien av eksperimenter vist at injeksjon av PEG-SOD til venstre og median fliker førte til signifikant reduksjon i frigivelsen av ALT, lipidperoksidasjon av cellemembraner (MDA), og vedlikehold av glutation (GSH) sammenlignet med kontroller (normal salt ). Levervev naser inkludert Alaninaminotransferase (ALT) er etablert markører for hepatocellulær skade. Nedgangen i ALT når den venstre lapp er injisert med PEG-SOD antyder en beskyttende virkning av PEG-SOD. Økt vev MDA indikerer forøket lipidperoxidasjon og regnes som en markør for oksidativt stress og skade vev. Overproduksjon av reaktive oksygenforbindelser fører til en økning i produksjonen av MDA 26. Den betydelige reduksjonen i vev MDA i dyrets venstre og median fliker når de ble injisert med PEG-SOD viser en beskyttende effekt av PEG-SOD. Dette er i samsvar med gjeldende forståelse at PEG-SOD beskytter celler mot skaderforårsaket av delvis reduserte reaktive oksygenforbindelser 27. I tillegg, i nærvær av reaktive oksygenforbindelser, glutation disulfid redusert til glutation (GSH) 28. Vedlikeholds i GSH i venstre og median fliker av leveren injisert med PEG-SOD styrker ytterligere den beskyttende effekten av PEG-SOD. I tillegg er det vist at det er økt spaltet for caspase-3, et produkt av apoptose, i vev eksponert for ischemi-reperfusjonsskade. Reduksjonen i spaltede caspase-3 i den venstre lapp når de ble behandlet med PEG-SOD tyder på at PEG-SOD fører til en reduksjon i apoptose.
Superoksyd-dismutase (SOD) er et kritisk enzym i detoxication av reaktive oksygenarter. Enzymet katalyserer omdannelsen av to superoksydanioner til hydrogenperoksid og vann. Enzymet katalase omdanner deretter hydrogenperoksyd til vann og oksygen, fullfører prosessen 25. Halveringstiden avnativt SOD begrenset dets anvendelse i eksperimentelle modeller inntil utviklingen av konjugerte polyetylenglykol-superoksiddismutase (PEG-SOD). Konjugering av SOD til polyetylenglykol øker dets halveringstid fra 6 minutter til 14 timer. Nguyen et al. vist evne til å dempe lipidperoksidasjon i hepatisk iskemi i en rottemodell, ved hjelp av systemisk tilførsel 29.
Det finnes en rekke mulige modifikasjoner av teknikken beskrevet her, og noen har tidligere blitt beskrevet i litteraturen. Avhengig av modellen benyttet molekyler har blitt levert ved hjelp av inhalering 11, epidural infusjon 12, intraperitoneal injeksjon 17, 18, 21, 22, intravenøs administrering 10, 14, 15
Det er flere viktige skritt i denne protokollen. Det viktigste er kanylering av portvenen. Hensyn må tas at hullet skjæres i venen ikke er for stor. Vevet er meget elastisk og hullet vil forstørre på egen hånd. Vi anbefaler å starte ved å skjære et hull som er 0,5 mm med mikrokirurgiske saks. Kanylen kan føres gjennom hullet ved hjelp av et instrument, noe som gir større fleksibilitet enn om forsøker å utføre denne delen av fremgangsmåten for hånd. I tillegg, mens innledningsvis å mate kanylen, det bør være rettet direkte mot den delinger av de venstre og høyre portalblodårene for å unngå å stikke et hull gjennom bakveggen av venen. Når kanylen tuppen når forgreningen, kan det da bli matet inn i den venstre vene spesifikkalliert. Når kanylen føres inn i den venstre portalvenen, som leverer både til venstre og median fliker, kan dens stilling bekreftes manuelt ved å føle det inne i venen. Dets posisjon kan også bli bekreftet ved å injisere en liten mengde kald saltoppløsning og ser blekende effekt på de medfølgende deler av leveren.
Leveren hilar klemmen modell i rotte gir en reproduserbar og stabil plattform for å demonstrere hepatisk iskemi-reperfusjonsskade. Variable hilar klem modeller har blitt benyttet av forskere for å studere den beskyttende effekt av anti-oksidanter og andre små molekyler 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Punkter variasjon inkluderer hvilke fartøy klemme ed, hvilket segment er gjort iskemisk, hvorvidt eller ikke gallegangen er inkludert, og lengden av perioden for reperfusjon 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. I tillegg, når denne modellen blir anvendt for å studere virkningen av administrering av et molekyl av administreringsmåten er også heterogene 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Det er flere fordeler med den beskrevne fremgangsmåte. For det første, direkte kanylering av portalen tilførselen til den iskemiske segmentet tillater direkte segmental hepatisk levering av den farmakologiske substansen som studeres. Dette tillater utnyttelse av de andre fliker av leveren som en intern kontroll. for det andre, tillater segment hepatisk kanylering til et redusert volum av distribusjon for molekylet som studeres. Denne tilnærmingen reduserer derved faren for systemiske bivirkninger som substansen injiseres direkte inn i leveren segmentet av interesse. direkte kanylering av den hepatiske segmentet gjør det mulig for stoffet som skal avgis pre-ischemi, Intra-ischemisk eller post-ischemi. Dette gjør det mulig for studium av molekyl effekten på et hvilket som helst punkt i den ischemi-reperfusjonsskade syklus. Med økt lengde av ischemisk tid og forhøyet nivå av skade ytterligere mulighet til å studere leveren regenerering ville være tilgjengelig.
Det er også noen begrensninger av denne tilnærmingen. Den første er oppstart kostnader. Kjøp av et kirurgisk mikroskop kan være en betydelig oppstart kostnader for en lab som ikke allerede har en. Denne teknikken kan være vanskelig eller umulig uten et mikroskop. Den andre er å lære kurve tid. Selv om denne prosedyren er relativt enkelt det krever litt trening, og det er sannsynlig at en nybegynner vil kreve et betydelig antall prosedyrer for å bli en ekspert.
I sammendrag, tillater denne modellen for en reproduserbar, enkelt og kostnadseffektivt plattform for å studere hepatisk iskemi-reperfusjonsskade. Selv om det i den protokoll som er beskrevet her polyetylen glycol-superoksid dismutase, en fri-radikal scavenger 25, ble infusert, kan denne modellen benyttes til infusjon av en rekke forskjellige farmakologiske stoffer for å evaluere deres effekt på I / R-skade i leveren.
Disclosures
Alle forfatterne rapporterer at de ikke har noen avsløringer.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Dennis Mathias for sitt illustrerende arbeid. Dette arbeidet ble støttet av NIH T32AI 106704-01A1 og T. Flesch Fund for organtransplantasjon, Perfusjons, ingeniørfag og Regeneration ved Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| 27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| GenieTouch | Kent Scientific | ||
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4 x 4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5 mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Other Instruments | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Mosquito Clamps | Generic | ||
| Analysis | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
| Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
| Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
| Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |
References
- Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
- Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
- Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
- OPTN. Overall by Organ. Current US Waiting List. , https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
- OPTN. Transplants in the US by Recipient ABO. , https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
- Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
- Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
- Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
- Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
- Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
- Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363 (2016).
- Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
- Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
- Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
- Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
- Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
- Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
- Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. , 601-607 (2015).
- Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. , 3196431 (2016).
- Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
- Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. , (2015).
- Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
- Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
- Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. http://www.biotek.com/assets/tech_resources/ROS%20White%20Paper.pdf 1-14 (2012).
- Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
- Carlberg, I., Mannervik, B.
- Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).
