Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54750
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry, Durham University, 2School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University

Introduction

Peptoïden (of poly-N-gesubstitueerde glycines) zijn een klasse van peptide-nabootsingen die soortgelijke eigenschappen als peptiden bieden en als zodanig steeds onderzocht voor medicinale toepassingen en materialen. In peptiden, wordt de zijketen van elk aminozuur verbonden met de α-koolstof van de amide ruggengraat; peptoïden in de zijketens worden afgewenteld op het stikstofatoom van de hoofdketen. Cruciaal, dit geeft peptoids grotere weerstand tegen proteolyse.

Peptoïden worden gewoonlijk gesynthetiseerd met de submonomer methode ontwikkeld door Zuckermann et al., Waarbij peptoïde monomeren kunnen worden opgebouwd door opeenvolgende haloacetylation een aminefunctionaliteit gehecht aan een vaste drager en daaropvolgende verplaatsing van het halogeen met een primair amine. 1 Onze fractie heeft onlangs een aanpassing aan deze submonomer methode om lysine en arginine-type peptoïde residuen worden opgenomen in dezelfde peptoïde sequentie voor het first tijd. 2 Deze handleiding benadering vaste-fase synthese peptoïde gebruikt handel verkrijgbare middelen en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur, toegankelijk te maken voor de meeste laboratoria. Peptoïden is aangetoond veelbelovende activiteiten tegen een groot aantal gramnegatieve bacteriën, grampositieve bacteriën en schimmels soorten die vergelijkbaar met vele bekende antimicrobiële peptiden. 3-9

In ons werk hebben peptoids gebruikt als nieuwe anti-infectieuze verbindingen voor behandeling van verwaarloosde tropische ziekte leishmaniasis. 5,10 Leishmaniasis endemisch in meer dan 80 landen en er wordt geschat dat meer dan 12 miljoen mensen wereldwijd geïnfecteerd. 11 De ziekte wordt veroorzaakt door protozoaire parasieten die door de beet van een zandvlieg overgedragen. Leishmania soort kan cutane leishmaniasis, een aandoening die leidt tot littekenvorming en schade aan de slijmvliezen, of levensbedreigende viscerale toeg veroorzakenhmaniasis, die fataal orgaanschade veroorzaakt. Geen vaccin beschikbaar voor deze ziekte en bestaande behandelingen beroep op een beperkt aantal geneesmiddelen die ernstige bijwerkingen hebben. Bovendien resistentie tegen bestaande geneesmiddelen is een opkomende en ernstig probleem dat nieuwe behandelingen zijn hard nodig om effectieve behandeling van leishmaniasis in de toekomst. 12-16

In deze antimicrobiële toepassingen worden vaak ontworpen peptoids amfipathische met een mengsel van kationische en hydrofobe monomeren zijn. 3,4 Dit kan peptoïden een zekere mate van selectiviteit voor bacteriecellen, verminderen toxiciteit voor zoogdiercellen, en hun activiteit als moleculaire transporteurs verbeteren . 17-20 de meerderheid van de anti-infectieuze peptoïden in de literatuur bevatten kationische zij ketens die uitsluitend bestaan uit ofwel amino gefunctionaliseerde lysine-type monomeren of arginine-type residu. Peptide-peptoïde chimeren, waarbij de kationische ketens bestaan ​​van eenmino lysine of arginine, werden ook gesynthetiseerd om het effect van kationische groepen de activiteit of toxiciteit te onderzoeken. 21-25

Polylysine peptoïden kan eenvoudig worden gesynthetiseerd onder toepassing van in de handel verkrijgbare Boc-beschermde aminen. De poly-arginine peptoïden gerapporteerd kan worden uitgevoerd met een werkwijze die pyrazool-1-carboxamidine als guanidinylation hulpstof. 18 Dit kan echter alleen plaatsvinden nadat de peptoïde werd gesplitst van de hars en Boc bescherming aan zijketens verwijderd, zodat elke lysine-type resten in de sequentie wordt omgezet in een argininerest. In een poging selecteerbaar om chemische en biologische eigenschappen van de verbindingen, ontwikkelden we een methode die dubbele kationische functionaliteit (bijvoorbeeld N Lys en Arg N) op te nemen in een bepaalde peptoïde sequentie voor het eerst mogelijk maakt. 2

Hierin beschrijven we de synthese, zuivering en karakterisering van two nieuwe peptoïden die zowel lysine en arginine-type residuen in dezelfde volgorde bevatten. De werkwijze maakt gebruik van orthogonale N en N-Boc -Dde beveiliging op hars met pyrazool-1-carboxamidine als guanidinylation reagens. De biologische evaluatie van deze peptoids wordt ook beschreven in cytotoxiciteit bepalingen tegen Leishmania mexicana, de verwekker van cutane leishmaniasis. Dit verschaft een praktische methode om peptoïden met dubbele kationische functionaliteit en de biologische activiteit te beoordelen. Verwacht wordt dat deze werkwijze de synthese van amfipathische peptoids zal bevorderen via de peptoïde gemeenschap in de toekomst.

Protocol

1. Vaste-fase synthese van peptoïden

LET OP: peptoïden worden gesynthetiseerd handmatig met de submonomer werkwijze van vaste fase peptoïde synthese. Deze methode maakt het mogelijk hoge koppeling efficiëntie en goed eindproduct opbrengsten. Synthese op vaste fase laat ook overmaat reactanten gemakkelijk te verwijderen aan het einde van elke stap en de methode is hier aangepast om verschillende gefunctionaliseerde kationische monomeren (bijvoorbeeld, arginine-type en lysine-type residuen) laten vallen binnen dezelfde volgorde. 1,2

  1. Synthese van een lineair peptoïde
    Let op: Voer veiligheidsbeoordeling vóór het begin van de synthese. Voer alle reacties in een zuurkast en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zo nodig (dat wil zeggen, disposable nitril handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas). Wees vooral voorzichtig bij het gebruik van de volgende reagentia en oplosmiddelen. Dimethylformamide (DMF) is een vermoed teratogeen en dichloromethane (DCM) is een kankerverwekkende stof. N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) en piperidine gevaarlijk zijn voor de ogen, de huid, via de luchtwegen inademing en kan de huid gevoelig maken. Hydrazine is een verdacht carcinogeen, dodelijk bij inademing en veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid of ogen. Broomazijnzuur is ook gevaarlijk voor de huid, de ogen en de luchtwegen en kan brandwonden veroorzaken bij contact. Trifluorazijnzuur (TFA) is een vluchtige vloeistof en kan ernstige brandwonden veroorzaken dus wees voorzichtig. Heavy duty handschoenen worden aanbevolen.
    1. Voeg 0,12 g-Fmoc beschermd Rink Amide-hars (0,1 mmol, typische belading 0,7 mmol / g) een afgedekte 20 ml polypropyleen reactievat met twee frits. Voeg 5 ml dimethylformamide (DMF) om de hars te zwellen en laat het vat gedurende ten minste 60 minuten bij kamertemperatuur staan. Giet de DMF behulp van een vaste-fase extractie vacuüm platform.
    2. Om de Fmoc-groep op de gezwollen hars ontschermen, 2 ml piperidine-oplossing (20% in DMF v / v). Plaats het vat opeen schudplatform bij kamertemperatuur (450 tpm) en schud gedurende 5 min. Verwijder de oplossing via vacuümcentrale.
      1. Herhaal Fmoc ontscherming met 2 ml piperidine-oplossing en schud gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing als voorheen.
    3. Was de hars door toevoeging van 2 ml DMF en het mengen van de hars gedurende 30 sec. Giet de DMF en herhaal dit drie keer.
    4. Voor de acetylering, voeg 1 ml broomazijnzuur oplossing (0,6 M in DMF) en 0,2 ml N, N -diisopropylcarbodiimide oplossing '(DIC, 50% in DMF v / v). Laat reactievat te schudden gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie keer.
    5. Voor de verplaatsing, voeg 1 ml amineoplossing (1,5 M in DMF). Schud de hars gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie keer.
      1. Om een ​​arginine-type monomeer toe te voegen, volgt u stap 1.7. Afhankelijk van de gewenste sequentie peptoïde, verschillende aminenzal toegevoegd worden.
    6. Herhaal stap 1.1.4 en 1.1.5.
    7. Een guanidine gefunctionaliseerd monomeer (dat wil zeggen N Arg) omvatten, voeg 1 ml onbeschermde diamine-oplossing (1,5 M in DMF) aan de hars en schud gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
      1. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie keer.
      2. Voeg 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol in 0,5 ml DMF, 10 equivalenten) aan de Dde-groep aan de vrije primaire amine toe en schud gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie keer.
    8. Doorgaan submonomer synthese zoals in 1.1.4 tot 1.1.7, totdat de gewenste sequentie wordt gemaakt. Voeg 2 ml DMF aan het hars wassen en herhaal dit drie keer.
    9. Om de Dde groep hars bescherming te ontdoen, voeg 4 ml 2% hydrazine-oplossing (in DMF v / v) en schud gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en herhaal drie keer.
    10. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie tIMES.
    11. Add pyrazool-1-carboxamidine (6 equivalenten per vrije amine, dat wil zeggen per N Arg monomeren, in een minimale hoeveelheid DMF) en N, N-diisopropylethylamine of DIPEA (6 equivalenten per vrij amine) en schud bij kamertemperatuur gedurende 60 min .
    12. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml dichloormethaan drie keer. Laat het hars te drogen in de lucht gedurende 10 minuten wordt de hars kan worden opgeslagen tot splitsing (deel 2).
    13. De synthese onderbreken, was de hars met 2 ml DMF driemaal. Voeg 2 ml DMF, sluit de synthese vat en laat bij kamertemperatuur in een zuurkast.
      NB: De synthese kan worden onderbroken na een eventuele verplaatsing stap (met uitzondering van de tweede verplaatsing stap als diketopiperazines kunnen worden gevormd).
  2. Zijketen ontscherming en afsplitsing van hars
    1. Onderneem een ​​test aanhangen om de voortgang van de synthese (zuiverheid en massa) op elk moment tijdens de synthese na de displacement stappen, toevoeging of verwijdering van Dde-beschermende groep of na de laatste sequentie is gemaakt.
      1. Breng ongeveer 10 harskorrels uit het reactievat in een nieuwe 8 ml polypropyleen gefrit cartridge.
      2. Voeg 1 ml trifluorazijnzuur splitsing cocktail (met 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilaan) en schud gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Filter de TFA splitsing cocktail van de hars met behulp van de gefrit reactievat in een 10 ml rondbodemkolf.
      4. Damp de splitsing cocktail met een rotatieverdamper en de resulterende olie opnieuw op te lossen in 1 ml acetonitril / water voorgelegd aan LC-MS of analytische HPLC.
    2. Voor de uiteindelijke splitsing: dezelfde gefritte polypropyleen reactiemengsel cartridge gebruikt voor synthese, voeg 4 ml TFA klieving cocktail (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilaan) en bedekken het vaartuig. Schud gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
    3. filter the TFA splitsing cocktail van de hars met behulp van de gefrit reactievat in een 50 ml rondbodemkolf.
    4. Damp de splitsing cocktail met een rotatieverdamper. Nadat het TFA verwijderd is, moet het product worden verkregen als een olie. Om TFA verwijdering te helpen uit deze ruwe olie, voeg 2 ml watervrije diethylether en de peptoïde moeten neerslaan.
      1. Verwijder de diethylether via pipet en ontdoen of verdampen met een rotatieverdamper. Herhaal diethylether neerslag driemaal.
    5. Los de ruwe peptoïde in 10 ml acetonitril / water aangezuurde oplossing (50% acetonitril, 0,1% TFA in water v / v). Verwijzing naar een vooraf gewogen container, invriezen bij 20 ° C en lyofiliseren tot een droog poeder.

2. Karakterisering en Zuivering

OPMERKING: De peptoïde synthese kan worden gevolgd en de laatste peptoïde bepaald via analytische reverse-fase HPLC met een C18-kolom en electrospray vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). Alle HPLC oplosmiddelen oplosmiddelen voor LC-MS moet vers worden bereid.

  1. analytische HPLC
    1. Weeg 1 mg peptoïde in een klein glazen flesje. Voeg de minimale hoeveelheid acetonitril op te lossen en te verdunnen tot 1 ml met water. Zorg ervoor dat de peptoïde volledig is opgelost.
    2. Injecteer 10 pi analytische HPLC (voorgesteld gradiënt 0-100% solvent B gedurende 30 minuten, waarbij oplosmiddel A = 95% water, 5% acetonitril, 0,05% TFA en oplosmiddel B = 95% acetonitril, 5% water, 0,03% TFA) , volgens instructies van de fabrikant.
    3. Visualiseer UV-spectrum bij 220 nm.
  2. ESI LC-MS
    1. Voeg 1 mg / ml peptoïde oplossing volgens stap 2.1.1.
    2. Injecteer 1 ul tot elektrospray LC-MS om te bepalen of het molecuulgewicht van het doelwit peptoïde aanwezig is, volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Controleer het doelwit massa van de peptoïde sequentie met behulp van een Peptoid calculator, volgens de instructies op de rekenmachine. 26 Deze web tool maakt het ook mogelijk de toewijzing van eventuele schrapping / toevoeging producten te zien in de massa spectrum. 26
  3. Preparatieve reverse fase HPLC
    1. Lossen ruwe peptoïden in 2 ml aangezuurd water / acetonitril (95% water, 5% MeCN, 0,1% TFA) en zuiver door middel van preparatieve RP-HPLC met protocol van de fabrikant. Bepaal het verloop van de elutietijd verkregen van analytische HPLC en de geïnjecteerde zal afhangen van de kolomdimensies bedrag.
    2. Visualiseren met behulp van een detector ingesteld op 220 nm.
    3. Verzamel fracties in 15 ml centrifugebuizen invriezen bij 20 ° C en Lyophilize.
    4. Re-fracties te analyseren met behulp van LC-MS en analytische HPLC volgens het protocol van de fabrikant. Recombineren gezuiverde fracties.

3. Biologische Testen tegen Leishmania mexicana Parasieten

Cautie:. Veiligheid evaluaties moeten vóór het begin van de synthese worden uitgevoerd Leishmania mexicana is geclassificeerd als gevaarlijk groep 2 ziekteverwekker in de adequate controle maatregelen Verenigd Koninkrijk en moeten worden getroffen voor het begin van het testen. Alle werkzaamheden moeten in een klasse 2 veiligheid microbiologische kabinet en adequate persoonlijke beschermingsmiddelen gedragen als passend (dwz, nitril handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas) worden uitgevoerd.

  1. Subcultuur van parasieten
    1. Ontdooi 1 ml -150 ° C ingevroren voorraad Leishmania mexicana M379 door het plaatsen van flacon in een 37 ° C waterbad gedurende 30 sec.
    2. Breng de stockoplossing aan 10 ml Schneider Insect medium (pH 7,0 aangevuld met 15% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) in een 25 cm 3 celkweekkolf met een niet-ontluchtingsdop.
    3. Incubeer bij 26 ° C gedurende 72 uur.
    4. Onderzoek parasieten onder de microscoop (400X vergroting) om de conditie te controleren. they moet insect stadium promastigoten, procyclische vormen in de log-fase met veel delende cellen.
    5. Handhaaf procyclische promastigoten door sub-kweken parasieten tot een concentratie van 5 x 10 5 parasieten / ml om de drie dagen. Aantal cellen met een verbeterde Neubauer hemocytometer.
  2. Transformatie van L. mexicana insect podium in zoogdiercellen stadium axenic amastigoot formulier 27
    1. Dag 0: Bereid 10 ml kweek van log parasieten bij 5 x 10 5 parasieten / ml in Schneider's insectenmedium (bij pH 7,0 aangevuld met 15% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) in een 25 cm 3 cell kolf met een niet-ontluchtingsdop.
    2. Incubeer bij 26 ° C gedurende 48 uur.
    3. Dag 3: Breng 10 ml kweek aan een 50 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 447 xg gedurende 5 minuten.
    4. Giet oude medium en voeg 10 ml Schneider Insect medium (bij pH 5,5 aangevuld met 20% heet-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine). Voorzichtig resuspendeer de pellet van parasieten in het nieuwe medium met een pipet.
    5. Tel het aantal parasieten met een verbeterde Neubauer hemocytometer. Verdunnen tot een concentratie van 5 x 10 5 parasieten / ml bij pH 5,5 medium overgebracht in een 25 cm 3 celkweekkolf.
    6. Incubeer bij 26 ° C gedurende ongeveer 6 dagen.
    7. Dag 9: Onderzoek parasieten onder een microscoop (400X). Zij moeten in de niet-replicerende, infectieuze metacyclische promastigoot fase.
    8. Tel het aantal parasieten met een verbeterde Neubauer hemocytometer. Verdunnen tot een concentratie van 5 x 10 5 parasieten / ml bij pH 5,5 medium.
    9. Verwijder 10 ml van celkweek en over te dragen aan celkweek kolf. Incubeer bij 32 ° C gedurende 5 dagen.
    10. Dag 14: Controleer het uiterlijk van parasieten onder de microscoop (400X). Ze moeten in de pathogene amastigoot podium, zonder de flagellum karakteristic van promastigoten, en klaar voor de test.
  3. Cytotoxiciteit assay op L. mexicana axenic amastigoten.
    LET OP: De biologische testen van peptoids maakt gebruik van high-throughput testen in platen met 96 putjes uitgevoerd. Dit protocol beschrijft het testen van L. mexicana axenic amastigoten, maar identieke assays kunnen ook buiten op het podium promastigoot parasieten in geschikte media worden uitgevoerd. Verbindingen worden geïncubeerd met parasieten bij concentraties 3-100 pM voor 60 min en vervolgens gedurende 24 uur na een 10-voudige verdunning. Resultaten worden verkregen door het meten van de fluorescentie van putjes na incubatie met Resazurin gebaseerde oplossing levensvatbaarheid van de cellen (bijvoorbeeld AlamarBlue).
    1. Bereid verbinding voorraad oplossingen. Weeg 1 mg van het uiteindelijke gezuiverde peptoïde product met behulp van een analytische balans. Voeg de juiste hoeveelheid moleculaire biologie graad dimethylsulfoxide (DMSO) tot een concentratie van 5 mM. Maak 6 pi porties eninvriezen bij -20 ° C.
    2. Bereid samengestelde oplossingen 96 putjes (een aanbevolen plaatindeling te zien in de resultaten sectie, figuur 6) in drievoud 100-3 uM. Voeg 2 ul van 5 mM voorraadoplossing van elke verbinding in de bovenste rij (dat wil zeggen, A). Voeg 48 ul vers Schneider's insectenmedium (bij pH 5,5 en 20% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine (P / S)) naar bovenste rij een multi-kanaal pipet. Voeg 25 ul van Schneider Insect middellange tot alle andere rijen (B - F).
      1. Voer een seriële verdunning door pipetteren 25 pi oplossing uit de bovenste rij. Toe te voegen aan de rij onder en meng. Verricht verdunningen tot de laatste rij, waar de laatste 25 ul oplossing moet worden weggegooid.
      2. Gebruik amfotericine B (5 mM voorraad) als een positieve controle en DMSO (2% oplossing) als een negatieve controle in drievoud.
    3. Bereid parasiet oplossing: overdracht van cultuur in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeer bij447 g gedurende 5 min. Afgieten oude medium en voeg 10 ml Schneider's insectenmedium (bij pH 5,5 en 20% FBS, 1% P / S).
    4. Voorzichtig los de pellet van parasieten in het nieuwe medium met een pipet en tel met een verbeterde Neubauer hemocytometer. Verdun cultuur tot 8 x 10 6 parasieten / ml.
    5. Voeg 25 ul L. mexicana cultuur aan elk putje. Incubeer de platen gedurende 60 minuten bij 32 ° C.
    6. Verwijder plaat uit de incubator en verwijder 40 ul-oplossing van elk putje.
    7. Voeg 90 ul vers medium en incubeer gedurende 24 uur bij 32 ° C.
    8. Voeg 10 ul Resazurin gebaseerde cellevensvatbaarheid oplossing in elk putje. Incubeer gedurende 4 uur bij 32 ° C.
    9. Meet de fluorescentie met behulp van een plaatlezer (ex λ = 540 nm, em λ = 600 nm), volgens instructies van de fabrikant. Gegevens analyseren door verwijdering gemiddelde achtergrond (van alleen medium putjes) en het vergelijken van de fluorescentie van putjes in normaal naar tHij DMSO controles.

Representative Results

Als representatief resultaat, de synthese en karakterisatie van twee 12 residu peptoïden met twee lysine-type monomeren en tweewielige arginine monomeren elk zal worden beschreven. De volgende resultaten van cytotoxiciteit worden ook getoond.

Twee peptoïden [(N Narg N spe N spe) (N ae N spe N spe)] 2 (a) en [(N hArg N spe N spe) (N Lys N spe N spe)] 2 (b) werden gesynthetiseerd met behulp 120 mg Rink amide hars elke (belading = 0,79 mmol / g). Alle acetylering en verdringing stappen werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven, waarbij alle reagentia commercieel gekocht. Voor deze resten werden de volgende aminen toegepast bij de verdringingsstap: N spe (S) - (-) - α-methylbenzylamine, N ae N - (tert-butoxycarbonyl) -1,2-diaminoethane, N Lys N - (tert-butoxycarbonyl) -1,4-diaminobutaan. Voor de argininederivaat residu werden de volgende beschermde diaminen gekoppeld: N hArg 1,4-diaminobutaan of N Narg 1,2-diaminoethaan, gevolgd door on-hars beschermende 2-acetyldimedone (Dde-OH). Nadat de gehele sequentie was gesynthetiseerd, hydrazine ontscherming van de Dde geeft vrije aminen guanidinylate.

Figuur 1
Figuur 1. peptoïde structuren (a) [(N Narg N spe N spe) (ae N N N spe spe)] 2 en (b) [(N hArg N spe N spe) (N ng> Lys N spe N spe)] 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. De methode die wordt gebruikt om gemengde arginine / lysine peptoïden synthetiseren. I. Standaard verplaatsingsstap de submonomer methode diamine; ii. Toevoeging van Dde-OH, 90 minuten naar vrije amine te beschermen; iii. Verdere toevoegingen aan de peptoïde keten uit te breiden met behulp van de submonomer methode; iv. Ontscherming van Dde toepassing van 2% hydrazine in DMF; V. Guanidinylation vrije amine op hars met pyrazool-1-carboxamidine en DIPEA in DMF; vi. Zure klieving van de hars en ontscherming van Boc groepen.large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na afsplitsing van de hars en lyofilisatie werden de ruwe producten verkregen als een wit poeder: (a) 154 mg, (b) 163 mg. De producten werden gezuiverd door middel van RP-HPLC zoals beschreven maximum 50 mg injecties met een LC pomp met een UV-vis detector (λ = 250 nm) met een analytische kolom 250 mm x 10 mm, 5 urn; stroomsnelheid = 2 ml / min. Fracties overeenkomend met de doelmassa werden gecombineerd en verkregen als een wit poeder: (a) 54 mg (b) 65 mg, uiteindelijke opbrengsten van ongeveer 30% voor fracties> 90% zuiver.

De eindverbinding identiteit na zuivering werd bevestigd door LC-MS (zie figuur 3) met een drievoudige quadrupool massaspectrometer uitgerust met een UPLC en een fotodiodearraydetector. Nauwkeurige massa spectrometrie werd uitgevoerd met dezelfde spectrometer op t Hij [M + 2H] 2+ ionen. De volgende berekende en de waargenomen massa's werden gevonden in nauw overleg (figuur 4): (a) berekend = 896,0026 ame, waargenomen = 896,0038 ame; (B) berekend = 952,0691 ame, waargenomen = 952,0730 amu.

figuur 3
Figuur 3. LC-MS gezuiverd peptoïden. (A) m / z = 1792 en (b) m / z = 1903. Waar de top is TIC, midden LC-MS spectrum, onder UV chromatogram bij 220 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Nauwkeurige massaspectrometrie gegevens peptoïden (a) en (b)."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Product zuiverheid werd bepaald met analytische RP-HPLC (LC pomp met een UV-vis detector een analytische kolom, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 urn; stroomsnelheid = 1 ml / min), en gevisualiseerd op 220 nm, de absorptie amide ruggengraat. Figuur 5a en 5b blijkt dat de verbindingen homogeen.

figuur 5
Figuur 5. Analytische HPLC van het gezuiverde peptoïden (a) en (b). Er is een gradiënt 0-100% B over 30 minuten, kolomoven bij 40 ° C (A = 95% H2O, 5% MeCN, 0,05 % TFA;. B = 95% MeCN, 5% H2O, 0,03% TFA) Zoom click hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het gezuiverde peptoïden (a) en (b) getest in cytotoxiciteit bepalingen tegen L. mexicana axenic amastigoten. Bevroren voorraden van L. mexicana werden ontdooid en getransformeerd naar het amastigoot podium klaar voor de test. 72 uur na het ontdooien, moet de parasieten insect stadium promastigoten in hun procyclische vorm, in de log-fase met veel delende cellen. In dit stadium parasieten kunnen worden omgezet in de amastigoot fase met de pH en temperatuur verschuiving beschreven. 27 Op dag 9 van de transformatie, de parasieten in de niet-replicerende infectieuze metacyclische promastigoot fase. Tenslotte op dag 14, moet de parasieten in de pathogene amastigoot fase waarin parasieten niet de karakteristieke flagella van de promastigoten. 28

5 mM voorraadoplossingen van de verbindingen bereid in celkweekniveau DMSO en getest in drievoud opeen minimum van twee gelegenheden om een ​​robuuste dataset te garanderen werd verzameld. Een representatieve 96-well plaat is opgenomen in figuur 6. Aan het einde van de test, werd de cellevensvatbaarheid reagens aan elk putje en de fluorescentie toegevoegd werd gemeten zoals beschreven voor de levensvatbaarheid van parasieten bij elke geteste concentratie te berekenen (zie figuur 7 ). ED 50-waarden werden berekend als peptoïde (a)> 100 uM en peptoïde (b) respectievelijk 37 uM. De foutbalken uitgezet, tonen het verschil tussen putten als een standaarddeviatie en blijkt dat dit redelijk voor de meeste bars.

figuur 6
Figuur 6. Representatieve 96 wells plaat plan voor een cytotoxiciteit assay op 2 peptoïde-oplossingen (met inbegrip van positieve en negatieve controles). Med + = medium (Schneider's Insect Medium, pH 5,5, 20% FBS, 1% P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml parasiet cultuur in med +. AmphoB = 5 mM in DMSO. Peptoïde = 5 mM voorraadoplossing in DMSO. Lege putjes steriel water bevatten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. Resultaten van cytotoxiciteit assay tegen L. mexicana axenic amastigoot parasieten behulp peptoïde (a) en (b). Men kan zien dat de peptoïde (b) effectiever dan peptoïde (a) vermindering van het percentage van levensvatbare parasieten, zowel verbindingen met een dosisafhankelijk effect. De fout bars uitgezet tonen de variatie tussen putten als een standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Peptoïden steeds bestudeerd in de chemische biologie en medicinale chemie velden in toepassingen zoals nieuwe therapieën 3-5, mobiele bemiddelaars 18,20 en diagnostische gereedschappen. 29 Gewoonlijk zijn sequenties kationisch een zekere selectiviteit op voor de pathogeen zoogdiercellen, het vermogen om te penetreren door celmembranen en ook steun oplosbaarheid in waterige systemen. Er zijn talloze voorbeelden van kationische peptoids die uitsluitend lysine of arginine-nabootser residuen in de literatuur bevatten. Tot op heden, de synthese van peptoïden die beide kationische resten in dezelfde volgorde bevatten, is belemmerd door gebrek aan een geschikte syntheseprocedure. De hier beschreven protocol kan gemengd kationogene peptoïden worden gesynthetiseerd op een efficiënte wijze en is zeer gewenst omdat daarmee een route naar de biologische en chemische eigenschappen van amfipathische peptoids moduleren.

nt "> Onze methode wordt een aanpassing aan de gebruikte submonomer peptoïde synthese en maakt de toevoeging van zowel lysine en arginine-type monomeren in dezelfde volgorde. Het gebruikt kamertemperatuur koppelingen en gevestigde beschermende groep chemie zodat verwacht wordt dat deze werkwijze nuttig voor de meeste onderzoeksgroepen. Om orthogonale bescherming van het arginine-type residu toe te voegen, wordt een onbeschermde diamine toegevoegd onder standaard verplaatsing omstandigheden en beschermd in een 60 minuten koppeling met Dde-OH. verschillende diamines kunnen gebruikt die zijketens mogelijk maakt van 2 koolstofatomen tot 6 koolstofatomen lang te worden geïnstalleerd, dat wil zeggen 1,2-diamino tot 1,6 diaminohexaan respectievelijk. De beschermende Dde-OH goed oplost in DMF en is een zeer efficiënte en selectieve beschermende groep voor primaire aminen. de Dde-beschermingsgroep bladeren secundaire aminen beïnvloed, bijvoorbeeld de onbeschermde N-terminus van peptoïde keten. 30 Een beperking is dat alle van de syn-thesis werd met de hand gedaan; Echter wordt verwacht dat de ontwikkelde koppelingsomstandigheden maken de werkwijze vatbaar voor gebruik met geautomatiseerde peptide / peptoïde synthesizers.

De aan hars ontscherming van de Dde-groepen wordt uitgevoerd met behulp van 2% hydrazine in DMF oplossing om vrije amines die kunnen worden guanidinylated op hars met behulp pyrazool-1-carboxamidine verlaten. Zes equivalenten van het pyrazol-1-carboxamidine en zes equivalenten DIPEA gebruikt per vrije amine op het hars (bijv zes equivalenten per N Arg monomeertype worden geïnstalleerd). Nogmaals, deze reactie is ook efficiënt en het pyrazol-1-carboxamidine reagens goede oplosbaarheid in DMF. Voltooiing van de reactie wordt typisch gezien via LC-MS na 60 minuten bij kamertemperatuur.

Door de veelzijdigheid van de werkwijze submonomer, diverse primaire aminen kunnen worden toegepast bij de verdringingsstap dus voorwaarden moet worden geoptimaliseerd om koppeling effi vergrotenefficiëntie en de algehele product opbrengst of zuiverheid. 31 Voor de sequenties hierboven besproken, geen speciale voorwaarden waren nodig voor een succesvolle koppelingen. Er kon echter langere verplaatsing maal of hoger amine concentraties worden gebruikt voor problematische verplaatsingen (dat wil zeggen, voor slecht nucleofiele of sterisch volumineuze aminen). Sommige aminen kunnen niet volledig oplosbaar in DMF, in welk geval wordt aanbevolen om deze in N-methyl-2-pyrrolidon (NMP), of andere geschikte oplosmiddelen voor vaste-fase-reacties lossen plaats als in een eerder uitgebreide werkwijze voor synthese submonomer van peptoids. 32 monomeren die onbeschermd heteroatomen in de zijketens bevatten, acetylering met behulp chloorazijnzuur is effectief gebleken door andere groepen. 33 Daarnaast kunnen andere harsen worden gebruikt met deze methode peptoïden met verschillende C-terminale functionalisering verkregen. Wang harsen en 2-chloortritylchloride harsen worden gewoonlijk tersubmonomer synthese van peptoids. Zo is deze werkwijze met succes gebruikt met 2-chloortritylchloridehars in onze groep. 2 verschillende vaste dragers een ander laadprocedure eisen Rink Amide besproken (afhankelijk van de specifieke gebruikte hars), zodat dit moet worden gecontroleerd met de literatuur voorafgaand aan synthese.

Soortgelijke peptidesynthese, kunnen de voorwaarden voor uiteindelijke splitsing van de peptoïde uit hars worden geoptimaliseerd voor de specifieke sequentie. In dit protocol werd een TFA splitsing cocktail gebruikt (met triisopropylsilaan en water als aaseters). De peptoïden hier gepresenteerde bevatte slechts Boc bescherming die is een redelijk zuur labiele groep. Om volledige ontscherming van sequenties garanderen met een groter deel van beschermde residuen of minder zuur-labiele beschermende groepen, langere tijden splitsing noodzakelijk zijn (dwz splitsing tijden dan 2 uur worden aanbevolen voor sequenties die Pbf of tertiaire-bu bevattenTyl ester beschermde groepen). Alternatief scavengers kunnen ook worden gebruikt voor specifieke zijketens (bijvoorbeeld ethaandithiol of 2-mercaptoethanol worden vaak gebruikt in peptiden die zwavel bevattende zijketens zoals cysteine ​​en methionine hebben).

De biologische bepaling is voorgesteld een standaard cytotoxiciteit test die kan worden aangepast aan verschillende cellijnen te passen. Het is belangrijk op te merken dat elke 96-well plaat voldoende controles moeten bevatten om het vertrouwen in de bereikte resultaten mogelijk te maken. In dit geval wordt amfotericine B toegepast als een positieve controle omdat het een bekend geneesmiddel tegen de ziekte en DMSO wordt gebruikt als een negatieve controle aangezien dit het oplosmiddel waardoor verbinding voorraden maken voor de test. Als er andere cellijnen worden gebruikt, moeten alternatieve, passende controles worden verkregen en gevalideerd voor gebruik. L. mexicana wordt geïncubeerd met het peptoïde bij concentraties van 100 en 2 uM gedurende één uur, waarna de parasiet / peptoïde verdunning dooreen factor tien voor incubatie gedurende de nacht (bijv putjes aanvankelijk met 100 pM peptoïde voorraad worden verdund tot 10 uM).

De cellevensvatbaarheid reagens wordt aan elk putje toegevoegd (10% van de totale wellvolume) aan het einde van de test. Een zichtbare kleurverandering wordt gezien tussen de putten met levensvatbare parasieten (roze), controleputjes zonder levensvatbare parasieten (blauw) en een spectrum tussen met tussentijdse aantallen levensvatbare parasieten. De fluorescentie is evenredig met het aantal levende cellen en komt overeen met de metabole activiteit van de cellen; Resazurin kleurstof (niet fluorescerende) omgezet in de fluorescerende resorufine door reductie reacties in metabolisch actieve cellen. 34 Bij deze assay is de incubatietijd met de cellevensvatbaarheid reagens geoptimaliseerd voor L. mexicana. Incubatietijden met de levensvatbaarheid reagens varieert van platen gezaaid bij verschillende celconcentraties of met verschillende cellijnen (bijvoorbeeld kan deze methode ook worden gebruiktmet zoogdiercellen). Afhankelijk van de exacte plaatlezer gebruikt, moeten overwegingen worden gemaakt voordat fluorescentie metingen verricht. Eventuele luchtbellen in putjes verwijderd om nauwkeurige metingen kunnen worden genomen. Sommige plaatlezers lezen van de bodem van platen, waarbij platte bodem 96-putjesplaten worden gebruikt. Andere machines kan lezen uit de bovenkant van de plaat, zodat het deksel van de plaat moet worden verwijderd voordat de meting.

Tenslotte, in de toekomst dit protocol verenigbaar met geautomatiseerde synthesizers die in staat is om vele sequenties parallel bent. Bovendien is de synthese van cyclische peptoids is ook mogelijk met deze methode. Dit protocol dient onderzoekers met praktische synthetische procedure die kan worden gebruikt om nieuwe peptoïde scaffolds met zowel lysine en arginine-type monomeren, die van nut kan zijn in vele toepassingen, waaronder materialen of medicinale velden verschaffen.

Acknowledgments

Wij danken de Raad voor Onderzoek Techniek en Exacte Wetenschappen (EPSRC) voor financiële steun (HLB). We danken ook Sridevi Maalika Ramanoudjame voor haar hulp tijdens het filmen van deze procedure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits Crawford Scientific 12131017 and 12131015 20 ml and 6 ml cartridges used in this preparation
Trifluoroacetic acid Tokyo Chemical Industry (Europe) T0431-100g >98%; CAUTION: can cause severe burns and respiratory irritation
N,N'-diisopropylcarbodiimide Sigma Aldrich 38370-100ML >98%; CAUTION: hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation
Dimethylformamide Fischer Scientific 10346180 HPLC grade; CAUTION: suspected teratogen
Acetonitrile Fischer Scientific 10407440 HPLC grade
Dichloromethane Fischer Scientific 10354263 99.8%; CAUTION: suspected carcinogen
Bromacetic acid Sigma Aldrich 17000-100G >99%; CAUTION: causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine Sigma Aldrich 115568-100G 98%; CAUTION: harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer
N-Boc 1,4-diaminobutane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1373-25g >98%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer
N-Boc 1,2-diaminoethane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1371-25g >97%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer
1,2-diaminobutane Sigma Aldrich D13208-100G 99%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer
1,4-diaminoethane Sigma Aldrich 03550-250ML >99.5%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer
 
 
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl Sigma Aldrich 402516-10G as HCl salt; CAUTION: harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage
Hydrazine monohydrate Sigma Aldrich 207942-5G reagent grade; CAUTION: suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes
2-acetyl dimedone Novabiochem 8510150005 Dde-OH
Rink Amide resin Novabiochem 8551190005 100-200 mesh, high loading
Piperidine Sigma Aldrich 411027-1L >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION: highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781-50G 98%; CAUTION: flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation
alamarBlue ThermoFischer  DAL1025 Not classified as hazardous
Schneider's Insect Medium Sigma Aldrich S9895-1L Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays
96 well plates VWR 734-1793 Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated
Solvent reservoirs VWR 613-1182 Used with multi channel pipette
Multi channel pipette Eppendorf 3122000043
Pipette tips Starlab Group S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 Volume of tip dependent on pipette used. 10 µl, 10 - 200 µl and 1,000 µl recommended for assays
25 cm3 cell culture flasks VWR 734-2312
50 ml centrifuge tubes VWR 525-0791
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) Sigma Aldrich D8418-50ML Not classified as hazardous
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum ThermoFischer  10082139-100mL Gibco
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer  15140148-20mL Abbreviation: P/S
Amphotericin B Sigma Aldrich 46006-100mg Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).
  2. Bolt, H. L., Cobb, S. L. A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers. Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).
  3. Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother. , (2015).
  4. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).
  5. Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids. Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).
  6. Kapoor, R., et al. Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).
  7. Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi. Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).
  8. Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes. Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).
  9. Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents. Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).
  10. Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis. Med Chem Comm. , (2016).
  11. The World Health Organisation. Leishmaniasis. , Available from: http://www.who.int/leishmaniasis/en/ (2016).
  12. Chon, S. Y., et al. Antibiotic overuse and resistance in dermatology. Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).
  13. Alvar, J., et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLOS ONE. 7, (2012).
  14. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).
  15. Kedzierski, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today? J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).
  16. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).
  17. Huang, W., et al. Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity. PLOS ONE. 9, (2014).
  18. Wender, P. A., et al. The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).
  19. Schröder, T., et al. Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  20. Kömel, D. K., et al. Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains. Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).
  21. Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains. BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).
  22. Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR. Biochem. 48, 4587-4595 (2009).
  23. Andreev, K., et al. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).
  24. Foged, C., et al. Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides. BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).
  25. Vedel, L., et al. Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras. Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).
  26. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).
  27. Bates, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitol. 108, 1-9 (1994).
  28. Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).
  29. Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., et al. Comp Biomaterials. Ducheyne, P., et al. 2, Elsevier. 53-76 (2011).
  30. Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).
  31. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  32. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets. J Vis Exp. , e3373 (2011).
  33. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
  34. Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).

Tags

Biochemie peptoïde synthese arginine monomeer lysine monomeer amfipathische parasiet Leishmaniasis
Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S.… More

Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J. Vis. Exp. (117), e54750, doi:10.3791/54750 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter