Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En effektiv metod för syntes av Peptoider med blandad lysin-typ / Arginin-monomerer och utvärdering av deras anti-leishmanial aktivitet

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54750
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry, Durham University, 2School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University

Introduction

Peptoider (eller poly-N-substituerade glyciner) är en klass av peptid-härmare som erbjuder liknande egenskaper som peptider och som sådan är allt utreds för läkemedel och materialtillämpningar. I peptider, är sidokedjan av varje aminosyra kopplad till α-kolet av amiden ryggraden; i peptoider sidokedjoma skiftas på kväveatomen hos ryggraden. Avgörande ger peptoider större motståndskraft mot proteolys.

Peptoider vanligen syntetiseras med användning av submonomer metod uppfunnen av Zuckermann et al., Där peptoid monomerer kan byggas genom sekventiell haloacetylation av en aminfunktionalitet bunden till en fast bärare och efterföljande undanträngning av halogenen med användning av en primär amin. 1 Vår grupp har nyligen utvecklat en anpassning till denna submonomer metod för att tillåta lysin och arginin-typ peptoid rester att innefattas inom samma peptoid sekvensen för fFÖRSTA tid. 2 Denna handbok strategi fast fas för att peptoid syntes använder kommersiellt tillgängliga reagens och vanlig laboratorieutrustning, vilket gör den tillgänglig för de flesta laboratorier. Peptoider har visat sig ha lovande aktivitet mot ett brett spektrum av gramnegativa bakterier, grampositiva bakterier och svamparter som är jämförbara med många kända antimikrobiella peptider. 3-9

I vårt arbete har peptoider använts som nya anti-infektiösa föreningar för behandling av försummade tropiska sjukdomar leishmaniasis. 5,10 Leishmaniasis är endemisk i mer än 80 länder över hela världen och det uppskattas att över 12 miljoner människor är smittade över hela världen. 11 sjukdomen orsakas av protozoer parasiter som överförs genom bett av en sandfly. Leishmania arter kan orsaka kutan leishmanios, ett tillstånd som leder till ärrbildning och skador på slemhinnor, eller livshotande viscerala leishmaniasis, vilket orsakar dödlig organskada. Inget vaccin finns för närvarande för denna sjukdom och befintliga behandlingar förlita sig på ett litet antal läkemedel som har allvarliga biverkningar. Dessutom resistens mot befintliga läkemedel är ett växande och allvarligt problem så nya behandlingar desperat behövs för att effektivt behandla leishmaniasis i framtiden. 12-16

I dessa antimikrobiella tillämpningar används peptoider ofta utformade för att vara amfipatisk med en blandning av katjoniska och hydrofoba monomerer. 3,4 Detta kan ge peptoider en grad av selektivitet mot bakterieceller, minska toxicitet för däggdjursceller, och för att förbättra deras aktivitet som molekylära transportörer . 17-20 majoriteten av de antiinfektiva peptoider i litteraturen innehåller katjoniska sidokedjor som uteslutande är sammansatta av antingen amino- funktionaliserad lysin-typ monomerer eller arginin-typ rester. Peptid-peptoid chimärer, där katjoniska kedjorna består av enmino syror lysin eller arginin, har också syntetiserats att undersöka effekten av katjoniska grupper på aktivitet och toxicitet. 21-25

Poly-lysin peptoider kan lätt syntetiseras med användning av kommersiellt tillgängliga Boc-skyddade aminer. Poly-arginin peptoider rapporterade kan göras med hjälp av en metod som använder pyrazol-1-karboxamidin som en guanidinylation medel. 18 Detta kan dock endast ske efter det att peptoid har klyvts från hartset och Boc skydd på sidokedjor avlägsnas, så varje lysin-typ rest inom sekvensen omvandlas till en argininrest. I ett försök att finjustera de kemiska och biologiska egenskaperna hos föreningarna, har vi utvecklat en metod som gör det möjligt för dubbla katjonisk funktionalitet (t.ex. N Lys och N Arg) som skall ingå i varje given peptoid sekvens för första gången. 2

Häri beskriver vi syntesen, rening och karakterisering av TWo nya peptoider som innehåller både lysin och arginin-typ rester i samma sekvens. Metoden använder ortogonala N -Boc och N -Dde skydd på harts med pyrazol-1-karboxamidin som en guanidinylation reagens. Den biologiska utvärderingen av dessa peptoider beskrivs också i cytotoxicitetsanalyser mot Leishmania mexicana, det orsakande medlet av kutan leishmaniasis. Detta ger en praktisk metod för att komma åt peptoider med dubbla katjonisk funktionalitet och bedöma deras biologiska aktivitet. Det förväntas att denna metod kommer att hjälpa syntes av amfipatiska peptoider av peptoid samhället i framtiden.

Protocol

1. Fast-fas syntes av Peptoider

OBS: Peptoider syntetiseras manuellt med submonomer förfarandet för fast-fas peptoid syntes. Denna metod tillåter hög kopplingseffektivitet och goda slutliga produktutbyten. Syntes på fast fas gör det också möjligt överskott reaktanter för att lätt avlägsnas vid slutet av varje steg och metoden har modifierats för att tillåta olika funktionaliserade katjoniska monomerer (dvs., arginin-typ och lysin-typ rester) att innefattas inom samma sekvens. 1,2

  1. Syntes av en linjär peptoid
    Varning: Genomför säkerhetsanalyser innan syntes. Utför alla reaktioner i ett dragskåp och bär lämplig personlig skyddsutrustning som lämpliga (dvs engångs nitril, skyddsglasögon och en laboratorierock). Var särskilt försiktig när du använder följande reagens och lösningsmedel. Dimetylformamid (DMF) är en misstänkt fosterskadande och dichloromethane (DCM) är ett cancerframkallande ämne. N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) och piperidin är farligt för ögon, hud, via andnings inandning och kan orsaka hudsensibilisering. Hydrazin är ett misstänkt cancerframkallande, dödlig vid inandning och orsakar allvarliga brännskador på hud och ögon. Bromättiksyra är också farligt för hud, ögon och andningsvägarna och kan orsaka brännskador vid kontakt. Trifluorättiksyra (TFA) är en flyktig vätska och kan orsaka svåra brännskador så hantera varsamt. Kraftiga handskar rekommenderas.
    1. Lägg 0,12 g Fmoc-skyddade Rink amidharts (0,1 mmol, typisk laddning 0,7 mmol / g) till en utjämnade 20 ml polypropylen reaktionskärl med två frittor. Tillsätt 5 ml dimetylformamid (DMF) för att svälla hartset och lämnar kärlet för att stå i minst 60 minuter vid rumstemperatur. Dränera DMF med användning av en fast-fas-extraktion vakuum plattform.
    2. Att avskydda Fmoc-gruppen på det svällda hartset, tillsätt 2 ml piperidinlösning (20% i DMF v / v). Placera kärlet påen shaker plattform vid rumstemperatur (450 rpm) och skaka om under fem minuter. Ta lösningen via vakuumstationen.
      1. Upprepa Fmoc avblockering med 2 ml piperidinlösning och skaka i 15 minuter vid rumstemperatur. Töm lösning som tidigare.
    3. Tvätta hartset genom att tillsätta 2 ml DMF och blandning av hartset under 30 sek. Töm DMF och upprepa tre gånger.
    4. För acetyleringen, tillsätt 1 ml bromättiksyra-lösning (0,6 M i DMF) och 0,2 ml N, N '-diisopropylcarbodiimide lösning (DIC, 50% i DMF v / v). Lämnar reaktionskärlet för att skaka i 20 minuter vid rumstemperatur. Dränera lösningen och tvätta hartset med 2 ml DMF tre gånger.
    5. För förskjutning, tillsätt 1 ml av aminlösningen (1,5 M i DMF). Skaka hartset under 60 min vid rumstemperatur. Dränera lösningen och tvätta hartset med 2 ml DMF tre gånger.
      1. För att lägga till en arginin-monomer, följer steg 1,7. Beroende på den önskade peptoid sekvens, olika aminertillkommer.
    6. Upprepa steg 1.1.4 och 1.1.5.
    7. Om du vill inkludera en guanidin funktion monomer (dvs N Arg), tillsätt 1 ml oskyddad diamin lösning (1,5 M i DMF) till hartset och skaka i 60 minuter vid rumstemperatur.
      1. Dränera lösningen och tvätta hartset med 2 ml DMF tre gånger.
      2. Lägg 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol i 0,5 ml DMF, 10 ekvivalenter) för att lägga till den Dde-gruppen till den fria primära aminen och skaka i 60 minuter vid rumstemperatur. Dränera lösningen och tvätta hartset med 2 ml DMF tre gånger.
    8. Fortsätt submonomer syntes som i 1.1.4 till 1.1.7 tills den önskade sekvensen görs. Tillsätt 2 ml DMF för att tvätta hartset och upprepa tre gånger.
    9. Att avskydda den Dde-gruppen på hartset, tillsätt 4 ml 2% hydrazin-lösning (i DMF volym / volym) och skaka i 3 min vid rumstemperatur. Töm lösningen och upprepa tre gånger.
    10. Töm lösningen och tvätta hartset med 2 ml DMF tre tIME.
    11. Lägga pyrazol-1-karboxamidin (6 ekvivalenter per fri amin, dvs per N Arg monomerer, i minsta möjliga volym av DMF) och N, N-diisopropyletylamin eller DIPEA (6 ekvivalenter per fri amin) och skaka i rumstemperatur under 60 min .
    12. Töm lösningen och tvätta hartset med 2 ml diklormetan tre gånger. Låt hartset torka i luft under 10 minuter då hartset kan lagras tills klyvning (avsnitt 2).
    13. För att pausa syntesen, tvätta hartset med 2 ml DMF tre gånger. Tillsätt 2 ml DMF, tillslut synteskärl och låt stå i rumstemperatur i ett dragskåp.
      OBS: Syntesen kan pausas efter varje förskjutningssteg (utom det andra förskjutningssteget såsom diketopiperaziner kan bildas).
  2. Sidokedja avskyddning och klyvning från hartset
    1. Genomgår ett prov klyva för att kontrollera utvecklingen av syntesen (renhet och massa) när som helst under syntes efter displacement steg, tillsats eller avlägsnande av Dde-skyddsgrupp eller efter den slutliga sekvensen har gjorts.
      1. Överför ca 10 hartspärlor från reaktionskärlet in i en ny 8 ml polypropen frittad patron.
      2. Tillsätt 1 ml trifluorättiksyra klyvningscocktail (innehållande 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilan) och skaka i 90 minuter vid rumstemperatur.
      3. Filtrera TFA klyvnings cocktail från hartset med hjälp av sintrade reaktionskärl i en 10 ml rundbottnad kolv.
      4. Indunsta klyvningscocktail med användning av en rotationsindunstare och återupplösa den resulterande oljan i 1 ml acetonitril / vatten för att överlämnas till LC-MS eller analytisk HPLC.
    2. För den slutliga klyvningen: i samma frittat polypropen reaktionskassett som används för syntes, tillsätt 4 ml av TFA cleavage cocktail (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilan) och täcka kärlet. Skaka i 90 minuter vid rumstemperatur.
    3. filter the TFA klyvning cocktail från hartset med hjälp av sintrade reaktionskärl i en 50 ml rundkolv.
    4. Indunsta klyvnings cocktail med hjälp av en rotationsindunstare. Efter TFA har tagits bort, skall produkten som en olja. För att underlätta TFA avlägsnas från denna råolja, tillsätt 2 ml vattenfri dietyleter och peptoid ska fällas.
      1. Antingen avlägsna dietyletern via pipett och kassera eller förångas med hjälp av en rotationsindunstare. Upprepa dietyleter nederbörd tre gånger.
    5. Lös rå peptoid i 10 ml acetonitril / surgjord vattenlösning (50% acetonitril, 0,1% TFA i vatten, volym / volym). Överföring till en förvägd behållare, frys vid 20 ° C och lyofilisera till ett torrt pulver.

2. Karakterisering och rening

OBS: peptoid syntesen kan övervakas och den slutliga peptoid bedömas via analytisk omvänd fas HPLC med användning av en C18-kolonn och electrospray vätske kromatografi masspektrometri (LC-MS). Alla HPLC-lösningsmedel av lösningsmedel för LC-MS bör vara nyberedd.

  1. analytisk HPLC
    1. Väg 1 mg peptoid i en liten glasflaska. Lägga minsta möjliga volym acetonitril för att lösa upp och späd till 1 ml med vatten. Se till att peptoid har löst sig fullständigt.
    2. Injicera 10 | il till analytisk HPLC (förslagsvis gradient 0 - 100% lösningsmedel B under 30 min, och då lösningsmedel A = 95% vatten, 5% acetonitril, 0,05% TFA och lösningsmedel B = 95% acetonitril, 5% vatten, 0,03% TFA) , enligt tillverkarens instruktioner.
    3. Visualisera UV-spektrum vid 220 nm.
  2. ESI LC-MS
    1. Göra en mg / ml peptoid lösning som i steg 2.1.1.
    2. Injicera 1 il till elektrospraymasspektrometri LC-MS för att bestämma om molekylvikten av den avsedda peptoid är närvarande, med användning av tillverkarens instruktioner.
    3. Kontrollera målet massa peptoid sekvens med hjälp av en Peptoid räknare, enligt instruktionerna på räknaren. 26 Denna web verktyg kan också tilldelningen av eventuella radering / additionsprodukter ses i masspektrumet. 26
  3. Preparativ omvänd fas-HPLC
    1. Upplös rå peptoider i 2 ml surgjort vatten / acetonitril (95% vatten, 5% MeCN, 0,1% TFA) och rena med preparativ RP-HPLC med användning av tillverkarens protokoll. Bestämma gradienten av elueringstiden erhållen från analytisk HPLC och mängden injicerade kommer att bero på kolonndimensionerna.
    2. Visualisera med hjälp av en detektor inställd vid 220 nm.
    3. Samla fraktioner i 15 ml centrifugrör, frys vid 20 ° C och lyofilisera.
    4. Åter analysera fraktioner med användning av LC-MS och analytisk HPLC enligt tillverkarens protokoll. Rekombinerar renade fraktioner.

3. Biologisk testning mot Leishmania mexicana Parasiter

caution. Säkerhetsanalyser måste genomföras innan syntes Leishmania mexicana klassificeras en fara grupp 2 patogen i Storbritannien och lämpliga kontrollåtgärder måste vara på plats före start testning. Allt arbete måste utföras i en klass 2 mikrobiologisk säkerhetsbänk och lämplig personlig skyddsutrustning bäras som lämpliga (dvs. nitril, skyddsglasögon och en laboratorierock).

  1. Subkultur av parasiter
    1. Tina 1 ml -150 ° C fryst stam Leishmania mexicana M379 genom att placera ampullen i ett 37 ° C vattenbad i 30 sek.
    2. Överföra stamlösningen till 10 ml Schneiders Insect medium (vid pH 7,0 kompletterad med 15% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) i en 25 cm 3 cellodlingskolv med en icke-ventilerat lock.
    3. Inkubera vid 26 ° C under 72 timmar.
    4. Undersök parasiter under mikroskop (400x förstoring) för att kontrollera skick. they bör vara insektsscen promastigoter, procyclic former i log fas med många delande celler.
    5. Bibehålla procyclic promastigoter av under odling parasiter till en koncentration av 5 x 10 5 parasiter / ml var tredje dag. Räkna celler med användning av en Neubauer förbättrad hemocytometer.
  2. Transformation av L. mexicana insekt skede i däggdjurs skede axenisk amastigote blankett 27
    1. Dag 0: Bered 10 ml kultur av log scen parasiter på 5 x 10 5 parasiter / ml i Schneiders Insect medium (vid pH 7,0 kompletterad med 15% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) i en 25 cm 3 cell odlingskolv med en icke-ventilerat lock.
    2. Inkubera vid 26 ° C under 48 h.
    3. Dag 3: Överför 10 ml kultur till ett 50 ml centrifugrör och centrifugera vid 447 xg under 5 min.
    4. Häll bort gammalt medium och tillsätt 10 ml Schneiders insektsmedium (vid pH 5,5 kompletterad med 20% häter-inaktiverat fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin). Försiktigt resuspendera pelleten av parasiter i det nya mediet med hjälp av en pipett.
    5. Räkna antalet parasiter med användning av en Neubauer förbättrad hemocytometer. Späd till en koncentration av 5 x 10 5 parasiter / ml med pH 5,5 medium och överför till en 25 cm 3 cellodlingskolv.
    6. Inkubera vid 26 ° C under ungefär sex dagar.
    7. Dag 9: Undersök parasiter under ett mikroskop (400X). De bör vara i den icke-replikerande, infektiös metacyclic promastigote skede.
    8. Räkna antalet parasiter med användning av en Neubauer förbättrad hemocytometer. Späd till en koncentration av 5 x 10 5 parasiter / ml med pH 5,5 medium.
    9. Ta 10 ml cellkultur och överföring till cellodlingskolv. Inkubera vid 32 ° C under 5 dagar.
    10. Dag 14: Kontrollera utseendet av parasiter i mikroskop (400X). De bör vara i patogena amastigote skede, saknar flagellum karaktärtecknande för promastigoter, och redo för analys.
  3. Cytotoxicitetsanalys på L. mexicana axenisk amastigoter.
    OBS: Den biologiska testning av peptoider använder hög genomströmning analyser utförda i plattor med 96 brunnar. Detta protokoll beskriver testningen av L. mexicana axenisk amastigoter, men identiska analyser kan även utföras på promastigote scenen parasiter i lämpliga medier. Föreningarna inkuberas med parasiter vid koncentrationer från 3 - 100 | iM i 60 min och inkuberades sedan under 24 timmar efter en 10-faldig spädning. Resultat erhålls genom att mäta fluorescens brunnar efter inkubation med Resazurin-baserad cellviabiliteten lösning (t.ex. alamarBlue).
    1. Bereda sammansatta stamlösningar. Väg upp 1 mg av den slutliga renade peptoid produkten med en analytisk balans. Tillsätt en lämplig mängd av Molecular Biology Grade dimetylsulfoxid (DMSO) till en koncentration av 5 mM. Gör 6 il portioner ochfrys vid -20 ° C.
    2. Förbereda föreningslösningar på plattor med 96 brunnar (en rekommenderad plattslayouten kan ses i resultatdelen, figur 6) i tre exemplar 100-3 ^ M. Tillsätt 2 pl av 5 mM förrådslösning av varje förening i den översta raden (det vill säga, A). Lägg 48 | il färskt Schneiders insektsmedium (vid pH 5,5 och 20% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P / S)) till översta raden med användning av en multikanalpipett. Tillsätt 25 l Schneiders insekt medium till alla andra rader (B - F).
      1. Genomför en serieutspädning genom att pipettera 25 ul lösning från den översta raden. Lägg till raden nedanför och blanda. Utför utspädningar tills den sista raden, där den sista 25 pl lösning ska kasseras.
      2. Använda amfotericin B (5 mM lager) som en positiv kontroll och DMSO (2% lösning) som en negativ kontroll i triplikat.
    3. Förbered parasit lösning: överföring kulturen till en 50 ml centrifugrör och centrifugera vid447 xg under 5 min. Häll bort gammalt medium och tillsätt 10 ml Schneiders insektsmedium (vid pH 5,5 och 20% FBS, 1% P / S).
    4. upplösa försiktigt pellet av parasiter i det nya mediet med hjälp av en pipett och räkna med en Neubauer förbättrad hemocytometer. Späd kulturen till 8 x 10 6 parasiter / ml.
    5. Lägg 25 | il L. mexicana kulturen till varje brunn. Inkubera plattorna under 60 min vid 32 ° C.
    6. Ta plattan från inkubatorn och ta bort 40 pl lösning från varje brunn.
    7. Lägg 90 | il färskt medium och inkubera i 24 h vid 32 ° C.
    8. Tillsätt 10 l Resazurin-baserad cellviabiliteten lösning till varje brunn. Inkubera under 4 h vid 32 ° C.
    9. Mät fluorescensen med användning av en plattläsare (λ ex = 540 nm, λ em = 600 nm), enligt tillverkarens instruktioner. Analysera data genom att ta bort medelbakgrunds (från mediet endast brunnar) och jämföra fluorescensen av brunnarna efter normalisering med avseende på than DMSO kontroller.

Representative Results

Som ett representativt resultat, syntesen och karakteriseringen av två 12 peptoider rest innehållande två lysin-typ monomerer och två-arginin monomerer av var och en kommer att beskrivas. De efterföljande resultaten från cytotoxicitetsanalysen visas också.

Två peptoider [(N Narg N spe N SPE) (N ae N spe N SPE)] 2 (a) och [(N hArg N spe N SPE) (N Lys N spe N SPE)] 2 (b) syntetiserades med användning av 120 mg Rink amidharts varje (lastning = 0,79 mmol / g). Alla acetylering och förskjutningsstegen utfördes såsom beskrivits ovan, med alla reagenser som köps kommersiellt. För dessa rester, användes följande aminerna som används i undanträngningssteget: N SPE (S) - (-) - α-metylbensylamin, N ae N - (tert-butoxikarbonyl) -1,2-diaminoethane, N Lys N - (tert-butoxikarbonyl) -1,4-diaminobutan. För argininderivat rester framställdes följande oskyddade diaminer kopplad: N hArg 1,4-diaminobutan eller N Narg 1,2-diaminoetan, följt av on-harts skydd med 2-acetyldimedone (Dde-OH). Efter det att hela sekvensen hade syntetiserats, hydrazin avskyddande av Dde ger fria aminer att guanidinylate.

Figur 1
Figur 1. peptoid strukturerna (a) [(N Narg N spe N SPE) (N ae N spe N SPE)] 2 och (b) [(N hArg N spe N SPE) (N ng> Lys N spe N SPE)] 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Den metod som används för att syntetisera blandade arginin / lysin peptoider. I. Standard förskjutning steg i submonomer metod med diamin; ii. Tillsats av Dde-OH, 90 minuter för att skydda fri amin; iii. Ytterligare tillägg att förlänga peptoid kedjan med hjälp av submonomer metod; iv. Avskyddande av Dde med användning av 2% hydrazin i DMF; . V Guanidinylation fri amin på hartset med pyrazol-1-karboxamidin och DIPEA i DMF; VI. Sur klyvning från hartset och avlägsnande av Boc-grupperna.large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter klyvning från hartset och lyofilisering, var råprodukterna erhölls som vita pulver: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Produkter renades via RP-HPLC såsom beskrivits med högst 50 mg injektioner med hjälp av en LC pump med en UV-vis detektor (λ = 250 nm) på en analytisk kolonn, 250 mm x 10 mm, 5 pm; flödeshastighet = 2 ml / min. Fraktioner motsvarande mål-massan kombinerades och erhölls som vita pulver: (a) 54 mg (b) 65 mg, slutliga utbyten om cirka 30% för fraktioner> 90% rena.

Den slutliga föreningen identiteter efter rening bekräftades genom LC-MS (se Figur 3) med användning av en trippel kvadrupol masspektrometer utrustad med en UPLC och en fotodiodarraydetektor. Exakt masspektrometri genomfördes med hjälp av samma spektrometer på t han [M + 2H] 2+ joner. Följande beräknade och observerade massorna återfanns i nära överensstämmelse (Figur 4): (a) beräknad = 896,0026 amu, observerat = 896,0038 amu; (B) beräknas = 952,0691 amu, observerat = 952,0730 amu.

Figur 3
Figur 3. LC-MS för renade peptoider. (A) m / z = 1792 och (b) m / z = 1903. Där den övre är TIC, mitt LC-MS-spektrum, botten UV kromatogram vid 220 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Exakt massa uppgifter spektrometri för peptoider (a) och (b)."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Produkten renhet bestämdes med användning av en analytisk RP-HPLC (LC pump med en UV-vis detektor på en analytisk kolonn, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 ^ m; flödeshastighet = 1 ml / min), och visualiseras vid 220 nm, absorbansen amid ryggrad. Figur 5a och 5b visar att föreningarna är homogena.

figur 5
Figur 5. Analytisk HPLC för de renade peptoider (a) och (b). Det finns en gradient 0-100% B under 30 minuter, kolumn ugn vid 40 ° C (A = 95% H2O, 5% MeCN, 0,05 % TFA;. B = 95% MeCN, 5% H2O, 0,03% TFA) Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.

De renade peptoider (a) och (b) testades i cytotoxicitetsanalyser mot L. mexicana axenisk amastigoter. Frysta lager av L. mexicana var tinas och transformerades till amastigote skede redo för analysen. 72 timmar efter upptining bör parasiterna vara insektsscen promastigoter i sin procyclic form i log fas med många delande celler. I detta skede parasiterna kan omvandlas till den amastigote skede med hjälp av pH och temperatur skift beskrivits. 27 På dag 9 av omvandlingen kommer parasiterna vara i icke-replikerande infektiöst metacyclic promastigote skede. Slutligen vid dag 14, bör parasiterna vara i den patogena amastigote stadium där parasiter saknar den karakteristiska flag av promastigoter. 28

5 mM stamlösningar av föreningarna gjordes i cellkultur grade DMSO och testas i triplikat påminst två gånger för att säkerställa en robust uppsättning data uppsamlades. Ett representativt 96-brunnars platta planen visas i figur 6. Vid slutet av analysen, var cellviabiliteten reagens sattes till varje brunn och fluorescensen mättes såsom beskrivits för att beräkna viabiliteten av parasiter vid varje testad koncentration (se figur 7 ). ED50-värden beräknades som peptoid (a)> 100 ^ M och peptoid (b) 37 ^ M respektive. Felstaplarna plottas, visar variationen mellan brunnarna som en standardavvikelse och det kan ses att dessa är rimligt för de flesta barer.

figur 6
Figur 6. Representativa 96 brunnars platta plan för en cytotoxicitetsanalys på 2 peptoid lösningar (inklusive positiva och negativa kontroller). MEDIUM + = medium (Schneiders Insect Medium, pH 5,5, 20% FBS, 1% P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml parasit kultur i MEDIUM +. AmphoB = 5 mM i DMSO. Peptoid = 5 mM stamlösning i DMSO. Tomma brunnar bör innehålla sterilt vatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Resultat från cytotoxicitet mot L. mexicana axenisk amastigote parasiter som använder peptoid (a) och (b). Det kan ses att den peptoid (b) är mer effektiv än peptoid (a) till att minska den procentuella andelen livsdugliga parasiter, med båda föreningarna med en dosberoende effekt. De felstaplar uppritade visar variationen mellan brunnarna som en standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Peptoider alltmer studeras inom kemisk biologi och läkemedelskemi områden applikationer såsom nya behandlingar 3-5, cellleveransmedel 18,20 och diagnostiska verktyg. 29 Normalt är dessa sekvenser är katjoniska för att åstadkomma en grad av selektivitet för patogenen över däggdjursceller, förmågan att tränga igenom cellmembran och även underlätta löslighet i vattenbaserade system. Det finns många exempel på katjoniska peptoider som innehåller enbart lysin eller arginin-härmande rester i litteraturen. Men hittills, syntes av peptoider som innehåller båda dessa katjoniska rester i samma sekvens har hindrats av avsaknaden av en lämplig syntesförfarande. Protokollet som beskrivs här tillåter blandade katjoniska peptoider syntetiseras på ett effektivt sätt och är mycket önskvärt eftersom det ger en väg för att modulera de biologiska och kemiska egenskaper amfipatiska peptoider.

nt "> Vår metod använder en anpassning till den vanligen använda submonomer peptoid syntes och tillåter tillsatsen av både lysin och arginin-typ monomerer inom samma sekvens. Den använder rumstemperaturkopplingar och etablerade skyddsgrupp kemi så det förväntas att denna metod kommer att vara användbart för de flesta forskningsgrupper. för att lägga till ortogonalt skydd för arginin-typ-rest, är en oskyddad diamin tillsättes under standardundanträngningsbetingelser och sedan skyddas på ett 60 minuters koppling med Dde-OH. en mängd olika diaminer kan vara användas, som tillåter sidokedjor från 2 kolatomer till 6 kolatomer långa för att installeras, det vill säga, 1,2-diaminoetan till 1,6-diaminohexan respektive. skyddsgruppen Dde-OH upplöses väl i DMF och är en mycket effektiv och selektiv skyddsgrupp för primära aminer. den Dde-skyddsgrupp lämnar sekundära aminer opåverkade, t.ex., den oskyddade N-terminalen av peptoid-kedjan. 30 En begränsning är att alla av syn-Avhandlingen genomfördes manuellt, emellertid förväntas det att de kopplingsbetingelser som utvecklats göra metoden mottaglig för användning med automatiserade peptid / peptoid synthesizers.

Den på harts avskyddande av Dde-grupperna sker med hjälp av en 2% hydrazin-lösning i DMF för att lämna fria aminer som kan guanidinylated på harts med användning pyrazol-1-karboxamidin. Sex ekvivalenter av pyrazol-1-karboxamidin och sex ekvivalenter av DIPEA används per fri amin på hartset (dvs., sex ekvivalenter för varje N Arg monomertyp som ska installeras). Återigen är denna reaktion också effektiv och pyrazol-1-karboxamidin-reagens har god löslighet i DMF. Fullbordan av reaktionen typiskt sett via LC-MS efter 60 minuter vid rumstemperatur.

På grund av mångsidigheten hos submonomer metoden, kan ett stort antal olika primära aminer användas i undanträngningssteget så betingelser kan behöva optimeras för att öka kopplings effieffektivitet och övergripande produktutbyten eller renhet. 31 För de sekvenser som diskuterats ovan, inga särskilda villkor var nödvändiga för framgångsrika kopplingar. Emellertid kan längre förskjutningstider eller högre aminkoncentrationer användas för problematiska förskjutningar (dvs för dåligt nukleofila eller steriskt skrymmande aminer). Vissa aminer kan inte vara fullständigt lösliga i DMF, i vilket fall det rekommenderas att lösa dessa i N-metyl-2-pyrrolidon (NMP), eller andra lämpliga lösningsmedel för fast fas reaktioner i stället som i en tidigare omfattande metod för submonomer syntes av peptoider. 32 för att införliva monomerer som innehåller oskyddade heteroatomer i sidokedjorna, acetylering med användning av klorättiksyra har visat sig vara effektiva vid andra grupper. 33 Dessutom kan andra hartser användas med denna metod för erhållande av peptoider med olika C-terminala funktionalisering. Wang hartser och 2-klorotritylkloridharts hartser används rutinmässigt isubmonomer syntes av peptoider. Till exempel, har denna metod med framgång använts med 2-klorotritylkloridharts i vår grupp. 2 Olika fasta bärare kommer att kräva en annan laddningsförfarande till Rink Amide diskuteras här (beroende på den specifika använda hartset) så detta bör kontrolleras med litteraturen före syntes.

Liknar peptidsyntes, kan villkoren för slutlig klyvning av peptoid off hartset också optimeras för den specifika sekvensen. I detta protokoll, var en TFA klyvnings cocktail som används (med triisopropylsilan och vatten som scavengers). De peptoider som presenteras här endast innehöll Boc skydd som är ett rimligt syralabil grupp. För att säkerställa fullständig avblockering av sekvenser med en större andel av skyddade rester eller mindre syralabila skyddsgrupper, längre klyvnings gånger kan vara nödvändig (dvs klyvnings gånger överstigande 2 timmar rekommenderas för sekvenser som innehåller Pbf eller tertiär-butyll ester skyddade grupper). Alternativa scavengers kan också användas för specialiserade sidokedjor (t ex etanditiol eller 2-merkaptoetanol används ofta i peptider som har svavelinnehållande sidokedjor såsom cystein eller metionin).

Den biologiska analysen som presenteras är en standard cytotoxicitet test som kan ändras för att passa olika cellinjer. Det är viktigt att notera att varje 96-brunnsplatta bör innehålla tillräckliga kontroller för att tillåta förtroende för de erhållna resultaten. I detta fall, är amfotericin B som används som en positiv kontroll eftersom det är ett känt läkemedel som används för behandling av sjukdomen och DMSO användes som en negativ kontroll, eftersom detta är det lösningsmedel som används för att göra sammansatta bestånd för analysen. Om andra cellinjer används, bör alternativa, lämpliga kontroller erhållas och valideras före användning. L. mexicana inkuberas med peptoid vid koncentrationer mellan 100 och 2 pM i en timme, och sedan parasiten / peptoid lösningen utspädes genomen faktor tio för inkubering över natten (dvs brunnarna initialt med 100 | iM peptoid lager späds till 10 ^ M).

Cellviabiliteten reagens sätts till varje brunn (10% av den totala brunnsvolym) i slutet av analysen. En synlig färgförändring syns mellan brunnar med livsdugliga parasiter (rosa), kontrollbrunnar utan livsdugliga parasiter (blå) och ett spektrum mellan med mellanliggande antalet livskraftiga parasiter. Fluorescensen är proportionell mot antalet levande celler och motsvarar den metaboliska aktiviteten för cellerna; resazurin dye (icke fluorescerande) omvandlas till den fluorescerande resorufin genom reduktionsreaktioner i metaboliskt aktiva celler. 34 I denna analys har inkubationstiden med cellviabiliteten reagens optimerats för L. mexicana. Inkubationstider med viabiliteten reagens kommer att variera för plattor såddes vid olika cellkoncentrationer eller med olika cellinjer (t ex metoden också kan användasmed däggdjursceller). Beroende av den exakta plattläsare användes, överväganden måste göras innan fluorescensmätningar tas. Eventuella luftbubblor i brunnar bör tas bort för att säkerställa korrekta avläsningar kan tas. Vissa platt läsare läser från botten av plattorna, i vilket fall flatbottnade plattor med 96 brunnar bör användas. Andra maskiner kan läsas från toppen av plattan, så locket av plattan bör avlägsnas före mätningen.

Slutligen, i framtiden, kan detta protokoll vara kompatibel med automatiserade syntes som är kapabla att göra många sekvenser parallellt. Dessutom är även möjligt syntesen av cykliska peptoider med denna metod. Detta protokoll bör ge forskare med praktisk syntesförfarande som kan användas för att få tillgång till nya peptoid ställningar med både lysin och arginin-monomerer, som kan vara till nytta i många tillämpningar, inklusive material eller läkemedel fält.

Acknowledgments

Vi tackar Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) för finansiellt stöd (HLB). Vi tackar också Sridevi Maalika Ramanoudjame för hennes stöd under inspelningen av detta förfarande.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits Crawford Scientific 12131017 and 12131015 20 ml and 6 ml cartridges used in this preparation
Trifluoroacetic acid Tokyo Chemical Industry (Europe) T0431-100g >98%; CAUTION: can cause severe burns and respiratory irritation
N,N'-diisopropylcarbodiimide Sigma Aldrich 38370-100ML >98%; CAUTION: hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation
Dimethylformamide Fischer Scientific 10346180 HPLC grade; CAUTION: suspected teratogen
Acetonitrile Fischer Scientific 10407440 HPLC grade
Dichloromethane Fischer Scientific 10354263 99.8%; CAUTION: suspected carcinogen
Bromacetic acid Sigma Aldrich 17000-100G >99%; CAUTION: causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine Sigma Aldrich 115568-100G 98%; CAUTION: harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer
N-Boc 1,4-diaminobutane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1373-25g >98%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer
N-Boc 1,2-diaminoethane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1371-25g >97%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer
1,2-diaminobutane Sigma Aldrich D13208-100G 99%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer
1,4-diaminoethane Sigma Aldrich 03550-250ML >99.5%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer
 
 
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl Sigma Aldrich 402516-10G as HCl salt; CAUTION: harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage
Hydrazine monohydrate Sigma Aldrich 207942-5G reagent grade; CAUTION: suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes
2-acetyl dimedone Novabiochem 8510150005 Dde-OH
Rink Amide resin Novabiochem 8551190005 100-200 mesh, high loading
Piperidine Sigma Aldrich 411027-1L >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION: highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781-50G 98%; CAUTION: flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation
alamarBlue ThermoFischer  DAL1025 Not classified as hazardous
Schneider's Insect Medium Sigma Aldrich S9895-1L Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays
96 well plates VWR 734-1793 Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated
Solvent reservoirs VWR 613-1182 Used with multi channel pipette
Multi channel pipette Eppendorf 3122000043
Pipette tips Starlab Group S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 Volume of tip dependent on pipette used. 10 µl, 10 - 200 µl and 1,000 µl recommended for assays
25 cm3 cell culture flasks VWR 734-2312
50 ml centrifuge tubes VWR 525-0791
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) Sigma Aldrich D8418-50ML Not classified as hazardous
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum ThermoFischer  10082139-100mL Gibco
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer  15140148-20mL Abbreviation: P/S
Amphotericin B Sigma Aldrich 46006-100mg Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).
  2. Bolt, H. L., Cobb, S. L. A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers. Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).
  3. Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother. , (2015).
  4. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).
  5. Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids. Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).
  6. Kapoor, R., et al. Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).
  7. Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi. Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).
  8. Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes. Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).
  9. Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents. Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).
  10. Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis. Med Chem Comm. , (2016).
  11. The World Health Organisation. Leishmaniasis. , Available from: http://www.who.int/leishmaniasis/en/ (2016).
  12. Chon, S. Y., et al. Antibiotic overuse and resistance in dermatology. Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).
  13. Alvar, J., et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLOS ONE. 7, (2012).
  14. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).
  15. Kedzierski, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today? J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).
  16. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).
  17. Huang, W., et al. Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity. PLOS ONE. 9, (2014).
  18. Wender, P. A., et al. The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).
  19. Schröder, T., et al. Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  20. Kömel, D. K., et al. Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains. Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).
  21. Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains. BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).
  22. Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR. Biochem. 48, 4587-4595 (2009).
  23. Andreev, K., et al. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).
  24. Foged, C., et al. Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides. BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).
  25. Vedel, L., et al. Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras. Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).
  26. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).
  27. Bates, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitol. 108, 1-9 (1994).
  28. Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).
  29. Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., et al. Comp Biomaterials. Ducheyne, P., et al. 2, Elsevier. 53-76 (2011).
  30. Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).
  31. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  32. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets. J Vis Exp. , e3373 (2011).
  33. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
  34. Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).

Tags

Biokemi peptoid syntes arginin monomer lysin monomer amfipatisk parasit Leishmaniasis
En effektiv metod för syntes av Peptoider med blandad lysin-typ / Arginin-monomerer och utvärdering av deras anti-leishmanial aktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S.… More

Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J. Vis. Exp. (117), e54750, doi:10.3791/54750 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter