Abstract
非热大气压力（“冷”）等离子体已收到近几年越来越多的关注，由于其显著生物医学的潜力。冷等离子体与周围气氛的反应产生各种反应性物质，其可以定义其有效性。虽然冷等离子体疗法的高效发展要求的动力学模型，模型的基准需要的经验数据。在暴露于等离子体的水溶液检测反应性物质源的实验研究仍然很少。生物医学等离子体经常与他或Ar原料气操作，并且一个特定的兴趣在于通过与各种气体外加剂等离子体产生的反应性物种的调查（O 2，N 2，空气，H 2 O蒸气等 ）这样的调查是非常复杂的，由于在与等离子体流出物接触控制环境气氛的困难。在这项工作中，我们讨论'高'电压的共同问题kHz的频率驱动的等离子体射流实验研究。反应器被开发从而允许环境气氛的从等离子体 - 液系统的排除。因此，系统包括与外加剂和液体试样的组分的进料气体。这种受控气氛允许通过氦 - 水蒸气等离子体在水溶液中引起的活性氧源的调查。使用同位素标记水的允许起源于气相和物种的那些形成在液体之间进行区分。等离子体设备载法拉第笼子里，以消除任何外场的可能影响。安装程序是通用的，可以进一步了解冷等离子体液体相互作用的化学帮助。
Introduction
低温常压等离子体（LTPS）已经吸引了近几年越来越多的关注，由于其生物医学应用1-3的巨大潜力。当与周围大气接触，LTP与空气的分子含量反应（N 2，O 2，H 2 O蒸汽），产生各种活性氧和氮物种（RONS）2,4。在这些是相对稳定的物质（例如过氧化氢，臭氧，亚硝酸盐和硝酸盐阴离子）和高度反应性的自由基（•OH，•OOH / O 2• - ，•H，•NO 等 ）。这些物种中，在气相中最初生成，进一步通过等离子体递送至生物基板5。 RONS与底物相互作用，从而定义了抗菌，抗癌和LTP 6-8的抗病毒效果。
LTP疗法的发展要求的反应复杂的造型RONS 9。水是生物环境的一个重要组成部分，并在水相中的反应增加了系统的复杂性显着。通过使用各种分析技术，包括光学发射光谱学，激光诱导的荧光，红外光谱，质谱（MS）， 等等 10-12被广泛进行气相等离子体的调查。同时，在液相检测的物种的详细调查仍然很少。可用的报告描述了使用的各种分析方法，如紫外线和电子顺磁共振（EPR）波谱法，流式细胞仪等 ，为在水溶液13,14的检测RONS的。 EPR是用于在液体中自由基检测的最直接的方法之一。然而，许多自由基种不能由EPR由于其寿命短的时间进行检测。在这些情况下，自旋捕获经常被使用。自旋捕捉涉及化合物（旋转陷阱）的技术WHICH迅速且有选择地与自由基反应以产生更持久自由基的加合物（ 例如 ，DMPO与羟基自由基反应，形成DMPO-OH的加合物）。
在等离子液体相互作用研究的共同挑战是不能控制围绕等离子体流出物周围气氛及其它干扰因素（外场，环境敏感性电源部件等 ）。在这里，我们演示了如何使用由含有血浆工作和周围的等离子体射流喷嘴的内部建反应堆的金属网状的容器的安装程序。金属网作为法拉第笼，使显著改善再现性和等离子体喷射的一般的可操作性。在玻璃反应器中同时封装的等离子流和液体试样，不包括从系统周围大气中。
可用于与液体溶液接触的任何大气压等离子体喷射此方法。例如，我们最近提出暴露于等离子体的水溶液样品中检测到的活性氧源的调查。同位素被用来标记水形成在液体和在等离子体喷射液体溶液系统15的气相物种之间进行区分。
Protocol
1.屏蔽等离子设置
- 放置在笼子里面的电环境的所有部分：电源，电压/电流仪，电源线，等离子电极，等离子体射流等
- 确保轿厢内有足够的空间，使得活电极，接地电极和各电缆不与彼此或金属网接触。
- 装备笼与连接到等离子体电源，以避免从高电压电极电击的等离子体操作期间的风险的联锁。
- 放置保持器的外表面上的电压和频率控制，以允许参数的变化不中断等离子体操作。
- 地面全金属支持的网笼，并通过他们向布线接地插头粘接笼自身内部。
2.放电参数
- 接地电极下方Ø现场电极位置n中的玻璃管（ 即 ，更接近于管喷嘴）。
- 电压探头连接到等离子体电源来测量的工作电压，并通过圆形电流探头通过接地电极来监测返回电流。
- 两者的电压和电流探头连接到示波器，监测电流，电压和等离子体操作频率（通过电流或电压探针测定）。
- 设置气体通过玻璃管2 SLM使用质量流量控制器（流量控制器）的流动。
- 点燃等离子体中与进料气体氦穿过它通过打开的等离子体电源的玻璃管。从探针使用的读数，分别放电的电压和频率设置为18千伏和25千赫。
注意：参数变化被进行，以确定的最小电压和频率在该放电与所有实验中的最高分子含量存在。钍e增分子内容需要更高的电压为等离子体被点燃。注意，升高的电压可导致等离子体的显著气体温度增加，从而导致增加的液体试样的蒸发。 - 保持电压在所有实验不变。
3.引入外加剂原料气
- 第二MFC连接到使用一个T形连接器的主要进料气体管线。
- 添加的水蒸汽的原料气体，通过网笼的Drechsel烧瓶充满水和位于外侧（上顶或上侧）指示氦气的MFC调节流动。
- 通过分割进料气体的流动获得饱和的期望水平。气流（200sccm的）通过Drechsel烧瓶用水（H 2 16 O）的直接的10％，实现了进料气体的10％的饱和度。
- 使用T形连接器，结合这充分水蒸气饱和气体与的90％（1800 sccm）的干气流。
4.反应堆
- 制备由两部分组成，上和下的玻璃反应器中。装备的与排气管的下部。
- 该玻璃反应器在等离子体射流的喷嘴的位置。
- 插入等离子体喷嘴入在反应器的上部的开口内的橡胶索环。
- 准备在支架上的顶部由一般的良好贮存器的容器中。使两个支架和由电介质材料（ 例如 ，玻璃，石英玻璃）的井。
- 放置样品容器的反应器内，以便它暴露于从喷射的喷嘴的等离子体产生的废水。
- 把液体H 2 17 O样品的样品容器内。用于检测羟基自由基，使用5,5-二甲基-1- pyrroline- N-氧化物（DMPO）自旋阱中的溶液（见5.1）。
注：自旋阱的选择以及液体样品的选择玉米ponents取决于研究的具体种类。例如，•OH自由基的源使用H 2 16 O / H 2 17 O和DMPO自旋陷阱的研究。 •H基的源需要使用的H 2 O / D 2 O中（气体和液体）。1.叔丁基-α苯基硝酮（PBN）的应用于检测的•H基的。在他的情况下，用H 2 O蒸气等离子体，它被证明主要捕集氢基，而DMPO形成大多DMPO-OH的加合物15。 - 通过毛玻璃表面接触连接两个反应器部分。
5.自旋自由基捕获的
- 用所需浓度制备所选择的自旋捕集器的解决方案。对于水溶液，使用去离子水。对于硝酮自旋陷阱（如DMPO），使用100毫米的浓度。
- 预冲洗与原料气（2 SLM）的反应器中持续30秒。
- IGN伊特等离子体（见2.5）和暴露的液体试样向等离子体流出物的时间设定的时间（ 例如 ，60秒）。
- 所需的曝光时间后，关闭等离子体电源并打开反应器。从反应器中取出样品容器。
- 收集样品，并使用电子顺磁共振光谱法（EPR）15进行分析。
Representative Results
使用上述的方法和设备，我们已经调查了LTP系统中的活性氧的原点在与水接触。等离子体工作频率和电压分别为25千赫和18千伏（峰-峰），分别为（ 图1）。
例如，使用同位素标记的水，测定羟基自由基的来源。这使得从那些液体试样中的进料气中的水分子之间进行区分。对于这一点，H 2 16 O原料气（如蒸汽）的引入。的H 2 17 O与溶解的自旋陷阱DMPO的液体样品置于样品容器。将反应器的预冲洗用于与进料气体30秒。重要的是，在这种情况下，较长的预冲水的时间，可能会导致输送到H液的H 2 16 O大量
类似的研究可以使用其他系统，诸如D 2 O / H 2 O系统来检测•H（•D）的基15的源极来进行。
用于活性氧源的调查 图1 安装程序。在石英玻璃管（4-内径1毫米壁厚）与氦进料气体产生的等离子体。进料气流量为2的SLM。进料气体含H 2Ø蒸汽引入如上所述。 请点击此处查看该图的放大版本。
DMPO-H，DMPO- 16 OH和DMPO- 17 OH自由基加成物中的 H 2 17 DMPO的溶液引起 的混合物的图 2. EPR谱图 0照射等离子体。使用光谱模拟软件使用文献16提供的超精细值进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
使用EPR校正，得到表 1 DMPO- 16 OH 浓度 和DMPO- 17 OH自由基加成和H 2 16 O 2 17 O血浆曝光后样品 H液 量 。绝对数量加合物的浓度与稳定的自由基2，2,6,6-四甲基-1-氧基（TEMPO）。在不添加水蒸汽（条目1）的情况下，残留湿度为存在于原料气中使用的肉桂酰氯，得到的混合物在与等离子体曝光后溶液反应16 O-和17 O -肉桂酸的水解反应进行测定的H 2 17 O和H 2 16 O的液体样品中的相对量。如别处15中描述的所得混合物通过高分辨率质谱分析。
Discussion
在这里，我们演示了如何使用一个内部的内置常压等离子体设置的。金属网笼有助于实现与从外场最小化干扰通过任何等离子体诱导字段保护附近的敏感设备从可能的干扰和/或损坏可再现等离子体的条件下，在同一时间。设置的屏蔽（隔离罩）取决于操作等离子体和其电气特性的类型。这样做的目的是为了确保不存在在等离子体操作外部干扰，避免等离子体字段与周围设备的干扰。在这种情况下，网目尺寸为22毫米，然而，可能需要使用不同的等离子体减小目尺寸。使用电压和连接到示波器电流探测器的等离子体操作参数进行控制。引入高压探头的显著改变电环境，因此探针必须成为电气系统的一部分，并且被断定ioned贯穿所有实验中以同样的方式。
利用玻璃反应器中包封样品和等离子流的允许从反应体系经常未知组合物的环境气氛的排斥。于所呈现的结果（见上文），它被用来确定等离子体诱导的活性氧的暴露于等离子体流出物中的水样中的源。这种调查是可能的，如果液体水的分子，并在进料气体（蒸气）的水可以区别。以确定是否形成在气相或从液体水分子的羟基自由基，同位素标记的水被引入：H 2 17 O作为液体介质中，进料气体中的 H 2 16 O蒸汽。如果假设实验在一个开放的气氛中进行，这两个阶段之间进行区分会受到阻碍水蒸汽在周围空气中存在。一个减少周围大气的影响的替代方法被证明在文献中，在其使用的保护气体17防止从大气到等离子体流出物中的物质的扩散。保护气体（N 2 O 2）创建与已知成分18气帘。在这个手稿提出的反应器是一个简单的方法，以消除环境空气组分（如水蒸气）的影响，并且可以与不同的等离子体射流而不引入附加的气体流被使用。类似于•OH自由基的•水平的根本源可以通过使用D 2 O / H 2 O系统来确定。如上所述的廉价的D 2 O中，也可引入到进料气作为蒸气。
的气体用H 2 O蒸气饱和是由前称量Drechsel烧瓶中并鼓泡气流THROU之后确定GH它。的气体的相对湿度（ 即 ，饱和度）被蒸发的水的量和气体通过通过量计算出来。
需要注意的是在延长的试验中，在Drechsel烧瓶中的液体的温度可能会降低由于蒸发。相对湿度被计算为一个特定的温度。计算出的值与文献19进一步比较，以确定进料气体的相对湿度。我们已经凭经验发现通过一个充满水的Drechsel高达2 SLM氦的流烧瓶中完全用水蒸气饱和的气体。然而，升高的流速可能不允许气体的足够的停留时间在液体为完全饱和。其它饱和技术可能需要。
另一个挑战性的任务是确保没有周围的空气中存在的系统。与进料气体的反应器中的预冲洗以除去残留的空气。预冲洗所需的时间将取决于反应器的体积和进料气体的流动上。诸如氦进料气体等离子体系统没有外部环境空气的扩散和夹带到系统的可使用•NO自由基捕获反应进行测试。由选自N 2等离子体和O的空气的2分子生成的一氧化氮可通过EPR作为（MGD）2 Fe的自由基加合物2+络合物20（MGD = N-甲基-D-葡糖胺二硫代氨基甲酸）来检测。在完全不存在空气的情况下，加合物的EPR信号没有观察到。由于没有在反应器外部的水分子可以通过以下实验证明。 D 2 O中的液体样品暴露于干燥的进料气体等离子体。曝光后样品的NMR分析揭示了在曝光期间带入液体中氧化氢量。这允许估计在tubin残留的 H 2 O含量克用于在实验中的进料气体15。
样本容器的设计是在实验工作的关键。最初，我们用塑料和玻璃离心管未遂。具有相对高的等离子体的进料气体流一起，开口的小直径不让周围空气穿透离心管中。然而，这有许多缺点。等离子体显示拱和微量离心管的边缘附近大的温度上升。从气相到液体的种类的输送也显著效率较低由于不同的气相动力学和液体试样的低表面积（和体积大）。因此，液体样品的表面积是为反应性物质的递送从气相到液体样品是至关重要的。这是短命的基团特别重要。液体试样容器，因此必须设计成允许暴露液体具有用于高效的扩散的高表面积。样品也应具有低的深度，以减少液体试样的对流相关的限制。它必须考虑到该高架气体流量，特别是与点燃的等离子体在液体样品21的表面创建显著扰动帐户。因此，该样本容器具有直径和深度的具体实验所需要的井状形状。在其上以及位于支架的高度可以进行调整，以实验的需要。通过该等离子体射流插入反应器中的橡胶索环使得有可能改变与液体流出物的接触角。
所提出的方法允许反应性物质（•OH，•H 等 ）由一千赫频率并行字段等离子体喷射在液体诱导的源的调查。采用周围射流的玻璃反应器中的方法并不限定于图示ribed条件，也可以与其他大气压等离子体一起使用。该方法允许引入任何外加剂到进料气：水蒸气，O 2，N 2 等。在它的另一优点是导电里面光学测量的可能性，虽然在这种情况下，光学质量石英玻璃，必须使用作为反应器材料。在反应器的下部的排气管允许使用几乎任何实验室的等离子流：排气可通过塑料管被连接到一个远程抽油烟机。在反应器的概念是通用的，并且可以在需要控制的气氛不同等离子体的研究中使用。例如苯乙烯的聚合是由氧22抑制，但所用的反应器中可以观察到，当液体苯乙烯暴露于氦进料气体等离子体。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Resonant and Dielectric Barrier Corona Driver power supply | Information Unlimited | PVM500 | |
| Mass flow controller (MFC) | Brooks Instruments | 2 slm (He calib.) | |
| MFC | Brooks Instruments | 5 slm (He calib.) | |
| Microcomputer controller for MFCs | Brooks Instruments | 0254 | |
| H217O | Icon Isotopes | IO 6245 | |
| 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | D048-10 | ≥99% |
| 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl | Sigma-Aldrich | 214000 | 98% |
| Helium | BOC UK | 110745-V | 99.996% |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A | |
| Current probe | Ion Physics Corporation | CM-100-L | |
| Oscilloscope | Teledyne LeCroy | WaveJet 354A |
References
- Boxhammer, V., et al. Bactericidal action of cold atmospheric plasma in solution. New J. Phys. 14, 113042 (2012).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. J. Phys. D: Appl. Phys. 45, 263001 (2012).
- von Woedtke, T., Reuter, S., Masur, K., Weltmann, K. -D. Plasmas for medicine. Phys. Rep. 530, 291-320 (2013).
- Machala, Z., et al. Formation of ROS and RNS in Water Electro-Sprayed through Transient Spark Discharge in Air and their Bactericidal Effects. Plasma Proc. Polym. 10, 649-659 (2013).
- Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
- Takamatsu, T., et al. Microbial Inactivation in the Liquid Phase Induced by Multigas Plasma Jet. PLoS One. 10, 0132381 (2015).
- Ahlfeld, B., et al. Inactivation of a Foodborne Norovirus Outbreak Strain with Nonthermal Atmospheric Pressure Plasma. mBio. 6, 02300 (2015).
- Hirst, A., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Brit. J. Cancer. 112, 1536-1545 (2015).
- Norberg, S. A., Tian, W., Johnsen, E., Kushner, M. J. Atmospheric pressure plasma jets interacting with liquid covered tissue: touching and not-touching the liquid. J. Phys. D: Appl. Phys. 47, 475203 (2014).
- Greb, A., Niemi, K., O'Connell, D., Gans, T. Energy resolved actinometry for simultaneous measurement of atomic oxygen densities and local mean electron energies in radio-frequency driven plasmas. Appl. Phys. Lett. 23, 234105 (2014).
- Wagenaars, E., Gans, T., O'Connell, D., Niemi, K. Two-photon absorption laser-induced fluorescence measurements of atomic nitrogen in a radio-frequency atmospheric-pressure plasma jet. Plasma Sources Sci. Technol. 21, 042002 (2012).
- Abd-Allah, Z., et al. Mass spectrometric observations of the ionic species in a double dielectric barrier discharge operating in nitrogen. J. Phys. D: Appl. Phys. 48, 085202 (2015).
- Takamatsu, T., et al. Investigation of reactive species using various gas plasmas. RSC Adv. 4, 39901-39905 (2014).
- Uchiyama, H., et al. EPR-Spin Trapping and Flow Cytometric Studies of Free Radicals Generated Using Cold Atmospheric Argon Plasma and X-Ray Irradiation in Aqueous Solutions and Intracellular Milieu. PloS One. 10, e0136956 (2015).
- Gorbanev, Y., O'Connell, D., Chechik, V. Non-thermal plasma in contact with water: The origin of species. Chem. Eur. J. 22, 3496-3505 (2016).
- Spin Trap Database, National Institute of Environmental Health Sciences. , Available from: http://tools.niehs.nih.gov/stdb/ (2016).
- Schmidt-Bleker, A., Winter, J., Iseni, S., Rueter, S. Reactive species output of a plasma jet with a shielding gas device - Combination of FTIR absorption spectroscopy and gas phase modelling. J. Phys. D: Appl. Phys. 47, 145201 (2014).
- Schmidt-Bleker, A., et al. On the plasma chemistry of a cold atmospheric argon plasma jet with shielding gas device. Plasma Sources Sci. Technol. 25, 015005 (2015).
- CRC Handbook of Chemistry and Physics. Lide, D. R. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (1992).
- Tsuchiya, K., et al. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radic. Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Robert, E., et al. Rare gas flow structuration in plasma jet experiments. Plasma Sources Sci. Technol. 23, 012003 (2014).
- Allen, T. L. Oxygen inhibition of the polymerization of styrene. J. Appl. Chem. 4, 289-290 (1954).
