Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54767
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

زيكا فيروس (ZIKV) هو الممرض الناشئة التي يرتبط تشوهات النمو الجنين مثل صغر الرأس، وعيوب العين، وإعاقة النمو. ZIKV هو فيروس RNA من عائلة الفيروسات المصفرة. ينتقل ZIKV أساسا عن طريق البعوض، ولكن يمكن أيضا أن ينتشر عن طريق الأم إلى الجنين انتقال العدوى فضلا عن الاتصال الجنسي. حتى الآن، هناك أي علاج أو لقاح خيارات الموثوقة المتاحة لحماية المصابين بالفيروس. تطوير نظام استنساخه وفعال زيكا الفيروسات المعدية زراعة الخلايا أمر بالغ الأهمية لدراسة الآليات الجزيئية من تكرار ZIKV وكذلك الأدوية واللقاحات التنمية. وفي هذا الصدد، يتم الإبلاغ عن بروتوكول يصف في المختبر زيكا نظام الثدييات خلية القاعدة ثقافة الفيروس لتحليل الإنتاج والنمو الفيروسي هنا. يتم عرض تفاصيل عن تشكيل لويحات فيروس زيكا على أحادي الطبقة الخلية وفحص اللوحة لقياس عيار الفيروسية. حركية تكرار الجينوم الفيروسيويتم تحديد المزدوج تقطعت بهم السبل وسيطة replicatory RNA الجينوم. وقد استخدمت هذه المنصة الثقافة إلى الشاشة ضد مكتبة من مجموعة صغيرة من السيتوكينات مما أدى إلى تحديد الإنترفيرون α (IFN-α)، IFN-β وIFN-γ باسم مثبطات قوية من النمو الفيروسي زيكا. وخلاصة القول إن أظهرت وجود نظام في المختبر المعدية زيكا الفيروسي الثقافة ومختلف فحوصات الفيروسية في هذه الدراسة، والتي لديها القدرة على الاستفادة بشكل كبير من الأوساط البحثية في توضيح مزيد من الآليات المرضية الفيروسية وتطور الفوعة الفيروسية. فيروسات الإنترفيرون ألفا يمكن إجراء مزيد من التقييم باعتباره، بعد التعرض للقائي، وخيار العلاج الوقائي للعدوى فيروس زيكا في السكان المعرضة للخطر، بما في ذلك النساء الحوامل المصابات.

Introduction

زيكا فيروس (ZIKV) هو الممرض البشري المهم المرتبط صغر الرأس وضعف الحمل أدائهن 1،4. ZIKV ينتمي إلى مجموعة من flaviviruses ذات الصلة طبيا يمكن أن يسبب تشوهات عصبية مثل حمى الضنك وغرب النيل، والفيروسات التهاب الدماغ سانت لويس. الوسيلة الرئيسية لانتقال الفيروس هو من البعوض الناقل الزاعجة المصرية، وبالإضافة إلى ذلك، كما تم الإبلاغ عن الأمراض المنقولة جنسيا 5،6. أصبح ZIKV مشكلة صحية عالمية رئيسية بسبب التوزيع الجغرافي التوسع من البعوض الناقل للمرض وعلاقة قوية مع تشوهات خلقية. تم عزل ZIKV أولا في عام 1947 من قرد هندي صغير خفيرا في الغابة زيكا، أفيد أوغندا وأول حالة بشرية في عام 1952 7،8. الأفراد الذين يصابون بعدوى ZIKV الحاضر مع أعراض خفيفة مثل الحمى والطفح الجلدي، والصداع، والتهاب الملتحمة، والعضلات / آلام المفاصل. النساء الحوامل المصابات يمكن أن تنقل ZIKV إلى الجنين 1. Zكما تم ربط الإصابة IKV لمتلازمة غيلان باريه، والأعصاب الطرفية اضطراب المناعة الذاتية إزالة الميالين 9.

يتكون الجينوم الفيروسي زيكا من الشعور الإيجابي، جزيء RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل وهي عبارة عن 10.8 kilobases في الطول. ويتم تنظيم بنية الجينوم كما 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR، مع المناطق غير المشفرة (NCR) المرافقة منطقة ترميز البروتين 6. وترجم polyprotein واحد (3419 أأ) التي هي المشارك والمشقوق بعد translationally إلى 10 الببتيدات الصغيرة. كل من 5'NCR و3'NCR RNA الهياكل الجذعية حلقة تلعب دورا حاسما في بدء الجينوم ترجمة الفيروسية والتكرار. وتتألف المكونات الهيكلية للجينوم البروتينات قفيصة، غشاء، والمغلف. البروتينات غير الهيكلية حاسمة للنسخ المتماثل الجينوم.

حاليا، يتم تجميع زيكا السلالات الفيروسية إلى ثلاثة أنماط جينية رئيسية هي: غرب أفريقيا، شرق أفريقيا، وآسيا 6،10-13. وقد اقترح أن النسب شرق أفريقيا امتدت إلى غرب أفريقيا وآسيا، حيث أنه في وقت لاحق مزيد من تطور 12. وراثى الآسيوي هو المسؤول عن تفشي الحالية في الأمريكتين. زيكا الفيروس يمكن أن يكون مثقف في كل من البعوض وخلايا الثدييات. الخلايا الليفية الأولية عن طريق الجلد، والخلايا الجذعية غير الناضجة، والخلايا العصبية السلف القشرية، وخلايا فيرو عرضة للزيكا عدوى فيروسية 10،14،15. وقد أظهرت كل من النوع الأول والنوع الثاني إنترفيرون لتقييد نمو ZIKV في الخلايا الليفية الجلد 15. أهداف هذه الدراسة إلى تقديم، بروتوكول تدريجي مفصل لإنتاج ويعاير من النمط الجيني الآسيوية ZIKA السلالة الفيروسية PRVABC59 في نظام زراعة الخلايا الثديية وبيان فائدة هذا النظام الثقافة المعدية كمنصة تطوير العقاقير. هذا المورد لديه القدرة على الاستفادة بشكل كبير من الأوساط البحثية الفيروسي والعصبية زيكا لزيادة توضيح طآليات TS المرضية الفيروسية وتطور الفوعة الفيروسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: ويرد ملخص تخطيطي لتدفق العمل في الشكل 1.

1. الخلايا

  1. استخدام خلايا فيرو لإنتاج فيروس زيكا وتحليل دورة تكاثر الفيروس.
  2. إعداد وسائل الإعلام كاملة النمو التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتومايسين (100 وحدة / مل)، و 10 ملي HEPES.
  3. ثقافة خلايا فيرو مع متوسط ​​النمو الكامل المحدد عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

2. زيكا إنتاج الفيروسات

  1. حصاد الخلايا فيرو في كثافة الخلية 80٪ باستخدام 0.25٪ التربسين في T-75 قارورة وعدد الخلايا.
    1. نضح في وسائل الإعلام من الثقافة قارورة T-75 وشطف الخلايا مع 2 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
    2. إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين واحتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة 8 مل من مصل يحتوي على متوسط ​​النمو لإبطال نشاط التربسين. الماصة صعودا وهبوطا لسوسخلايا يعتمدون ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل.
    4. إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا وخلط مع كمية مساوية من 0.4٪ التريبان الأزرق. تحميل مزيج استعداد لالشريحة غرفة عد الخلايا والحصول على خلية قابلة للحياة التهم باستخدام عداد الخلية الآلي.
  2. البذور ما مجموعه 7 ملايين الخلايا في حجم 30 مل في قارورة T-160.
  3. في اليوم التالي، إعداد تعدد المناسب للعدوى (0،01-،1 وزارة الداخلية) من اللقاح فيروس زيكا في وسائل الإعلام ثقافة خالية 10 مل مصل في قارورة.
  4. إزالة وسائل الإعلام أمضى من القارورة T-160 ثم قم بإضافة اللقاح الفيروسي الطازجة (10 مل).
  5. احتضان قوارير تلقيح في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 4-6 ساعة. نشر اللقاح عن طريق إمالة بلطف قوارير جانبية في كل ساعة.
  6. عند الانتهاء من الحضانة، ويحل محل اللقاح مع وسائل الإعلام دافئ تستكمل المصل النمو (30 مل) من أجل كل قارورة. ثم تابع ثقافة الفيروسية للساعة 96 القادمة.
  7. تحقق من تطور فيالخمج (العدوى) من خلال مراقبة ظهور لويحات الفيروسية على أحادي الطبقة الخلية باستخدام النقيض المجهر المرحلة واتخاذ الصور (الشكل 2) حسب الحاجة في 40X و200X تكبير.

الشكل 2
الشكل 2: اللوحات التي شكلتها فيروس زيكا على أحادي الطبقة من الخلايا فيرو الصور الحقل مشرق للتكبير مختلفة تظهر زيكا لويحات الفيروسية في 48 HPI. لاحظ وجود بؤر خلية مدورة على أحادي الطبقة. (مقياس بار = 50 ميكرون) الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. حصاد supernatants ثقافة الخلية في نقطة زمنية 96 ساعة وأجهزة الطرد المركزي طاف في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلية.
  2. إزالة بعناية طاف دون الحطام مكعبات مقلق ونقل رس 15 مل أنابيب. تنبيذ فائق في 24000 x ج لا يمكن أن يؤديها لتركيز الجسيمات الفيروسية (اختياري).
  3. تخزين supernatants ثقافة الفيروسية في قسامات متعددة في -80 درجة مئوية.

3. قياس زيكا الفيروسات العيار الحجمي بواسطة البلاك الفحص

  1. البذور خلايا الفيرو ساذجة في 1 × 10 5 خلايا لكل بئر في 2 مل حجم باستخدام لوحة ال 12 أيضا.
  2. في اليوم التالي، وإعداد 10 أضعاف التخفيفات المسلسل من supernatants ثقافة الفيروسية التي تم جمعها من قارورة T-160 باستخدام وسائل الإعلام خالية من المصل. إزالة وسائل الإعلام أمضى من كل بئر وإضافة 400 ميكرولتر من اللقاح استعداد على خلايا فيرو في ثلاث نسخ.
  3. احتضان قوارير تلقيح في 37 ° C مع 5٪ CO 2 لمدة 4-6 ساعة. نشر اللقاح عن طريق إمالة بلطف لوحة جانبية في كل ساعة واحدة.
  4. في نهاية الحضانة، ويحل محل اللقاح مع وسائل الاعلام المصل تستكمل (2 مل لكل بئر).
  5. في 48 ساعة بعد التطعيم، والاعتماد على البؤر الفيروسية باستخدام مقاولات المرحلةأست المجهر. حساب عيار الفيروسية وحدات اللوحة تشكيل (PFU) لكل مل. انظر الشكل 3 لفحص اللوحة.
  6. إصلاح وصمة عار على الخلايا في 4٪ الفورمالديهايد و 0.1٪ محلول الكريستال البنفسجي أعدت في 20٪ من الإيثانول لتصور واضح لويحات.

الفحص 4. زيكا الفيروسي الجينوم النسخ المتماثل

  1. البذور خلايا الفيرو ساذجة في 1 × 10 5 خلايا لكل بئر في 2 مل مجلدات باستخدام لوحة ال 12 أيضا. في اليوم التالي، وإعداد قائح الفيروسي (وزارة الداخلية من 0.01 و 0.1، و 400 ميكرولتر / جيد) من انخفاض وارتفاع عيار باستخدام المصل وسائل الإعلام الحرة في ثلاث نسخ. للعدوى وهمية، واستخدام المصل وسائل الإعلام الحرة (400 ميكرولتر / جيد) فقط.
  2. كرر الخطوات 3،2-3،4.
  3. في نقطة زمنية 48 و 96 ساعة، وجمع عينات للRNA ومناعية (ICC).
    1. للحصول على عينات حصاد الحمض النووي الريبي، وإزالة وسائل الإعلام ثم إضافة 400 ميكرولتر من حل تحلل مباشرة إلى كل بئر وجمع لست].
    2. للمحكمة الجنائية الدولية، وإزالة وسائل الإعلام ورالدجاجة إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من الميثانول إلى كل بئر واحتضان لوحة عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. من المحللة الخلية، وعزل الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام عدة عزل الحمض النووي الريبي فقا لتعليمات الشركة الصانعة. قياس الحمض النووي الريبي باستخدام معمل.
  4. إجراء من خطوتين عكس النسخ الكمي PCR (RT-QPCR) لتحديد محتوى الجينوم ZIKV من الحمض النووي الريبي المقطوع.
    1. على عكس نسخ الحمض النووي الريبي، أولا إعداد مزيج رد فعل 13 ميكرولتر تتألف من 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي معزولة، 1 ميكرولتر من dNTPs (10 ملم)، و 1 مسدوس عشوائية ميكرولتر (250 نانوغرام) في أنبوب 0.2 مل. احتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم وضعه على الجليد لمدة دقيقة واحدة. وفي وقت لاحق، إضافة 1 ميكرولتر من الناسخ العكسي، 4 ميكرولتر من العازلة التوليف 5X حبلا، 1 ميكرولتر من 0.1 M dithiothreitol، و 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز المانع إلى مزيج التفاعل. احتضان الأنبوب لمدة 5 دقائق إضافية عند 25 درجة مئوية، تليها 60 دقيقة عند 50 درجة مئوية وinactivأكل رد فعل عن طريق التسخين إلى 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. أداء QPCR باستخدام 1 ميكرولتر من الناتج [كدنا] مع 12.5 ميكرولتر من الصبغة الخضراء 2X مزيج السوبر تحتوي على الحمض النووي بوليميريز و 1 ميكرولتر من 10 ملي الاشعال فردية معينة لفيروس زيكا [زيكا فيروس عموم الوراثي الاشعال (لل: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 " ؛ القس: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3)، زيكا فيروس الوراثي الآسيوية الاشعال PRVABC59 سلالة (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3 '؛ القس: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3')]، أو فيروس التهاب الكبد الوبائي (JFH RTQ F: 5 "CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3؛ JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3)، أو الخلوي GAPDH التدبير المنزلي الجينات (لل: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '؛ القس: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3") في حجم رد الفعل 25 ميكرولتر.
    3. أداء PCR باستخدام المدى حالة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (40 دورة) في نظام PCR الوقت الحقيقي.
    4. استخدام مستوى التعبير GAPDH بناء على عتبة دورة (CT) قيمة لتطبيع Zإيكا قياس الجينوم الفيروسي. حساب دلتا قيمة ط م (ΔCt) من زيكا الجينوم مقارنة بما كان عليه من GAPDH والحصول على قيمة 2 ΔCt. ثم، حساب التغير أضعاف بأخذ نسبة من تطبيع محتويات الجينوم زيكا بين الخلايا المصابة وغير المصابة في النقاط الزمنية المشار إليها. انظر الشكل 4 للحصول على نتائج تكرار ZIKV الجينوم.
  5. أداء المحكمة باستخدام خلايا الميثانول ثابتة.
    1. غسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X ومنع مع المحكمة عازلة تمنع (3٪ مصل الماعز، 3٪ BSA، 0.1٪ تريتون-× 100 في برنامج تلفزيوني).
    2. استخدام الماوس وحيدة النسيلة المضادة للالرنا المزدوج الجديلة الأجسام المضادة J2 (1 ميكروغرام / مل) في التخفيف من 1: 100 في عرقلة العازلة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    3. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة الضد الثانوية الماعز المضادة للماوس مفتش-594 (1 ميكروغرام / مل) في التخفيف 1: 1000 العازلة في الحجب واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X وصمة عار للنوى باستخدام هويشت صبغ ومراقبة الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت في التكبير 100X (الشكل 4).

5. فحص مكتبة خلوى ضد عدوى فيروس زيكا

  1. البذور خلايا الفيرو ساذجة في 1 × 10 5 خلايا لكل بئر باستخدام لوحة ال 12 أيضا. مرة واحدة يتم إرفاق الخلايا (6 ساعات بعد البذر)، إضافة كل خلوى في تركيزات مبين في التكرارات البيولوجية (2 مل حجم / جيد). تشمل المركبات (PBS) وحدها السيطرة.
  2. في 12 ساعة بعد العلاج، نفذ زيكا عدوى فيروسية (وزارة الداخلية من 0.1 في 400 ميكرولتر لكل بئر). تشمل آبار المراقبة السلبية دون عدوى (وهمية).
  3. في 4 ساعات بعد العدوى، استبدال اللقاح الفيروسي مع وسائل الإعلام خلوى المعالجة (2 مل). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة إضافية 44 ساعة.
  4. في 48 ساعة بعد العدوى، عد لويحات الفيروسية باستخدام المجهر النقيض من مرحلة والحصول على صور تمثيلية من الخلايا المصابة في 40X التكبير (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدمت؛ (بنك الجينات عدد الانضمام KU501215 PRVABC59) من النمط الجيني الآسيوية في هذه الدراسة 12 سلالة فيروسية زيكا. واستخدمت خلايا فيرو في 80٪ confluency للتحقيق من جديد زيكا عدوى فيروسية. لإنتاج الفيروسي وتوصيف الفيروسي لاحق، كان يعمل لمرور وقت مبكر (P3) زيكا الفيروس. وقد لوحظت لويحات الفيروسية في اليوم الثاني من العدوى. زيكا السلالات الفيروسية التي صدرت من الخلايا المصابة في البداية يمكن أن ينتشر إلى الخلايا المجاورة، مما يؤدي إلى تشكيل لويحات واضحة على الثقافة أحادي الطبقة (الشكل 2). يتميز الأثر الاستسلامي (CPE) من زيكا عدوى فيروسية بسبب التغيرات المورفولوجية مثل التقريب ومفرزة من الخلايا، وكذلك موت الخلايا التحللي.

لقياس عيار الفيروسية، تعرض طاف خالية من الخلايا التي تحتوي على فيروس تحصد من T-160 قوارير إلى 10 فلد التخفيف المتسلسل وأضاف على أحادي الطبقة من الخلايا فيرو في شكل لوحة 12-جيدا (الشكل 3). تم استخدام نقطة زمنية ما بعد التلقيح 48 ساعة بمثابة نقطة النهاية لتجنب عد لويحات الناجمة عن العدوى الثانوية. وقد تم اختيار الآبار مع 30-100 لويحات لحساب للحصول على عيار دقيقة.

وقد استخدمت RT-QPCR فحص لتقدير تكرار جينوم فيروس زيكا. أدرج زوج التمهيدي عموم راثى محدد لمنطقة ZIKV NS5 الحفظ جدا 3،16. (ترد تسلسل الاشعال في قسم البروتوكول 4.4.2) زيكا السلالة الفيروسية الاشعال-PRVABC59 محددة استنادا إلى موقع الجيني الاشعال عموم الوراثي تم اختبارها أيضا. كل من أزواج التمهيدي أظهرت مستويات مماثلة من حساسية في تضخيم زيكا الجينوم الفيروسي من الخلايا المصابة (الشكل 4). ونتيجة لسيطرة سلبية، تم اختبار التهاب الكبد C الاشعال الفيروس محددة أيضا (17). وincr كبيروقد لوحظ تخفيف في محتوى الجينوم الفيروسي ZIKV بين 48 و 96 نقطة زمنية ساعة سواء في انخفاض وارتفاع وزارة الداخلية الخلايا المصابة، مما يشير إلى عدوى فيروسية قوية (الشكل 4). أثناء النسخ المتماثل الجينوم الفيروسة المصفرة، يتم إنشاء (س) RNA المزدوج تقطعت بهم السبل وسيطة replicatory من تشكيل قاعدة الاقتران بين الشعور ومكافحة الشعور RNA الجيني. مسبار الأجسام المضادة على وجه التحديد للاعتراف الرنا المزدوج الجديلة الكشف عن الخلايا المصابة الفيروسية (الشكل 4). تم ترجمة الرنا المزدوج الجديلة الفيروسية إلى السيتوبلازم مما يدل على أن المقصورات تكرار الجينوم. كشفت مناعية تلطيخ التوسع في الخلايا المصابة بالفيروس خلال النقاط الزمنية ساعة 48 و 96.

باستخدام نظام الثقافة الفيروسات المعدية زيكا، وقد تم عرض فيلم مكتبة صغيرة من السيتوكينات لتحديد النشاط المضاد للفيروسات (الشكل 5). وقبل معاملة الخلايا مع مختلف السيتوكينات لمدة 12 ساعة ثم يصاب بفيروس زيكا. النوع الأول ط nterferon، IFN-α، عرضت نشاط مضاد للفيروسات قويا ضد فيروس زيكا في مجموعة واسعة من الجرعات التي تم اختبارها [10 وحدة دولية (IU)، و 100 وحدة دولية و 1،000 وحدة دولية]. أظهرت IFN-β له تأثير مثبط قوي أيضا. أظهر النوع الثاني IFN-γ أيضا مكافحة زيكا النشاط الفيروسي. السيتوكينات TNF-α، لم IL-1 و IL-6 لا تمنع ZIKV في تركيزات الدواء المشار إليها.

شكل 1
الشكل 1: مخطط عام لإنتاج فيروس زيكا وسير العمل فحص لإنتاج الفيروس، وتلقيح ZIKV على خلايا فيرو في T-160 قوارير زراعة الأنسجة. في 48 أو 96 HPI، هو حصاد طاف الفيروس خالية من الخلايا وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليل المصب. يتم قياس عيار الفيروس عن طريق فحص تخفيف الحد. يتم استخدام فيروس اللقاح زيكا في وقت لاحق لدراسة حركية تكاثر الفيروس وفحص المركبات الدوائية.أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
تم استخدام فحص اللوحة لقياس إنتاج فيروس زيكا خلايا الفيرو ساذج لقياس عيار الفيروس: الرقم 3. الصور الحقل مشرق تصور كثافة لويحات الفيروسية في مختلف التخفيفات (مقياس بار = 50 ميكرون). ملاحظة: 1: تظهر الصورة التخفيف 100 ويحات المميزة التي يمكن أن تحسب بدقة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: فحوصات لتقييم تكاثر الفيروس زيكا. (A) رسم بياني يظهر زيكا فيروس المحتوى الجيني تقاس RT-QPCR. كلا عموم الوراثي (ZIKV GEN) وPRVABC59 سلالة (ZIKV UNI) أظهرت الاشعال حساسية متساوية وخصوصية. وكما كان متوقعا، لم التهاب الكبد الوبائي الفيروسي (سي) الاشعال لا تضخيم أي منتج. (ب) رسم بياني يعرض حركية النمو الفيروسية زيكا في النقاط الزمنية المشار إليها في الخلايا المصابة عيار المنخفضة والعالية مقارنة بما كان عليه من سيطرة وهمية غير المصابة. يتم إعطاء القيم المتوسطة والانحرافات المعيارية. (ج) فحص سيتولوجية مناعية للتحقيق تكاثر الفيروس. كانت ملطخة الخلايا المصابة زيكا الفيروس على وجه التحديد مع الرنا المزدوج الجديلة الأجسام المضادة. في 48 HPI، الخلايا المصابة هي في مجموعات قليلة، بينما في 96 HPI يصاب معظم الخلايا. وقد استخدم هويشت صمة عار لتصور النوى (مقياس بار = 50 ميكرون). BF: صورة حقل مشرق اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الانترفيرونات تظهر قوية مضادة للزيكا النشاط الفيروسي (A) رسم بياني يظهر تعديل النمو الفيروسي زيكا من قبل مختلف السيتوكينات مقارنة بما كان عليه من السيطرة على السيارة. وتظهر القيم المتوسطة والانحراف المعياري في شريط الرسم البياني. وأظهرت إنترفيرون تثبيط ذات دلالة إحصائية من تكاثر الفيروس زيكا (قيمة P <0.05). (B و C) وصور المرحلة النقيض من الخلايا المصابة بالفيروسات زيكا مع أو بدون العلاج خلوى. ويمكن رؤية لويحات الفيروسية التي شكلتها الخلايا المصابة كما البؤر. لاحظ أن الآبار المعالجة فيروسات لا يكون لويحات الفيروسية. شملت مراقبة وهمية دون الإصابة ZIKV سيطرة سلبية. (شريط مقياس = 50 ميكرومتر) الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يتم تقديم بروتوكول مبسط لزراعة فيروس زيكا في المختبر. الخطوات الحاسمة بما في ذلك تحديد نقاط النهاية المثلى لتوسيع ثقافة الفيروسات، قياس عيار، وقياس تكرار الجينوم قدمت. زيكا الفيروس الممرض البشري، لذلك، في حين أن التعامل مع العوامل المعدية، وإجراءات السلامة الأحيائية هي التي يجب اتباعها بدقة. خط الخلية قرد الكلى، فيرو، وكان يستخدم لإظهار مختلف فحوصات الفيروسية. قد تختلف زيكا حركية تكاثر الفيروس في خلايا الأنسجة المختلفة والأنواع. يمكن استخدام خطوط الخلايا إضافية كما هو موضح سابقا (15). تم عزل زيكا الفيروس من أنسجة المخ من الأجنة المصابة 3، ولقد ثبت أن تصيب الخلايا الاصلية العصبية القشرية 14. وهكذا، وتقييم الفيزيولوجيا المرضية للإصابة ZIKV في الخلايا العصبية يمكن أن تقدم أفكارا إضافية خلايا محددة. الاختلافات في النمط الظاهري مفوع عصبيا من المورثات الأفريقية والآسيوية يمكن التحقيقباستخدام هذا النظام الثقافة المعدية. فإن إجراءات الإنتاج الفيروسي هو موضح هنا يكون من المفيد أيضا لتوليد فيروس ارتفاع عيار نحو في الدراسات المجراة المسببة للأمراض في الرئيسيات أو نموذج القوارض النظم غير البشرية.

في حين يقتصر هذه الدراسة إلى استخدام خلايا فيرو، وارتفاع عيار إنتاج خطوط الخلايا من أصول الإنسان والبعوض ويمكن اختبار. أثناء الإنتاج الفيروسي، وإذا لوحظ CPE في المائة فقط 10-30 الخلايا في يوم 3، والخلايا المصابة يمكن تقسيم في 1: 4 الكثافة وزراعة يمكن أن يستمر لمدة 4-5 أيام إضافية. في نهاية اليوم ال 7، وCPE الكامل يمكن ملاحظتها.

وتمت مقارنة كفاءة ZIKV عموم الوراثي والاشعال سلالة معينة، وقرر أن كلاهما حساس في قياس زيكا الجينوم الفيروسي في الخلايا المصابة بالفيروس المنخفضة والعالية عيار. وعلاوة على ذلك، في هذه الدراسة، يتم التحقق من التحقيق القائم على الأجسام المضادة للتعرف على الخلايا المصابة. هذا الرنا المزدوج الجديلة محددة الأجسام المضادة ريكو بنجاحgnized الجينوم الفيروسي هيولي في الخلايا المصابة بالفيروسات زيكا. وهذه الكواشف الأمثل أن يكون مصدرا مفيدا لتشريح مراحل مختلفة من تكاثر الفيروس مثل الترجمة، وتكرار الجينوم والتجمع والتشكل الفيريون.

هذا النظام زراعة الخلايا المعدية في المختبر قابل للتطبيق على الدراسات المستقبلية باستخدام زيكا replicons شبه الجيني الفيروس محددة والفيروسات المعدية الناتجة عن الحمض النووي التكميلي (كدنا]) الحيوانات المستنسخة. وتطوير زيكا الفيروسية استنساخ [كدنا] المعدية تسريع دراسة وظيفية من الجينات الفيروسية بما في ذلك NS1، وNS4B من خلال الجمع بين التقنيات البيولوجية الوراثية والجزيئية. أن إنشاء فيروس زيكا الكلمات الدلالية مع الفلورسنت أو الانارة الجيني مراسل يكون أداة قيمة في اتخاذ مزيد من استخدام نظام زراعة الخلايا في المقايسات فحص عالية المحتوى.

وأظهرت كل من النوع الأول والنوع الثاني الإنتيرفيرون مكافحة زيكا النشاط الفيروسي. IFN-α، β الإنترفيرون وIFN-γ يمكن أن يكون المزيد من EValuated في المرافق الصحية كما وقائي، بعد التعرض قائي، وعلاج ضد عدوى فيروس زيكا والأمراض المرتبطة بها. الفئات المعرضة للخطر بما في ذلك النساء الحوامل إيجابية لفيروس زيكا، يمكن علاجها مع إنترفيرون كخط أول للعلاج. وقد تبين أن العلاج الإنترفيرون α أن تكون آمنة للنساء الحوامل 18،19.

وباختصار، يوصف نظام زراعة الخلايا المعدية التي يمكن استخدامها لتحقيق مختلف جوانب النمو الفيروسي زيكا وأوجز. بروتوكول والكواشف وصفها هنا هي الموارد الهامة بالنسبة لأولئك الذين يدرسون فيروس زيكا ومجتمع البحوث العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).

Tags

عدوى، العدد 114، مرض زيكا الفيروسات، ZIKV، صغر الرأس، مضاد للفيروسات، السيتوكينات، IFN-α، IFN-γ، زيكا فيروس الوقاية ومثبطات ZIKV، البعوض تتحمل،
زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و<em&gt; في المختبر</em&gt; وقائية تأثير الانترفيرونات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika … More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter