Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Zika Virus (ZIKV) is een opkomende pathogeen die is gekoppeld aan foetale ontwikkelingsstoornissen afwijkingen zoals microcefalie, oogafwijkingen en verminderde groei. ZIKV is een RNA-virus van de familie Flaviviridae. ZIKV wordt voornamelijk overgedragen door muggen, maar kan ook worden verspreid door de moeder van de foetus verticale transmissie en seksueel contact. Tot op heden zijn er geen betrouwbare behandeling of vaccin keuzemogelijkheden bij besmet met het virus te beschermen. De ontwikkeling van een reproduceerbare effectieve Zika infectieus virus celkweeksysteem is cruciaal voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van ZIKV replicatie en geneesmiddel en vaccinontwikkeling. In dit opzicht is een protocol beschrijft een zoogdierlijke cellen gebaseerde in vitro Zika viruskweek voor virusproductie en groei analyse hier vermeld. Details betreffende de vorming van plaques door Zika virus op een cel monolaag en plaque-test voor het meten van virale titer worden gepresenteerd. Virale genoom replicatie kinetieken dubbelstrengs RNA genoom replicatory tussenproducten worden bepaald. Deze cultuur werd gebruikt om platform scherm tegen een bibliotheek van een kleine set van cytokinen resulteerde in identificatie van interferon-α (IFN-α), IFN-β en IFN-γ als krachtige remmers van virale groei Zika. Kortom, een in vitro infectieuze Zika viruskweek en div virologische assays worden aangetoond in deze studie, die in potentie de onderzoeksgemeenschap veel baat verder ophelderen van de mechanismen van virale pathogenese en de ontwikkeling van virale virulentie heeft. Antivirale IFN-alpha kan verder worden geëvalueerd als een profylactisch, na blootstelling profylactische en behandelingsoptie voor Zika virusinfecties in zeer riskante bevolking, met inbegrip van geïnfecteerde zwangere vrouwen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zika Virus (ZIKV) is een belangrijke menselijke pathogeen geassocieerd met microcefalie en slechte zwangerschapsuitkomsten 1,4. ZIKV behoort tot de verzameling van medisch relevante flavivirussen die neurologische gebreken zoals Dengue, West Nile, en St. Louis encefalitis virussen kunnen veroorzaken. De belangrijkste wijze van virale transmissie van de mug vector Aedes aegypti, en bovendien heeft seksuele overdracht ook gemeld 5,6. ZIKV is uitgegroeid tot een grote wereldwijde gezondheidsprobleem als gevolg van de uitbreiding van de geografische spreiding van de mosquito vector en de sterke correlatie met aangeboren afwijkingen. ZIKV werd voor het eerst geïsoleerd in 1947 uit een sentinel rhesus aap in de Zika bos, Oeganda en de eerste menselijke geval werd gemeld in 1952 7,8. Personen die besmet raken met ZIKV aanwezig met milde symptomen zoals koorts, huiduitslag, hoofdpijn, conjunctivitis, en spier / gewrichtspijn geworden. Geïnfecteerde zwangere vrouwen kunnen ZIKV doorgeven aan de zich ontwikkelende foetus 1. ZIKV infectie is ook gekoppeld aan Guillain-Barre syndroom, een perifere zenuw auto-immune stoornis 9 demyelinisatie.

De Zika virale genoom bestaat uit een positieve sense, enkelstrengs RNA-molecuul dat ongeveer 10,8 kilobasen in lengte. De structuur van het genoom is georganiseerd als 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR, met niet-coderende regio (NCR) flankeren een eiwit coderend gebied 6. Een enkele polyproteïne (3419 aa) vertaald dat co- en post-translationeel gesplitst in 10 kleinere peptiden. Zowel de 5'NCR en 3'NCR RNA stam-lus structuren spelen een cruciale rol bij de aanvang van de virale genoom vertaling en replicatie. De structurele elementen van het genoom bestaan ​​uit de capside, membraan en envelopeiwitten. De niet-structurele eiwitten zijn essentieel voor genoomreplicatie.

Op dit moment zijn Zika virusstammen gegroepeerd in drie genotypes: West-Afrikaanse, Oost-Afrikaanse en Aziatische 6,10-13. Het is voorgesteld dat de Oost-Afrikaanse afkomst verspreid naar West Afrika en Azië, waar later verder ontwikkeld 12. De Aziatische genotype is verantwoordelijk voor de huidige uitbraken in de Amerika's. Zika virus kan worden gekweekt in zowel mug en zoogdiercellen. Primaire dermale fibroblasten, ongerijpte dendritische cellen, corticale neurale progenitorcellen en Vero-cellen zijn gevoelig voor virale infectie Zika 10,14,15. Zowel type I als type II interferonen is aangetoond dat groei ZIKV in huidfibroblasten 15 beperken. De doelstellingen van deze studie zijn om een ​​stapsgewijze gedetailleerde protocol voor de productie en het testen van de Aziatische genotype ZIKA virusstam PRVABC59 in een zoogdiercel kweeksysteem en om het nut van deze besmettelijke kweeksysteem als geneesmiddelenontwikkeling platform demonstreren. Deze bron heeft de potentie om veel baat de Zika virale en neurologisch onderzoek gemeenschap om i verder te ontrafelents mechanismen van virale pathogenese en ontwikkeling van virale virulentie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opmerking: Een schematisch overzicht van de workflow wordt weergegeven in figuur 1.

1. Cellen

  1. Gebruik Vero cellen voor Zika virusproductie en analyse van de virale replicatiecyclus.
  2. Bereid volledige groei medium dat 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 eenheden / ml) en 10 mM HEPES.
  3. Cultuur Vero cellen met het gespecificeerde volledige groeimedium bij 37 ° C met 5% CO2.

2. Zika Virus Production

  1. Oogst de Vero cellen bij 80% celdichtheid behulp 0,25% trypsine in T-75 kolf en tel de cellen.
    1. Zuig het medium van de T-75 kolf en spoel de cellen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Voeg 2 ml van 0,25% trypsine en incubeer de kolf bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
    3. Voeg 8 ml serum bevattend groeimedium trypsine te inactiveren. Pipet op en neer om suspend cellen en breng de cellen om een ​​15 ml buis.
    4. Verwijder 10 pi cellen en meng met gelijke hoeveelheid 0,4% trypan blauw. Plaats de voorbereide mix naar de cel telkamer glijbaan en het verkrijgen van levensvatbare cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller.
  2. Seed totaal 7.000.000 cellen in een 30 ml volume in een T-160 kolf.
  3. De volgende dag, bereidt een geschikte multipliciteit van infectie (MOI 0,01 tot 0,1) van Zika virus inoculum in 10 ml serumvrij kweekmedium per fles.
  4. Verwijder het verbruikte medium van de T-160 kolf en voeg de vers bereide virale inoculum (10 ml).
  5. Incubeer de geïnoculeerde kolven van 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4-6 uur. Verdeel de entstof door voorzichtig kantelen van de kolven zijwaarts op elk uur.
  6. Na voltooiing van de incubatie, vervang het inoculum met warm-serum gesupplementeerd groeimedia (30 ml) voor elke fles. Dan blijven de viruskweek voor de volgende 96 uur.
  7. Controleer de progressie van inFection door het observeren van het optreden van virale plaques op de cel monolaag met een fasecontrastmicroscoop en beeld (figuur 2) naar behoefte bij 40X en 200X vergroting nemen.

Figuur 2
Figuur 2:. Plaques gevormd door Zika virus op een monolaag van Vero-cellen Helderveld beelden van verschillende vergrotingen tonen Zika virale plaques bij 48 hpi. Let op de aanwezigheid van afgeronde cel foci op de monolaag. (Schaal bar = 50 pm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Oogst celcultuur supernatanten op 96 hr tijdstip en centrifugeer het supernatant bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om celresten te verwijderen.
  2. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig zonder te storen gepelleteerd puin en overdracht to 15 ml buizen. Ultracentrifugatie bij 24.000 xg kunnen worden uitgevoerd om de virale deeltjes (optioneel) concentreren.
  3. Bewaar de virale kweeksupernatanten in meerdere porties bij -80 ° C.

3. Het meten van Zika virustiter door Plaque Assay

  1. Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje in 2 ml volume met een 12-wells plaat.
  2. De volgende dag bereiden 10-voudige seriële verdunningen van viraal kweeksupernatanten vanuit het T-160 kolf behulp serumvrij medium. Verwijder de gebruikte media uit elk putje en voeg 400 ul van bereide entstof op Vero-cellen in drievoud.
  3. Incubeer de geïnoculeerde kolven 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4-6 uur. Verdeel de entstof door voorzichtig kantelen van de plaat zijdelings bij ieder uur.
  4. Aan het eind van de incubatie, het inoculum vervangen met serum aangevuld medium (2 ml per putje).
  5. Na 48 uur na inenting, tel de virale brandpunten met behulp van een fase contrast microscoop. Bereken de virale titer plaque vormende eenheden (PFU) per ml. Zie Figuur 3 voor plaque assay.
  6. Fix en vlekken op de cellen in 4% formaldehyde en 0,1% kristalviolet oplossing bereid in 20% ethanol voor een duidelijke visualisatie van plaques.

4. Zika virale genoom replicatie Assay

  1. Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje in 2 ml volumina onder toepassing van een 12-wells plaat. De volgende dag bereiden virale inocula (MOI van 0,01 en 0,1, 400 ui / putje) met lage en hoge titer gebruik serumvrij medium in drievoud. Voor pseudo-infectie, gebruik serum vrije media (400 ul / putje) alleen.
  2. Herhaal de stappen 3,2-3,4.
  3. Voor deze 48 en 96 uur tijdstippen, laat de monsters voor RNA en immunocytochemie (ICC).
    1. Oogst RNA monsters, verwijder de kaart en voeg 400 ul lysis oplossing rechtstreeks aan elk putje en verzamel de lysaten.
    2. Voor ICC, verwijder de media en then vast de cellen door toevoeging van 1 ml methanol aan elk putje en incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    3. Van het cellysaat, isoleer het totale RNA met een RNA-isolatie-kit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeren RNA met behulp van een spectrofotometer.
  4. Voer een tweestaps reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) aan de ZIKV genoominhoud van geoogste RNA te bepalen.
    1. Om reverse transcriberen het RNA, eerst een 13 pi reactie mix bestaat uit 5 ug van geïsoleerde RNA, 1 ui dNTPs (10 mm), en 1 pl willekeurige hexameer (250 ng) in een 0,2 ml buis. Incubeer de buis bij 65 ° C gedurende 5 minuten en plaats het op ijs gedurende één minuut. Voeg vervolgens 1 pl reverse transcriptase, 4 pl 5x streng synthese buffer, 1 pl 0,1 M dithiothreitol, en 1 pl RNase remmer aan het reactiemengsel. Incubeer de buis gedurende nog 5 min bij 25 ° C, gevolgd door 60 min bij 50 ° C en inactivat de reactie door verwarmen tot 70 ° C gedurende 15 minuten.
    2. Voer qPCR gebruikt 1 pl van de resulterende cDNA met 12,5 ui 2x groene kleurstof super mengsel dat DNA polymerase en 1 pl 10 mM individuele primers specifiek voor Zika virus [Zika virus pan-genotype primers (voor: 5'- AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika virus Aziatische genotype PRVABC59 stam primers (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], of hepatitis C virus (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), of cellulaire huishoud-gen GAPDH (voor: 5'- CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') in een 25 pl reactievolume.
    3. Voer PCR met de run toestand 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 30 seconden (40 cycli) in een real-time PCR systeem.
    4. Gebruik GAPDH expressieniveau basis van cyclus drempelwaarde (Ct) waarde voor de Z normaliserenika virale genoom meting. Bereken de delta Ct (ACt) waarde van Zika genoom vergeleken met die van GAPDH en het verkrijgen van de 2 ACt waarde. Bereken vervolgens de veelvoudverandering door de verhouding van genormaliseerde Zika inhoud genoom tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen op aangegeven tijdstippen. Zie Figuur 4 voor ZIKV genoomreplicatie resultaten.
  5. Voer ICC via de methanol gefixeerde cellen.
    1. Was de vaste cellen drie keer met 1x PBS en geblokkeerd met ICC blokkeerbuffer (3% geit serum, 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 in PBS).
    2. Met monoklonaal anti-dsRNA J2 antilichaam (1 ug / ml) bij een verdunning van 1: 100 in blokkerende buffer en incubeer overnacht bij 4 ° C.
    3. Was de cellen met 1x PBS en secundair antilichaam geit anti-muis IgG-594 (1 ug / ml) toe aan een 1: 1000 verdunning in blokkeerbuffer en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur.
    4. Was de cellen met 1x PBS en vlek voor kernen met behulp van Hoechst kleurstof enobserveert de cellen met een fluorescentiemicroscoop bij 100x vergroting (figuur 4).

5. Screening Cytokine Bibliotheek tegen Zika Virus Infection

  1. Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje onder toepassing van een 12-wells plaat. Zodra de cellen zijn bevestigd (6 uur na het zaaien), voeg elk cytokine bij aangegeven concentraties in biologische duplicaten (2 ml volume / putje). Inclusief voertuig (PBS) alleen controle.
  2. Om 12 uur na de behandeling uit te voeren Zika virale infectie (MOI van 0,1 in 400 ul per putje). Onder meer negatieve controle wells zonder infectie (mock).
  3. Bij 4 uur na infectie, vervang het virale inoculum met cytokine behandelde media (2 ml). Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende nog 44 uur.
  4. Op 48 uur na infectie, virale plaques tellen met behulp van een fasecontrastmicroscoop en het verwerven van representatieve beelden van geïnfecteerde cellen 40x vergroting (figuur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een Zika virusstam (PRVABC59; GenBank KU501215) van de Aziatische genotype werd gebruikt in deze studie 12. Vero cellen bij 80% confluentie werden gebruikt voor het onderzoeken van de novo Zika virusinfectie. Virale productie en daaropvolgende virologische karakterisering werd een vroege passage (P3) Zika virus toegepast. De virale plaques werden waargenomen op de tweede dag van de infectie. Zika virale nakomelingen afgegeven uit de aanvankelijk geïnfecteerde cel verspreiden naar naburige cellen, die resulteren in de vorming van zichtbare plaques op de monolaagkweek (Figuur 2). Het cytopathische effect (CPE) van Zika virale infectie wordt gekenmerkt door morfologische veranderingen zoals afronding en onthechting van cellen en lytische celdood.

Voor het meten van virale titer, virusbevattende celvrije supernatant geoogst van T-160 kolven werd onderworpen aan 10-fold seriële verdunning en binnen de monolaag van Vero-cellen toegevoegd in een 12-well plaat formaat (figuur 3). De 48 uur na inoculatie tijdstip werd gebruikt als eindpunt te vermijden tellen de plaques gevolg van secundaire infectie. De putjes met 30-100 plaques werden gekozen voor het tellen van een nauwkeurige titer te verkrijgen.

RT-qPCR assay werd gebruikt om het genoom replicatie van virus Zika schatten. Een pan-genotype primerpaar specifiek voor het sterk geconserveerde regio ZIKV NS5 was inbegrepen 3,16. Zika virusstam PRVABC59-specifieke primers op basis van de genomische locatie van pan-genotypische primers (sequenties van primers worden in het protocol sectie 4.4.2) werden eveneens getest. Beide primerparen vertoonden vergelijkbare niveaus van gevoeligheid amplificeren Zika virale genoom van geïnfecteerde cellen (Figuur 4). Als negatieve controle werden hepatitis C-virus-specifieke primers getest 17. Een belangrijk INCRgemak in het virale genoom ZIKV gehalte werd waargenomen tussen 48 en 96 uur tijdstippen zowel de lage en hoge MOI geïnfecteerde cellen, wat suggereert een sterke virale infectie (figuur 4). Tijdens Flavivirus genoom replicatie, zijn dubbelstrengs (ds) RNA replicatory intermediairen gegenereerd door de vorming van basenparing tussen de sense en anti-sense genoom RNA. Een antilichaam probe specifiek voor het herkennen dsRNA gedetecteerd viraal geïnfecteerde cellen (Figuur 4). Virale dsRNA werden gelokaliseerd in het cytoplasma suggereert het genoom replicatie compartimenten. Immunocytochemie kleuring onthulde uitbreiding van het virus geïnfecteerde cellen tijdens de 48 en 96 uur tijdstippen.

Met het infectueuze virus Zika kweeksysteem, een kleine bibliotheek van cytokinen werd gescreend om antivirale activiteit te bepalen (Figuur 5). De cellen werden voorbehandeld met verschillende cytokinen gedurende 12 uur en vervolgens geïnfecteerd met Zika virus. Type I i nterferon, IFN-α, vertoonde sterke antivirale activiteit tegen Zika virus in een breed scala aan geteste doseringen [10 internationale eenheden (IE), 100 IE en 1000 IE]. IFN-β vertoonde een krachtige remmende effect ook. Type II IFN-γ toonde ook anti-Zika virusactiviteit. Cytokinen TNF-α, IL-1 en IL-6 niet ZIKV remming bij de aangegeven geneesmiddelconcentraties.

Figuur 1
Figuur 1:. Algemeen overzicht van Zika virus productie en assay workflow voor virus productie, ZIKV is geënt op Vero-cellen in T-160 weefselkweek kolven. 48 of 96 HPI wordt het celvrije supernatant virus geoogst en opgeslagen bij -80 ° C voor downstream analyse. Virustiter wordt gemeten door een beperkende verdunning assay. De Zika virusinoculum wordt vervolgens gebruikt voor het bestuderen van virusreplicatie kinetiek en screening geneesmiddelverbindingen.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3:. Plaque assay voor het meten Zika virusproductie Naïeve Vero-cellen werden gebruikt voor het meten van de virustiter. Heldere veld beelden tonen de dichtheid van virale plaques in verschillende verdunningen (Schaal bar = 50 pm). Opmerking: de 1:. Image 100 verdunning toont verschillende plaques die nauwkeurig kunnen worden geteld Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Testen voor het beoordelen Zika virusreplicatie. (A) De grafiek toont Zika virus genomische gehalte gemeten door RT-qPCR. Zowel pan-genotype (ZIKV GEN) en PRVABC59-stam (ZIKV UNI) primers toonde gelijke gevoeligheid en specificiteit. Zoals verwacht heeft hepatitis C virus (HCV) primers geen product versterken. (B) toont de grafiek Zika virale groei kinetiek bij de aangegeven tijdstippen in lage en hoge titer geïnfecteerde cellen vergeleken met die van de geïnfecteerde mock controle. Gemiddelde waarden en standaarddeviaties worden gegeven. (C) immunocytochemie assay voor het onderzoeken van virale replicatie. Zika virus geïnfecteerde cellen werden specifiek gekleurd met dsRNA antilichaam. Bij 48 hpi, geïnfecteerde cellen in enkele clusters, terwijl bij 96 HPI meeste cellen geïnfecteerd. Hoechst kleuring werd gebruikt voor het visualiseren van kernen (Schaal bar = 50 pm). BF:. Beeld Helder gebied Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5:. Interferonen tonen krachtige anti-Zika virusactiviteit (A) Grafiek waarin modulatie van Zika virale groei door verschillende cytokinen vergeleken met die van controle voertuig. Gemiddelde waarden en de standaardafwijking worden weergegeven in het staafdiagram. Interferonen toonde statistisch significante remming van virusreplicatie Zika (p-waarde <0,05). (B en C) fasecontrastbeelden van Zika met virus geïnfecteerde cellen met of zonder cytokine behandeling. Virale plaques gevormd door geïnfecteerde cellen kan worden gezien als foci. Merk op dat interferon-behandelde putjes niet virale plaques hebben. Mock controle zonder ZIKV infectie opgenomen als negatieve controle. (Schaal bar = 50 pm) Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier wordt een gestroomlijnde protocol voor het kweken Zika virus in vitro gepresenteerd. Kritische stappen met inbegrip van, het identificeren van optimale eindpunten voor de uitbreiding van het virus cultuur, het meten titer, en kwantificeren van genoom replicatie werden verstrekt. Zika virus is een menselijk pathogeen, dus, terwijl de behandeling van infectieuze middelen, bioveiligheid procedures moeten strikt worden opgevolgd. Een aap niercellijn, Vero, werd gebruikt voor het aantonen van verschillende virologische assays. Zika virale replicatie kinetiek kunnen in cellen van verschillende weefsels en soorten. Aanvullende cellijnen kunnen worden gebruikt zoals hiervoor 15 beschreven. Zika virus is geïsoleerd uit hersenweefsel van geïnfecteerde foetussen en 3 is aangetoond dat corticale neurale cellen 14 infecteren. Aldus evalueren van de pathofysiologie van ZIKV infectie bij neuronale cellen kunnen aanvullende celspecifieke inzichten. Verschillen in de neurovirulente fenotype van Afrikaanse en Aziatische genotypen kunnen worden onderzochthet gebruik van deze besmettelijke kweeksysteem. De virusproductie hier beschreven ook nuttig om hoge titer virus richting in vivo pathogene studies bij niet-menselijke primaat of knaagdier modelsystemen.

Terwijl deze studie wordt beperkt tot het gebruik van Vero-cellen, kan een hoge-titer producerende cellijnen van menselijke oorsprong en muggen getest. Tijdens virusproductie, wanneer CPE wordt waargenomen in slechts 10-30% van de cellen op dag 3, de geïnfecteerde cellen worden gesplitst in 1: 4 dichtheid en het kweken kan worden voortgezet gedurende nog 4-5 dagen. Aan het einde van de 7de dag een volledig CPE wordt waargenomen.

De efficiëntie van ZIKV pan-genotype en stam-specifieke primers werden vergeleken en vastgesteld dat beide gevoelig kwantificeren Zika virale genoom in lage en hoge titer virus geïnfecteerde cellen. Verder in deze studie een antilichaam gebaseerde probe is geverifieerd geïnfecteerde cellen te identificeren. Dit dsRNA-specifiek antilichaam met succes recognized cytoplasma virale genomen in de Zika-virus geïnfecteerde cellen. Deze geoptimaliseerde reagentia zal een nuttig hulpmiddel om verschillende stadia van virale replicatie, zoals vertaling, genoom replicatie, assemblage en virion morfogenese ontleden zijn.

Deze in vitro infectieuze celkweeksysteem geldt voor toekomstige studies met Zika virus-specifieke sub-genomische replicons en infectieus virus gevormd uit complementaire DNA (cDNA) klonen. Ontwikkeling van Zika virale infectieuze cDNA-klonen wordt de functionele studie van virale genen zoals NS1 en NS4B versnellen door het combineren van genetische en moleculaire biologische technieken. Oprichting van Zika virus gelabeld met een fluorescente of luminescente gebaseerd reportergen zou een waardevol instrument in de verdere maken gebruik van de celkweek systeem in high-gehalte screeningstesten zijn.

Zowel type I en type II IFN aangetoond anti-Zika virale activiteit. IFN-α, β-IFN en IFN-γ kan verder EValuated in klinische settings als een profylactisch, na blootstelling profylactische en behandeling tegen Zika virusinfectie en aanverwante ziekten. Risicogroepen zoals zwangere vrouwen positief voor Zika virus, kunnen worden behandeld met interferonen als eerstelijnsbehandeling wordt. Interferon-α behandeling is aangetoond dat ze veilig voor zwangere vrouwen 18-19 zijn.

Samengevat wordt een besmettelijke celcultuur die kan worden gebruikt om verschillende aspecten van Zika virale groei onderzoeken beschreven en toegelicht. Het protocol en reagentia hier beschreven zijn belangrijke bronnen voor diegenen die Zika virus en het neurologisch onderzoek gemeenschap te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315, (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65, (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17, (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152, (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19, (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2, (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14, (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22, (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20, (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87, (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28, (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36, (11), 1715-1718 (2002).
Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter