Abstract
Zika Virus (ZIKV) est un pathogène émergent qui est lié à des anomalies du développement fœtal telles que la microcéphalie, des anomalies oculaires et troubles de la croissance. ZIKV est un virus à ARN de la famille des Flaviviridae. ZIKV est principalement transmis par les moustiques, mais peut aussi se propager par la mère à la transmission verticale du fœtus ainsi que le contact sexuel. À ce jour, il n'y a pas d'options de traitement ou de vaccin fiables pour protéger les personnes infectées par le virus. Le développement d'un système de culture cellulaire reproductible efficace du virus zika infectieux est essentielle pour l'étude des mécanismes moléculaires de la réplication de ZIKV ainsi que le développement de médicaments et de vaccins. À cet égard, un protocole décrivant un système in vitro Zika de culture de mammifère à base de cellules pour la production virale et de la croissance virale analyse est rapporté ici. Des détails sur la formation de plaques de virus zika sur une monocouche cellulaire et un essai sur plaque pour mesurer le titre viral sont présentés. génome viral cinétique de replicationet intermédiaires replicatory double brin du génome de l'ARN sont déterminées. Cette plate-forme de culture a été utilisée pour l'écran contre une bibliothèque d'une petite série de cytokines conduisant à l'identification de l'interféron-α (IFN-α), l'IFN-β et IFN-γ en tant que puissants inhibiteurs de la croissance virale Zika. En résumé, une maladie infectieuse système in vitro Zika virale de la culture et de diverses analyses virologiques sont démontrées dans cette étude, qui a le potentiel de grandement bénéficier la communauté des chercheurs à élucider davantage les mécanismes de la pathogenèse virale et l'évolution de la virulence virale. Antiviral IFN-alpha peut en outre être évalué en tant que post-exposition prophylactique, et l'option de traitement prophylactique des infections à virus Zika dans les populations à haut risque, y compris les femmes enceintes infectées.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) est un agent pathogène humain important associé à une microcéphalie et une mauvaise issue de la grossesse 1,4. ZIKV appartient à l'ensemble des flavivirus médicalement pertinents qui peuvent causer des troubles neurologiques tels que la dengue, virus du Nil occidental, et les virus de l'encéphalite de Saint-Louis. Le principal mode de transmission du virus est par le moustique vecteur Aedes aegypti, et, en outre, la transmission sexuelle a également été rapporté 5,6. ZIKV est devenu un problème de santé mondial majeur en raison de la répartition géographique de l'expansion du moustique vecteur et de sa forte corrélation avec des malformations congénitales. ZIKV a été isolé en 1947 à partir d' un singe rhésus sentinelle dans la forêt Zika, l' Ouganda et le premier cas humain a été rapporté en 1952 7,8. Les personnes qui sont infectées par le ZIKV présent avec des symptômes bénins tels que la fièvre, des éruptions cutanées, des maux de tête, la conjonctivite, et les muscles / douleurs articulaires. Les femmes enceintes infectées peuvent transmettre ZIKV au fœtus en développement 1. ZL' infection de IKV a également été lié à un syndrome de Guillain-Barré, un nerf périphérique démyélinisation auto-immune trouble 9.
Le génome viral est constitué d'Zika un sens positif, une molécule d'ARN simple brin qui est à environ 10,8 kilobases de longueur. La structure du génome est organisé comme 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, avec des régions non codantes (NCR) flanquant une région codant pour la protéine 6. Un polyprotéine unique (3419 aa) est traduit qui est co- et post-traductionnelle clivé en 10 petits peptides. Tant le 5'NCR et 3'NCR ARN structures tige-boucle jouent un rôle crucial dans le début de la traduction du génome viral et la réplication. Les éléments de structure du génome sont constitués par des protéines de capside, la membrane et l'enveloppe. Les protéines non structurelles sont essentielles pour la replication du génome.
Actuellement, Zika souches virales sont regroupées en trois génotypes principaux: Afrique de l'Ouest, Afrique de l' Est et d' Asie 6,10-13. Il a été proposé que la lignée Afrique de l' Est se propager à l' Afrique de l' Ouest et de l' Asie, où il est ensuite plus évolué 12. Le génotype asiatique est responsable des flambées actuelles dans les Amériques. zika virus peut être cultivé dans les deux moustiques et les cellules de mammifères. Des fibroblastes primaires dermiques, les cellules dendritiques immatures, des cellules progénitrices neurales corticales, ainsi que les cellules Vero sont sensibles à une infection virale Zika 10,14,15. À la fois de type I et de type II , interférons ont été montrés pour limiter la croissance des ZIKV dans les fibroblastes de la peau 15. Les objectifs de cette étude sont de fournir, un protocole détaillé par étapes pour la production et l'analyse du génotype asiatique ZIKA souche virale PRVABC59 dans un système de culture de cellules de mammifères et de démontrer l'utilité de ce système de culture infectieuse comme une plate-forme de développement de médicaments. Cette ressource a le potentiel de grandement bénéficier la communauté de recherche virale et neurologique Zika à élucider imécanismes ts de la pathogenèse virale et de l'évolution de la virulence virale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Note: Un aperçu schématique du flux de travail est présenté dans la figure 1.
1. cellules
- Utiliser des cellules Vero pour la production de virus zika et l'analyse du cycle de réplication virale.
- Préparer un milieu complet de croissance contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 unités / ml) et 10 mM de HEPES.
- La culture des cellules Vero avec le milieu de croissance complet spécifiée à 37 ° C avec 5% de CO 2.
2. Zika Virus production
- Récolter les cellules Vero à une densité cellulaire de 80% en utilisant 0,25% de trypsine dans le flacon T-75 et compter les cellules.
- Aspirer les médias de la culture flacon T-75 et rincer les cellules avec 2 ml du tampon phosphate salin (PBS).
- Ajouter 2 ml de trypsine à 0,25% et on incube le flacon à 37 ° C pendant 5 min.
- Ajouter 8 ml de sérum contenant du milieu de croissance pour inactiver la trypsine. Pipet haut et bas pour susPend cellules et transmettent les cellules dans un tube de 15 ml.
- Retirer 10 pi de cellules et mélanger avec une quantité égale de 0,4% de bleu trypan. Charger le mélange préparé dans la chambre de tiroir de comptage des cellules viables et d'obtenir des cellules comptages en utilisant un compteur de cellules automatisé.
- Seed un total de 7 millions de cellules dans un volume dans un flacon T-160 30 ml.
- Le lendemain, préparer une multiplicité appropriée de l'infection (0,01 à 0,1 MOI) de Zika virus inoculum dans un milieu de culture exempt de 10 ml de sérum par flacon.
- Retirez le support passé du flacon T-160, puis ajouter l'inoculum viral fraîchement préparé (10 ml).
- Incuber les fioles inoculées à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 4-6 heures. Etaler l'inoculum en inclinant doucement les flacons de côté à chaque heure.
- A la fin de l'incubation, remplacer l'inoculum avec des milieux chauds additionné de sérum de croissance (30 ml) pour chaque flacon. Ensuite, continuer la culture virale pour 96 heures suivant.
- Vérifier la progression de dansfection en observant l'apparition de plaques virales sur la monocouche cellulaire à l' aide d' un microscope à contraste de phase et prendre des images (figure 2) selon les besoins à 40X et 200X grossissements.
Figure 2:. Plaques formées par le virus Zika sur une monocouche de cellules Vero images lumineuses de différents grossissements de terrain montrent Zika plaques virales à 48 hpi. On notera la présence de foyers de cellules arrondies sur la monocouche. (Barre d' échelle = 50 pm) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Récolte surnageants de culture cellulaire au point de temps de 96 heures et centrifuger le surnageant à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
- Retirez délicatement le surnageant sans débris granulés inquiétant et transfert to tubes de 15 ml. Ultracentrifugation à 24000 xg peut être réalisée pour concentrer les particules virales (en option).
- Stocker les surnageants de culture virale dans plusieurs aliquotes à -80 ° C.
3. Mesure Zika titre viral par la plaque de dosage
- Seed cellules Vero naïfs à 1 x 10 5 cellules par puits dans 2 ml de volume à l' aide d' une plaque de 12 puits.
- Le lendemain, préparer 10 fois des dilutions en série de surnageants de culture virales collectées à partir des T-160 flacon en utilisant un milieu sans sérum. Retirez le support passé de chaque puits et ajouter 400 ul d'inoculum préparé sur cellules Vero en triple.
- Incuber les flacons inoculés dans 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 4-6 heures. Etaler l'inoculum en inclinant légèrement la plaque latérale à chacune h.
- A la fin de l'incubation, remplacer l'inoculum avec les milieux de sérum supplémenté (2 ml par puits).
- A 48 heures après l'inoculation, compter les foyers viraux en utilisant un Contr de phaseast microscope. Calculer le titre viral en unités formant des plaques (PFU) par ml. Voir la figure 3 pour le dosage de la plaque.
- Fixer et colorer les cellules dans 4% de formaldéhyde et solution de cristal violet 0,1% préparé dans 20% d'éthanol pour la visualisation claire des plaques.
Essai 4. Zika génome viral réplication
- Seed cellules Vero naïfs à 1 x 10 5 cellules par puits dans 2 ml volumes à l' aide d' une plaque de 12 puits. Le lendemain, préparer inoculum viral (MOI de 0,01 et 0,1; 400 pl / puits) de titre faible et élevé en utilisant du milieu sans sérum en triple exemplaire. Pour une infection simulée, utiliser du sérum médias libres (400 pl / puits) seulement.
- Répétez les étapes 3.2 à 3.4.
- Aux points de temps 48 et 96 h, recueillir les échantillons pour l'ARN et immunocytochimie (ICC).
- Pour les échantillons d'ARN de récolte, retirez le support, puis ajouter 400 pi de solution de lyse directement à chaque puits et recueillir les lysats.
- Pour la CPI, retirez le support et then fixer les cellules en ajoutant 1 ml de methanol à chaque puits et incuber la plaque à 4 ° C pendant 30 min.
- À partir du lysat des cellules, d'isoler l'ARN total en utilisant un kit d'isolement d'ARN selon les instructions du fabricant. Quantifier l'ARN en utilisant un spectrophotomètre.
- Effectuer une à deux étapes de transcription inverse PCR quantitative (RT-qPCR) pour déterminer le contenu du génome de l'ARN récolté à partir ZIKV.
- Pour inverser transcrire l'ARN, d'abord mis en place un mélange de réaction de 13 ul constitué de 5 ug d'ARN isolé, 1 pl de dNTP (10 mM), et 1 hexamère ul aléatoire (250 ng) dans un tube de 0,2 ml. Incuber le tube à 65 ° C pendant 5 min, puis placez-le sur la glace pendant une minute. Ensuite, ajouter 1 pi de transcriptase inverse, 4 ul de tampon de synthèse du brin 5x, 1 pi de dithiothréitol 0,1 M et 1 ul d'inhibiteur de RNase dans le mélange réactionnel. Incuber le tube pendant 5 minutes supplémentaires à 25 ° C, puis 60 minutes à 50 ° C et inactivate la réaction par chauffage à 70 ° C pendant 15 min.
- Effectuer qPCR utilisant 1 pl de l'ADNc résultant avec 12,5 pi de colorant vert 2x super-mélange contenant de l'ADN polymérase et 1 pl de 10 mM d'amorces individuelles spécifiques pour le virus Zika [Zika virus amorces pan-génotype (Pour: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), le virus Zika génotype asiatique amorces de déformation PRVABC59 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], ou le virus de l'hépatite C (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), ou du type cellulaire GAPDH du gène de ménage (pour: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') dans un volume réactionnel de 25 ul.
- Faire la PCR en utilisant la condition de fonctionnement 95 ° C pendant 15 secondes et 60 ° C pendant 30 secondes (40 cycles) dans un système de PCR en temps réel.
- Utiliser le niveau d'expression de la GAPDH en fonction de seuil de cycle (Ct) pour normaliser la valeur Zika mesure du génome viral. Calculer le delta Ct (ACt) valeur du génome Zika par rapport à celle de GAPDH et obtenir la valeur 2 ACt. Ensuite, calculer le facteur de changement en prenant le rapport du contenu normalisé du génome Zika entre les cellules infectées et non infectées à des points de temps indiqués. Voir Figure 4 pour les résultats de la réplication du génome de ZIKV.
- Effectuer la CPI en utilisant les cellules de méthanol fixe.
- Laver les cellules fixées à trois reprises avec PBS 1x et bloquer avec la CPI tampon de blocage (sérum de chèvre à 3%, 3% de BSA, 0,1% de Triton-x 100 dans du PBS).
- Utiliser monoclonal de souris anti-anticorps ARNdb J2 (1 pg / ml) à une dilution de 1: 100 dans du tampon de blocage et on incube pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver les cellules avec du PBS 1X et ajouter un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de souris-594 (1 pg / ml) à une dilution de 1: 1000 dans du tampon de blocage et on incube pendant une heure à température ambiante.
- Laver les cellules avec PBS 1x et tache pour les noyaux en utilisant le colorant Hoechst etobserver les cellules en utilisant un microscope à fluorescence à un grossissement de 100X (figure 4).
5. Dépistage Cytokine Library contre Zika Virus Infection
- Graine cellules Vero naïfs à 1 x 10 5 cellules par puits en utilisant une plaque de 12 puits. Une fois que les cellules sont fixées (6 heures après l'ensemencement), ajoutez chaque cytokine à des concentrations indiquées dans les doublons biologiques (2 ml de volume / puits). Inclure véhicule (PBS) seul contrôle.
- À 12 h post-traitement, effectuer une infection virale Zika (MOI de 0,1 à 400 ul par puits). Inclure les puits témoins négatifs sans infection (mock).
- A 4 heures post-infection, remplacer le inoculum viral avec les médias de cytokines traité (2 ml). Incuber les cellules à 37 ° C pendant 44 h supplémentaires.
- A 48 heures post-infection, compter plaques virales à l' aide d' un microscope à contraste de phase et d' acquérir des images représentatives de cellules infectées à un grossissement de 40X (Figure 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Une souche virale Zika (PRVABC59; numéro d'accession GenBank KU501215) du génotype asiatique a été utilisé dans cette étude 12. Cellules Vero à 80% de confluence ont été utilisés pour étudier de novo Zika infection virale. Pour la production virale et la caractérisation virologique ultérieure, un passage précoce virus (P3) Zika a été employé. Les plaques virales ont été observées sur le deuxième jour d'infection. Descendances viraux Zika libérés de la cellule initialement infectées peuvent se propager aux cellules voisines qui donnent lieu à la formation de plaques visibles sur la culture monocouche (figure 2). L'effet cytopathique (CPE) de Zika infection virale est caractérisée par des changements morphologiques tels que l'arrondissement et le détachement des cellules ainsi que la mort cellulaire lytique.
Pour mesurer le titre viral, surnageant exempt de cellules contenant le virus récolté à partir de T-160 flacons a été soumis à 10-fold dilution en série et ajoutés sur la monocouche de cellules Vero dans un format de plaque à 12 puits (figure 3). Le point de temps après l'inoculation de 48 heures a été utilisé comme un point d'extrémité pour éviter de compter les plaques provenant de l'infection secondaire. Les puits avec 30-100 plaques ont été choisies pour compter pour obtenir un titre précis.
dosage par RT-PCR quantitative a été utilisée pour estimer la réplication du génome du virus zika. Une paire d'amorces pan-génotype spécifique pour la région ZIKV NS5 hautement conservée a été inclus 3,16. Zika souche virale des amorces spécifiques de PRVABC59 en fonction de la localisation génomique des amorces pan-génotypique (les séquences d'amorces sont fournis dans la section de protocole 4.4.2) ont également été testés. Les deux paires d'amorces ont montré des niveaux similaires de sensibilité dans l' amplification Zika génome viral à partir de cellules infectées (figure 4). En tant que témoin négatif, des amorces spécifiques du virus de l' hépatite C ont également été testés 17. Une incr significativefacilité dans le contenu du génome viral ZIKV a été observée entre 48 et 96 points de temps h à la fois dans la basse et haute MOI cellules infectées, ce qui suggère une infection virale robuste (Figure 4). Au cours de la réplication du génome de flavivirus, (ds) d'ARN double brin intermédiaires replicatory sont générés par la formation d'un appariement de bases entre le sens et l'ARN génomique antisens. Une sonde d'anticorps spécifique pour la reconnaissance d' ARNdb a détecté les cellules infectées virales (figure 4). Viral ARNdb ont été localisée dans le cytoplasme suggérant les compartiments de réplication du génome. L'immunocytochimie a révélé une coloration expansion des cellules infectées par le virus dans les points de temps de 48 et 96 h.
En utilisant le système de culture de virus infectieux Zika, une petite bibliothèque de cytokines a été criblée pour déterminer l' activité antivirale (Figure 5). Les cellules ont été pré-traitées avec diverses cytokines pendant 12 heures et ensuite infectées par le virus Zika. Type I i nterferon, IFN-α, présente une forte activité antivirale contre le virus Zika dans une large gamme de doses testées [10 unités internationales (UI), 100 UI et 1000 UI]. IFN-β a démontré un effet inhibiteur puissant ainsi. Type II IFN-γ a également démontré une activité anti-virale Zika. Les cytokines TNF-α, IL-1 et IL-6 n'a pas inhibé ZIKV aux concentrations de médicament indiquées.
Figure 1:. Aperçu général de la production de virus Zika et le dosage workflow pour la production de virus, ZIKV est inoculé à des cellules Vero dans T-160 flacons de culture de tissus. À 48 ou 96 HPI, le virus de surnageant exempt de cellules est récolté et stocké à -80 ° C pour analyse en aval. Le titre viral est mesurée par un essai de dilution limite. Le virus Zika inoculum est ensuite utilisé pour l'étude de la cinétique de réplication du virus et le criblage de composés pharmaceutiques.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Plaque test pour mesurer la production de virus Zika cellules Vero Naive ont été utilisés pour mesurer le titre viral. images de champ lumineux représentent la densité des plaques virales à différentes dilutions (barre d'échelle = 50 pm). Remarque: Le 1:. L' image 100 de dilution montre plaques distinctes qui peuvent être comptés avec précision S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Des tests pour évaluer la réplication du virus Zika. (A) Le graphique montre le contenu génomique du virus Zika mesurée par RT-qPCR. Les deux pan-génotype (ZIKV GEN) et PRVABC59-souche (ZIKV UNI) amorces ont montré égale sensibilité et la spécificité. Comme prévu, l'hépatite virale C (VHC) amorces n'amplifient un produit quelconque. (B) présente un graphique de la cinétique de croissance virale Zika aux points de temps indiqués dans les cellules à faible et à titre élevé infecté par rapport à celle du témoin non infecté simulé. Les valeurs moyennes et les écarts types sont donnés. (C) Essai de Immunocytochimie pour enquêter sur la réplication virale. les cellules infectées par le virus Zika ont été spécifiquement colorées avec l'anticorps ARNdb. A 48 hpi, les cellules infectées sont en quelques grappes, alors qu'à 96 hpi la plupart des cellules sont infectées. Hoechst tache a été utilisé pour la visualisation des noyaux (barre d'échelle = 50 pm). BF:. Image claire sur le terrain S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Les interférons démontrent une activité anti-virale Zika puissante (A) Graphique montrant la modulation de Zika croissance virale par diverses cytokines par rapport à celui de contrôle du véhicule. Les valeurs moyennes et écart-type sont présentés dans le graphique à barres. Les interférons ont montré une inhibition statistiquement significative de la réplication du virus zika (valeur p <0,05). Des images à contraste de phase de cellules Zika infectées par le virus , avec ou sans traitement par des cytokines (B et C). Les plaques virales formées par des cellules infectées peuvent être considérées comme des foyers. On notera que les puits traités à l'interféron ne sont pas des plaques virales. contrôle Mock sans infection ZIKV inclus comme témoin négatif. (Barre d' échelle = 50 pm) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, un protocole simplifié pour la culture de virus Zika in vitro est présenté. Les étapes critiques notamment, l'identification des points d'extrémité optimales pour l'expansion de la culture du virus, la mesure de titre, et la quantification de la réplication du génome ont été fournies. virus Zika est un agent pathogène humain, de sorte que, lors de la manipulation d'agents infectieux, les procédures de biosécurité doivent être strictement suivies. Une lignée de cellules de rein de singe, Vero, a été utilisé pour démontrer divers tests virologiques. Zika cinétiques de réplication virale peuvent différer dans les cellules de différents tissus et des espèces. D' autres lignées cellulaires peuvent être utilisées comme 15 décrit précédemment. Zika virus a été isolé à partir des tissus du cerveau de fœtus infectés et 3 a été montré pour infecter des cellules progénitrices neurales du cortex 14. Ainsi, l'évaluation de la physiopathologie de l'infection ZIKV dans les cellules neuronales peut fournir des indications spécifiques de cellules supplémentaires. Les différences dans le phénotype neurovirulente des génotypes africains et asiatiques peuvent être étudiésen utilisant ce système infectieuse de culture. La procédure de production virale décrit ici sera également utile pour générer des virus à titre élevé vers des études pathogènes in vivo dans les systèmes de primates ou d'un modèle de rongeur non humains.
Alors, cette étude se limite à l'utilisation de cellules Vero, la production de lignées de cellules d'origines humaines et moustiques à titre élevé peut être testé. Au cours de la production virale, si le CPE est observée chez seulement 10 à 30% des cellules le jour 3, les cellules infectées peuvent être divisées en 1: 4 densité et la culture peut être poursuivie pendant encore 4-5 jours. A la fin de la 7 ème jour, un CPE complet peut être observée.
L'efficacité de ZIKV pan génotype et des amorces spécifiques de la souche a été comparée et a déterminé que les deux sont sensibles à la quantification Zika génome viral dans les cellules infectées par le virus titer faible et élevé. En outre, dans cette étude, une sonde à base d'anticorps est vérifiée pour identifier les cellules infectées. Cet anticorps spécifique ARNdb reco avec succèsgnized génomes viraux cytoplasmiques dans les cellules infectées par le virus Zika. Ces réactifs optimisés seront une ressource utile pour disséquer différentes étapes de la réplication virale telles que la traduction, la réplication du génome, l'assemblage et virion morphogenèse.
Infectieux ce système de culture cellulaire in vitro est applicable à des études ultérieures utilisant Zika réplicons sub-génomiques spécifiques du virus et le virus infectieux générés à partir d' ADN complémentaire (ADNc) clone. Développement de Zika viraux clones infectieux d'ADNc permettra d'accélérer l'étude fonctionnelle des gènes viraux dont NS1 et NS4B en combinant des techniques biologiques moléculaires et génétiques. Création du virus Zika marqués avec un gène rapporteur fluorescent ou luminescent à base serait un outil précieux pour faire davantage utiliser le système de culture de cellules en haute contenu des tests de dépistage.
Les deux types I et interférons de type II démontré anti-Zika activité virale. IFN-α, IFN-β et l'IFN-γ peuvent être encore evaluated en milieu clinique en tant que post-exposition prophylactique prophylactique et un traitement contre l'infection par le virus Zika et des maladies associées. Les groupes à haut risque, y compris les femmes enceintes séropositives pour le virus Zika, peuvent être traités avec des interférons en tant que première ligne de traitement. Traitement Interferon-α a été montré pour être sans danger pour les femmes enceintes 18,19.
En résumé, un système de culture cellulaire infectieuse qui peut être utilisée pour étudier les divers aspects de la croissance virale Zika est décrit et présenté. Le protocole et les réactifs décrits ici sont des ressources importantes pour ceux qui étudient le virus Zika et la communauté de la recherche neurologique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
