Summary
Denne protokol beskriver en ny metode til at vokse og kvalitativt analysere bakterielle biofilm på svampehyfer ved konfokal og elektronmikroskopi.
Abstract
Bakterielle biofilm ofte dannes på svampeangreb overflader og kan være involveret i en lang række bakterielle-svampe interaktion processer, såsom metabolisk samarbejde, konkurrence, eller prædation. Studiet af biofilm er vigtig i mange biologiske områder, herunder miljøvidenskab, fødevareproduktion, og medicin. Imidlertid har kun få undersøgelser fokuseret på sådanne bakterielle biofilm, delvist på grund af vanskeligheden ved at undersøge dem. De fleste af metoderne til kvalitativ og kvantitativ biofilm analyser beskrevet i litteraturen, er kun egnet til biofilm dannes på abiotiske overflader eller på homogene og tynde biotiske overflader, såsom et monolag af epitelceller.
Mens laserscanning konfokal mikroskopi (LSCM) ofte anvendes til at analysere in situ og in vivo biofilm, denne teknologi bliver meget udfordrende, når den anvendes til bakterielle biofilm på svampehyfer, på grund af tykkelsen og de tre dimensioner af hyfe netvorks. For at overvinde denne ulempe udviklede vi en protokol kombinere mikroskopi med en metode til at begrænse akkumuleringen af svampetrådenes lag i fungale kolonier. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at undersøge udviklingen af bakterielle biofilm på svampehyfer på flere skalaer ved hjælp af både LSCM og scanning elektronmikroskopi (SEM). Denne rapport beskriver den protokol, herunder mikroorganismekulturer, bakterielle biofilm dannelse betingelser, biofilm farvning og LSCM og SEM visualiseringer.
Introduction
Svampe og bakterier har mange muligheder for at interagere med hinanden, fordi de bor sammen i de fleste terrestriske miljøer. På grund af deres mangfoldighed og deres allestedsnærværelse, disse interaktioner er vigtige i mange biologiske områder, herunder bioteknologi, landbrug, fødevareforarbejdning, og medicin 1, 2. Molekylære interaktioner kræver en vis grad af nærhed til at tillade udvekslinger mellem partnerne, og i nogle tilfælde, en fysisk association af partnerne er nødvendig for en funktionel interaktion 3. En fælles fysisk association mellem bakterier og svampe er dannelsen af bakterielle biofilm på fungale overflader 4. Denne direkte kontakt mellem bakterieceller og svampehyfer tillader intime interaktioner, der er involveret i forskellige biologiske processer. For eksempel, i medicin, undersøgelse af biofilmdannelse af Pseudomonas aeruginosa på opportunistisk svampe patogen Candida albicans kunne give indsigt i sammenhængen mellem biofilm dannelse og virulens fem. På landbrugsområdet undersøgelser tyder på, at plante-vækstfremmende Rhizobakterier og biologisk bekæmpelse bakterier har en øget effektivitet, når forbundet med en svamp i et blandet biofilm. For eksempel har Bradyrhizobium elkanii forbedret N2 -fixing aktivitet, når forbundet med Pleurotus ostreatus i et blandet biofilm 6. Endelig i bioremediering, bakteriel-svampe blandede biofilm har været brugt til rensning af forurenede lokaliteter 7, 8.
LSCM er særligt velegnet til at studere biofilm, da det giver mulighed for en tredimensionel observation af levende hydreret biofilm med minimum forbehandlinger, og dermed bevare biofilm struktur og organisation. Således biofilm analyse af LSCM er meget informativ, især til DetHermelin tidsforløbet af biofilmdannelse og påvisning af karakteristiske faser 9, 10, fra adhæsion trin i udviklingen af en moden biofilm. Det er også særligt egnet til at visualisere biofilm struktur og matrix 11, 12 eller at kvantificere biofilmen størrelse 13, 14. Selv om denne fremgangsmåde er egnet til at studere biofilm på abiotiske eller tynde biotiske overflader, studere bakteriel biofilm på en fungal filamentøs koloni er stadig meget udfordrende. Faktisk de fleste trådsvampe bygge tykke, komplekse, tredimensionale netværk i kultur. Selv om tykke objekter kan afbildes ved konfokal mikroskopi, dæmpningen af laseren penetration og fluorescensemissionen ofte forringe kvaliteten af de endelige billeder over en dybde på 50 um 15. Endvidere fordi fungale kolonier er ikke stive, it er vanskeligt at håndtere mikroorganismerne uden at forstyrre biofilm. På grund af tykkelsen af prøverne, er de få mikroskopiske analyser af bakterielle biofilm på svampehyfer normalt kun udføres på en lille del af det fungale koloni, derfor kun indeholdende få hyfer 16, 17, 18. Alt dette begrænser vores evne til at beskrive biofilm distribution på den fungale koloni og således kan bringe bias i analysen i tilfælde af den heterogene fordeling af biofilmen inden svampens koloni.
For at overvinde sådanne vanskeligheder, rapporterer vi en fremgangsmåde til vækst og analyse af bakteriel biofilm på svampehyfer. Denne metode blev anvendt til at studere biofilmdannelse i Pseudomonas fluorescens BBc6 på hyfer af ectomycorrhizal basidiomycete Laccaria bicolor S238N. Disse to skov-jordens mikroorganismer blev beskrevet tidligere at danne blandedebiofilm-lignende strukturer 19, 20. Denne metode kan let tilpasses yderligere til andre filamentøse fungale / bakterielle systemer. Fremgangsmåden præsenteres her, er baseret på kombinationen af en fungal kultur fremgangsmåde, der giver mulighed for vækst af meget tynde fungale kolonier, med LSCM og SEM billeddannelse. Dette muliggjorde for os at opnå mikro- (um) og meso- (mm interval) skala visninger af interaktionen mellem de to mikroorganismer, der giver mulighed for den kvalitative karakterisering af biofilmen. Vi viste også, at prøverne kan iagttages med SEM, tillader strukturanalyse af biofilmen på nanoskala (nm).
Protocol
1. Udarbejdelse af bakterier og svampe kulturer
- Fremstilling af svampekulturer
- Forbered cellofan membraner med samme diameter som petriskålene og kog dem i EDTA (1 g / l i deioniseret vand) i 30 min. Skyl arkene med demineraliseret vand og autoklaver dem to gange.
- Forbered en fungal forkultur ved at inokulere fungal agar plugs på passende agarmedium dækket med en EDTA forbehandlet cellofan membran. Inkuber det ved den optimale væksttemperatur for at opnå kolonier ca. 1 cm i diameter.
- For L. bicolor S238N, inkuberes ved 25 ° C i 5 dage på Pachlewski P5 agarmedium, fremstillet af 0,5 g diNH4 tartrat, 1 g KH 2 PO4, 0,5 g MgSO4 .7H 2 O, 5 g Maltose D + , 20 g glucose D +, 1 ml 10% thiamin-HCI, 1 ml 1/10 fortyndet mikronæringsstoffer opløsning (6 g / L ferrosulfat; 0,27 g / l molybdæn trioxyde; 8,45 g / l borsyre; 5 g / L mandmangan sulfat; 5 g / l cuprisulfat; 2,27 g / l zinksulfat) fyldt op til 1 l med deioniseret vand; og 20 g agar; pH 5,5.
- Fra svampens præ-kultur, inokulere en ny agarplade dækket med EDTA forbehandlet cellofan membran indeholdende en lav-carbon agarmedium for at fremme den radiale udvidelse af kolonierne.
- At pode petriskålen forsigtigt ridse ydersiden (hvor celler har den samme fysiologiske tilstand) af en fungal koloni fra den før-kultur med en skalpel og overføre hyferne til den nye agarplade.
- Inkuber ved den optimale temperatur vækst indtil de nye kolonier er cirka 1 cm i diameter. For L. bicolor S238N, inkubere dem ved 25 ° C i 5 dage på P20-agarmedium (0,25 g Dinh 4 tartrat; 0,5 g KH 2 PO 4; 0,25 g MgSO4 .7H 2 O; 1 g glucose D + ; 0,5 ml 10% thiamin-HCI, 0,5 ml 1/10 fortyndet mikronæringsstoffer opløsning (cf 1.1.2.1), fyldt op til 1 l med deioniseret vand; og 20 g agar; pH 5,5).
Bemærk: På grund af den præ-kultur på cellofan, vil den anden kultur ikke indeholde agarmedier i de centrale propper. De agar propper bør fjernes for yderligere analyse af biofilm, da disse propper indføre agar og næringsstoffer, der kan skabe bias i analysen. Dette trin vedrører kun svampearter, der holdes og opformeres på agarplader, og det er ikke nødvendigt for svampe, der er opformeret fra sporer eller frosne lagre.
- Fremstilling af bakteriekulturer
- Brug en steril løkke for at indsamle 2 til 3 individuelle bakteriekolonier fra en kultur på passende agarmedium og pode 25 ml flydende Luria-Bertani (LB) medium (eller ethvert andet passende medium, afhængigt af den anvendte stamme). For P. fluorescens BBc6, inkuberes en overnatskultur ved 28 ° C med forsigtig omrystning (~ 150 rpm).
Bemærk: Brug af en stammeopmærket med fluorescerende protein, såsom GFP, foretrækkes, fordi derved undgår at udføre en dobbelt-farvning (svamp og bakterier) forud for mikroskopiske observationer. Timingen, omrøringshastigheden, og temperaturen af inkubationen afhænger af anvendte stamme, idet målet er at opnå en kultur i sen eksponentiel vækst.
- Brug en steril løkke for at indsamle 2 til 3 individuelle bakteriekolonier fra en kultur på passende agarmedium og pode 25 ml flydende Luria-Bertani (LB) medium (eller ethvert andet passende medium, afhængigt af den anvendte stamme). For P. fluorescens BBc6, inkuberes en overnatskultur ved 28 ° C med forsigtig omrystning (~ 150 rpm).
2. Udarbejdelse af N In Vitro Biofilm Bacteria på Fungal Colony
- Centrifuger bakteriekulturen ved 5000 xg i 3 min og suspenderer pellet i 25 ml sterilt 0,1 M kaliumphosphatpuffer (25 g / L KH 2 PO 4 og 2,78 g / LK 2 HPO 4, pH 5,8). Gentag dette trin én gang og justere den endelige bakterielle fusions 10 9 celler / ml med den samme buffer.
- Fyld en 6-brønds mikroplade med 5 ml bakteriesuspension (eller steril 0,1 M kaliumphosphatpuffer for den negative kontrol).
- Skær cellofan membran af fungal kultur med en steril barberblad til opnåelse kvadrater af cellofan med en enkelt fungal koloni på hver membran. Fjern forsigtigt cellofan firkanter indeholder hyfer fra det faste medium med pincet og overføre kvadratet på cellofan indeholder hyfer til en brønd af mikropladen indeholder den bakterielle suspension.
- Ryst forsigtigt mikropladen mens de fungale kolonier stadig er fastgjort til cellofan; Fjern derefter cellofan ark, efterlader de fungale kolonier i pladen.
- Inkubér mikropladen under forsigtig omrøring (~ 60 rpm) ved en temperatur tilpasset de undersøgte mikroorganismer.
Bemærk: Inkubationstiden afhænger af hastigheden af etableringen af biofilmen og scenen, der skal analyseres. For P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, inkuberes ved 20 ° C i 30 min for at få den tidlige fase biofilm og op til 16 timer for at få modne biofilm.
3. Laser Scanning konfokal mikroskopi Analyse af Biofilm Formation
- Prøveforberedelse
- At fjerne planktoniske bakterier og bakterier elektrostatisk-bundet til hyfer, skylles svampen ved at overføre den til en ny 6-brønds mikroplade fyldt med 5 ml af en stærk saltopløsning (NaCl, 17 g / l) 17; ryst forsigtigt i 1 min.
- Overfør svampen til en ny 6-brønds mikroplade indeholdende 5 ml steril 0,1 M kaliumphosphatbuffer, ryst forsigtigt i 2 min, og overføre svampen til frisk kaliumphosphatbuffer.
- Skær den del af det fungale koloni, der skal afbildes med en skalpel og samtidig holde den i kaliumphosphatbuffer, sådan at det opnåede afsnit indeholder ca. halvdelen af det fungale koloni.
- At farve prøven, overføre den til en petriskål fyldt med sterilt vand indeholdende et passende fluorescerende farvestof (afhængigt af formålet med analysen), og inkuber det i mørke.
- For at visualisere svampe netværk, bruge, for eksempel, Congo Rød (0,1% sidste concentration, 5 minutters inkubation), hvedekim agglutin (WGA) lectin konjugeret til Alexa Fluor 633 (10 ug / ml slutkoncentration, 10 minutters inkubation) eller FUNK 1 (10 uM slutkoncentration, 10 minutters inkubation).
- Hvis der anvendes en ikke-fluorescerende-mærket bakterie, kontrastfarve bakteriecellerne med en DNA-specifik fluorescerende probe blandt de mange celle-permeant DNA farvestoffer kommercielt tilgængelige. Brug f.eks DAPI (0,25 ug / ml slutkoncentration, 10 minutters inkubation).
- For at visualisere matrixproteiner, bruge et protein plet 21.
- Efter farvningen skylles prøven ved at overføre den til en petriskål låg indeholdende 10 ml steril 0,1 M kaliumphosphat og ryst forsigtigt i 1 min.
- Halvdelen nedsænkes et dias i petriskålen låg og fint bringe den afskårne sektion til at flyde over dias. Derefter langsomt fjerne objektglasset fra pufferopløsningen, lade prøven forsigtigt sætte sig på objektglasset.
- Endelig tilsættes 10 ul anti-fading montering medium til prøven og dække det med et dækglas.
Bemærk: Når slæden er fremstillet, skal udføres den mikroskopiske analyse snarest muligt (inden for højst 30 min) for at undgå ændringer i biofilmen struktur.
- Konfokal mikroskopisk analyse
- Undersøg dias under en konfokal laser mikroskop med en 10X eller 40X objektiv koblet til imaging software.
Bemærk: Her, en multi-beam konfokalt udstyret med 405, 488, og 561 nm excitations- lasere, en Gaasp PMT detektor, og 10X 0,3 NA og 40X 1.2 NA mål blev anvendt.- Udfør billeddannelse ved hjælp af parametre, der er tilpasset den type data anmodet om, og til den tid begrænser. Bruge laser excitation / emissionsbølgelængder ifølge pletten anvendes, og til fabrikantens recommendations. Brug en kombination af flise-scanning og Z-stakken funktioner til at opnå globale 3D visninger af svampe koloni og biofilm.
Bemærk: Billeder på figur 3 er erhvervet ved anvendelse af følgende parametre: 8-bit / pixel, gennemsnitsperioder = 2, pixel dvæle = 1,58 mikrosekunder, fliser scanning af 5x5 billeder med online syning (10% dækning, tærskel = 0,7); Z-trin = 2 um.
- Udfør billeddannelse ved hjælp af parametre, der er tilpasset den type data anmodet om, og til den tid begrænser. Bruge laser excitation / emissionsbølgelængder ifølge pletten anvendes, og til fabrikantens recommendations. Brug en kombination af flise-scanning og Z-stakken funktioner til at opnå globale 3D visninger af svampe koloni og biofilm.
- For 3D datavisualisering, bruge en af de mange gratis eller kommercielle software (disse tilbyder mange muligheder for 3D-gengivelse).
- For eksempel, for at vise Z-stack data som 2D maksimal intensitet fremskrivninger, trække den lyse-feltet kanal, justere lysstyrke og kontrast, og flette kanaler for at skabe et sammensat billede. Hvis de er til stede, fjerner skiver uden signal på Z-stack ekstremiteter. Udfør derefter en 2D maksimal intensitet projektion og konvertere resultatet i RGB farve. Brug "Z projektet" funktion i ImageJ software 22 for at opnå den billeder pilde her ved 2D maksimal intensitet fremskrivninger.
- Undersøg dias under en konfokal laser mikroskop med en 10X eller 40X objektiv koblet til imaging software.
4. Electron Microscopy Analyse
- Forberede prøverne som beskrevet for LSCM, undtagen i trin 3.1.2, overføre biofilm til sterilt vand i stedet for kaliumphosphatbuffer efter skyllestationerne trin. Dette undgår dannelsen af saltkrystaller under tørringen trin, hvilket ville forstyrre SEM billeddannelse.
- Overfør biofilm til en prøveholder og fjerne overskydende vand; kun tillade en lille hinde af vand til at dække prøven.
- Overfør prøven til kammeret af en variabel-tryk scanning elektronmikroskop (VP-SEM); fryse den til -50 ° C på en Peltier køletrin; og lad det langsomt frysetørres, direkte i SEM kammeret, med 100 Pa variabelt tryk indstillet i 15 timer.
- Efter afslutning af frysetørringen, hente prøven og overføre den til en højvakuum film deposition system. Coat prøven med 2 nm af platinm (kvarts måling) under argon plasma (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA).
- Observer overtrukket prøve med et SEM udstyret med en feltemissions pistol (FEG) under anvendelse af høj opløsning "i linse" detektor og en elektronisk høj spænding på 1 kV.
Representative Results
Den overordnede skematiske procedure af fungal kultur og biofilm fremstilling er angivet i figur 1. Kulturen metode tillod os at opnå svampekolonier 20 til 50 um tyk indeholder et par lag af hyfer, så mikro- og meso-skala analyser af hydreret levende biofilm hjælp LSCM. Anvendelsen af metoden tilladt købet af høj kvalitet billeder af P. fluorescens BBc6 biofilm på L. bicolor hyfer langs dannelsen af biofilm (figur 2 - 4).
Meso-skala analyse af biofilm demonstreret heterogen fordeling af biofilmen af P. fluorescens BBc6 på hyfer L. bicolor S238N (figur 2 og 3). Meso-skala analyse også tilladt for sporing af biofilmdannelse over tid (figur3) fra de tidlige trin, hvor kun nogle bakterier blev knyttet til hyfer (figur 3a), til dannelsen af en tyk, moden biofilm (figur 3b). Den høje opløsning af meso-skala billeder tilladt os at udføre mikroskala analyse på de samme billeder for at opnå koloni arkitekturer (figur 3C - D).
Mikro-skala analyse kombineret med den specifikke mærkning muligt for os at gå et skridt videre i biofilm karakterisering. Her, SYPRO Ruby 23, hvilke etiketter fleste klasser af proteiner, blev påført prøverne (Figur 4) og viser tilstedeværelsen af proteiner i matrixen.
Endelig blev yderligere detaljer af biofilm struktur opnået ved SEM billeddannelse af den samme prøve efter dehydrering og belægning (figur 5). SEM billeddannelse forudsatadgang til nanoskala niveau og derved give adgang til matrix-struktur.
Figur 1: Samlet skematisk proceduren fra fungal kultur og biofilm forberedelse. Dette tal beskriver de vigtigste trin i fremgangsmåden, fra mikroorganismekulturer til prøve analyser. Flere oplysninger findes i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: BBc6 biofilm fordelingen på den fungale koloni. Prøven blev afbildet efter 18 timer af interaktion på 10X forstørrelse. Billedet blev opnået via 2D maksimal intensitet projektion af 3D konfokal mikroskopi billeder. Det grå gitter på Figure viser de mosaik positioner. L. bicolor hyfer farves med Congo Rød (rød) og bakterier er GFP-mærkede (grønne). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tidlige og sene stadier af BBc6 biofilmdannelse på L. bicolor hyfer. Dette billede blev opnået via 2D maksimal intensitet projektion af 3D konfokal mikroskopi billeder. Billeddannelse blev udført ved 40X forstørrelse. (A) biofilm fordeling efter 2 timer af interaktion. (B) Biofilm fordelingen efter 14 timer af interaktion. (C) Udvidelse af hvid firkant i (a). (D) Udvidelse af det hvide rektangel i (b). Svampehyfer farves med Congo Rød (rød) og bakterier er GFP-tagged (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Matrix farvning af BBc6 biofilm på L. bicolor hyfer. (A) biofilm efter 16 timer af interaktion. (B) Udvidelse af hvid firkant i (a). Imaging blev udført ved 40X forstørrelse, og disse billeder blev opnået via 2D maksimal intensitet projektion af 3D konfokal mikroskopi billeder. Bakterier er GFP-mærkede (grønne), er svamp farvet med FUNK 1 (mørkegrøn), og proteiner farves med S. Ruby (rød). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: SEM billeddannelse af BBc6 biofilm på L. bicolor hyfer. SEM Imaging blev udført ved 2360X, EHT: 1kV. Før billeddannelse, prøven blev langsomt frysetørret i SEM kammer og belagt med platin. Grønne pile peger på bakterielle biofilm og gule pile peger på svampehyfer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Bakterielle biofilm hentes i mange miljøer og er blevet studeret siden 1950'erne, hvilket fører til udviklingen af en række metoder til at analysere dem 24. Klassiske metoder til at kvantificere og overvåge biofilm omfatter mikro-titer assays og, den mest udbredte metode, krystalviolet (CV) farvning. Disse fremgangsmåder er hurtige, billige og let at håndtere 25 og er især anvendelige til at kvantificere totale biofilm biomasse eller at udføre levedygtighed og matrix kvantificering assays. På en anden side "omik" metoder er også anvendelige i biofilm undersøgelser, der giver mulighed for kvantitative og funktionelle analyser af biofilm 26, 27. Trods af fordelene ved mikrotiterplade og "omics" metoder kan flere væsentlige kendetegn ved biofilm ikke indfanges med disse teknikker, hindrer en fuldstændig forståelse af denne proces. Sådanne funktioner omfatter matrix strukturs, bakterielle koloni arkitekturer, celle / celle-interaktioner, og kolonisering mønstre, som er vigtige data for at forstå både funktion biofilm og dynamikken i deres dannelse. Trods kapaciteten af mikroskopi til at indfange disse funktioner, mikroskopi analyse af bakterielle biofilm på filamentøse svampe er stadig sparsom. Dette skyldes primært væksten af filamentøse svampe, som ofte danner kolonier af tykke, komplekse, tredimensionale netværk. Dannelse af bakterielle biofilm på svampe er almindelig i forskellige miljøer og er signifikant involveret i forskellige områder 4 (fx medicin, landbrug og miljø.); Derfor er det vigtigt at udvikle nye metoder til at lette deres undersøgelse. Til dette formål har vi kombinerede en metode til at generere meget tynde fungale kolonier med mikroskopisk billeddannelse af de bakterielle biofilm. Desuden foreslog vi et sæt mikroskopi værktøjer til kvalitativt analysere disse biofilm. Succesen med fremgangsmåden afhængigevnen til at producere meget tynde svampetrådenes kolonier og anvende de relevante farvestoffer. Disse punkter er beskrevet nedenfor.
På grund af de komplekse strukturer af biofilm, forstå deres funktion kræver en multi-skala tilgang 28, 29. Distribution mønstre af biofilm, bakteriel koloni arkitektur, og matrix struktur og sammensætning analyseres på forskellige skalaer (dvs. meso-skala og mikro-skala). Desuden nanoskala giver adgang til celle / celle-fysiske interaktioner og nanostruktur af matricen. Således er den udviklede metode nemt kan en multi-skala analyse af de bakterielle biofilm dannet på den fungale koloni.
I de fleste undersøgelser, LSCM analyser af biofilm er begrænset til mikroskala, meso-skala normalt udføres af optisk kohærens tomografi 30, 31,
Denne kombination af analyser gav adgang samtidigt til biofilmen fordelingen på den fungale koloni, den bakterielle koloni arkitektur langs udvikle biofilm, og matrix-struktur. Meso-skala-analyse viste en heterogen fordeling af de bakterielle biofilm på de fungale kolonier (figur 2 og 3). Denne observation ville ikke have været muligt med protokoller, der kun tillader billeddannelse af en lille del af det fungale koloni, der ikke nødvendigvis er repræsentative for hele kolonien. Medensofte overset, meso-skala analyse kan give værdifulde oplysninger om biofilm fordelingsmønster.
Endelig kan den udviklede metode anvendes til at analysere prøver med forskellige mikroskopiteknikker, herunder scanning elektronmikroskopi. Her blev SEM bruges til at nå nanoskala og for at opnå den bakterielle rumlige organisation inden biofilmen. Det udførte meget godt med de tynde svampekolonier, mens SEM kun tilladt overflade billeddannelse. I modsætning til LSCM, SEM, dog kræves prøve dehydrering og, oftest, belægning med en ledende metal. Denne dehydrering proces kan ændre biologiske strukturer, når det ikke er korrekt udført, og kan kræve optimering. Her blev prøve dehydrering ved hjælp langsom frysetørring anvendt 33. Ikke desto mindre vil anvende både LSCM og SEM til prøverne tillader udførelse af korrelativ mikroskopi på samme sted af prøven.
På trods af fordelenebeskrevet ovenfor, er der visse begrænsninger. For det første kan det ikke være gældende for alle slags svampe. Faktisk er denne dyrkningsmetode udviklet for svampe spredes radialt på overfladen af faste medier. Denne metode kan ikke være egnet for svampe, der danner hovedsageligt lufthyfer (f.eks Fusarium sp.) Eller til mikro-aerob svampe spredes hovedsageligt inde agar. Desuden kan svampe nedbrydende cellofan være problematisk samt (f.eks., Trichoderma sp.). For det andet er det vigtigt at bemærke, at farvningen strategi er et kritisk punkt og valget af pletten skal foretages omhyggeligt, da pletten ikke må forstyrre biofilmen. For eksempel bemærkede vi, at Calcofluor White forårsagede delvis biofilm afbrydelse (data ikke vist), sandsynligvis på grund af den høje pH af denne plet. Også nogle farvestoffer produceret heterogen farvning (f.eks., Congo Red), mens andre producerede homogen farvning (f.eks., Cellevæggen farvning med WGA-lectin), hvilket giver en heterogen billedkvalitet.Desuden er det vigtigt at være opmærksom på at nogle farvestoffer måske ikke være helt specifik. For eksempel WGA pletter ikke kun fungal celle vægge, men også N-acetylneuraminsyre i grampositive bakterielle cellevægge og adhæsiner produceret af gram-positive og -negative bakterier under biofilmdannelse 34, 35. Derfor bruger fluorescerende protein-mærkede bakterier og / eller svampe anbefales at undgå multipel farvning. Hvis der anvendes flere farvestoffer, må de ikke kemisk blande sig, og deres emissionsspektre bør ikke overlappe.
Meso-skala analyser kræver et stort scanningsområde, og derfor kan LSCM være tidskrævende (40 min til 1 time, afhængigt af tykkelsen prøve) og flaskehals analyse af et stort antal prøver. Ikke desto mindre kan justeringer gøres afhængigt af typen af data, der kræves. Det er muligt at reducere erhvervelse tid og billedstørrelse ved at ændre billedkvaliteten. For eksempel, høj opløsninger ikke nødvendigt at analysere biofilmen generelle fordeling.
Endelig skal overvejes, når du vælger at vise Z-stack data som 2D eller 3D projektioner nogle begrænsninger. To-dimensionelle fremskrivninger er en god måde at opsummere data, men oplysninger dybde er tabt, og overlappede strukturer bliver skjult. På den anden side, 3D projektioner tillader visualisering fra forskellige synsvinkler, men de ofte gør dårligt i tilfælde af rumlig kompleksitet.
Som konklusion har vi rapporteret en fremgangsmåde til karakterisering af bakterielle biofilm på hyfer på det strukturelle niveau. Metoden kan udvides til andre programmer. Faktisk har denne fremgangsmåde tillader udførelsen af funktionelle eller kemisk karakterisering af bakterielle biofilm dannes på svampehyfer. På grund af det store udvalg af eksisterende fluorescerende reporter-systemer, kan LSCM analyse bruges til flere formål 29. For eksempel fluorescensen microscopy kunne anvendes til at overvåge pH-gradient 36 eller molekyle diffusion i biofilm 37. Derudover metoden giver mulighed for fællesskab analyse i flere arter biofilm. For eksempel, fluorescens in situ hybridisering rettet mod specifikke bakterielle grupper er særligt nyttigt at studere specifikke bakteriel fordeling i flere arter biofilm 38, 39. Last, talrige fluorescerende farvestoffer kan anvendes til at karakterisere matrix sammensætning af biofilm 21. Her blev proteiner målrettet anvendelse af SYPRO, som farver en lang række proteiner, deriblandt matrixproteiner (figur 4), men andre farvestoffer muliggøre visualisering af andre vigtige matrixbestanddele, såsom exopolysaccharider eller ekstracellulært DNA. Interessant nok kunne alle disse analyser udføres på meso-skala ved anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde. Da LSCM kan udføres på levende prøver,det er også muligt at opnå time-lapse billeddannelse ved anvendelse af for eksempel coverwell kamre, særligt velegnet til tynde fungale kolonier. Denne mulighed er særlig interessant, da biofilmdannelse er en kompleks, dynamisk proces. Endelig en kvantitativ formål kan den rapporterede metode forbedre nøjagtigheden af automatiske kvantitativ analyse ved at gøre denne kvantificering mulig på meso-skala billeder. Dette kan overvinde biofilm heterogenitet og statistiske spørgsmål 29.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Falcon Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 08-772-33 | Used in 2.2 & 3.1 |
| Congo Red | Fisher Scientific | C580-25 | Used in 3.1.4.1 |
| FUN 1 Cell Stain | Thermo Fisher Scientific | F7030 | Used in 3.1.4.1 |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | Used in 3.1.4.1 |
| DAPI solution | Thermo Fisher Scientific | 62248 | Used in 3.1.4.2 |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Used in 3.1.4.3 |
| FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain | Thermo Fisher Scientific | F10318 | Used in 3.1.4.4 |
| Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Used in 3.1.7 |
| LSM780 Axio Observer Z1 | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| ZEN 2.1 lite black software | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| High Vacuum Coater Leica EM ACE600 | Leica | Used in 4 | |
| GeminiSEM-FEG | Zeiss | Used in 4 |
References
- Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).
- Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
- Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14558-14563 (2009).
- Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29 (3), 293-296 (2004).
- Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. , 739-743 (2008).
- Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00 (0), 1-10 (2014).
- Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7301-7309 (2005).
- Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94 (1), 149-156 (2010).
- Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8 (9), 623-633 (2010).
- Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244 (2012).
- Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28 (1), 1-5 (2014).
- Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
- Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6 (12), 1399-1437 (2011).
- Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
- Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. , (2014).
- Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176 (1), 22-36 (2007).
- Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2 (4), 560-568 (2010).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
- Rasband, W. S. imagej. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
- Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2 (5), 486-498 (2002).
- Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25 (1), 31-42 (2013).
- Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31 (4), 477-485 (2009).
- Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10 (9), 4105-4119 (2011).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8 (3), 203-208 (2009).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
- Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11 (3), 34001 (2006).
- Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47 (7), 2531-2542 (2013).
- Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47 (6), 2085-2095 (2013).
- Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34 (1), 26-36 (2012).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).
- Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).
- Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6 (3), (2011).
- Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155 (8), 2603-2611 (2009).
