Summary
Этот протокол описывает новый метод, чтобы расти и качественно анализировать бактериальных биопленок на грибными гифами с помощью конфокальной и электронной микроскопии.
Abstract
Бактериальные биопленки часто образуют на поверхности грибов и могут быть вовлечены в многочисленных процессах бактериально-грибковые взаимодействия, такие как метаболический сотрудничества, конкуренции или хищничества. Изучение биопленки имеет важное значение во многих биологических областях, в том числе экологической науки, производства продуктов питания и медикаментов. Однако немногие исследования были сосредоточены на таких бактериальных биопленок, частично из-за трудности их изучения. Большинство методов для качественного и количественного анализа биопленки, описанных в литературе, пригодны только для биопленки, образующих на абиотических поверхностях или на однородных и тонких биотических поверхностях, таких как монослой эпителиальных клеток.
В то время как лазерный сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) часто используется для анализа на месте , и в естественных условиях биопленки, эта технология становится очень сложной задачей при применении к бактериальных биопленок на грибными гифами, из - за толщины и трех измерениях гиф NETWорки. Чтобы преодолеть этот недостаток, мы разработали протокол сочетающую микроскопии с методом, чтобы ограничить накопление гиф слоев в колонии грибов. Используя этот метод, мы смогли исследовать развитие бактериальных биопленок на грибными гифами в различных масштабах с использованием как LSCM и сканирующей электронной микроскопии (SEM). Этот отчет описывает протокол, в том числе культур микроорганизмов, бактериальных условий образования биопленки, биопленки окрашивания и LSCM и SEM визуализаций.
Introduction
Грибы и бактерии имеют много возможностей для взаимодействия друг с другом, потому что они сожительствуют в большинстве наземных условиях. Благодаря своему разнообразию и их повсеместность, эти взаимодействия играют важную роль во многих биологических областях, включая биотехнологии, сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицине и 1, 2. Межмолекулярные взаимодействия требуют определенной степени близости , чтобы позволить обмен между партнерами, а в некоторых случаях, физическое объединение партнеров необходимо для функционального взаимодействия 3. Распространенным физическая ассоциация между бактериями и грибами является формирование бактериальных биопленок на грибковые поверхностей 4. Это прямой контакт между бактериальными клетками и грибными гифами позволяет интимных взаимодействий, которые участвуют в различных биологических процессах. Например, в медицине, при изучении образования биопленки синегнойной палочки на возtunistic грибкового патогена Candida Albicans может дать представление о взаимосвязи между образованием биопленки и вирулентность 5. В сельском хозяйстве, исследования показывают, что рост растений, способствующие ризобактерий и биоконтроля бактерии обладают повышенной эффективностью, когда ассоциируется с грибком в смешанном биопленки. Например, Bradyrhizobium elkanii повысили N 2 -fixing активность , когда связанная с вешенки OSTREATUS в смешанном биопленки 6. И, наконец, в биоремедиации, бактериально-грибковые смешанные биопленки используются для рекультивации загрязненных участков 7, 8.
LSCM особенно хорошо подходит для изучения биопленки, так как она позволяет трехмерного наблюдения живых гидратированных биопленок с минимальными предварительной обработки, тем самым сохраняя структуру биопленки и организации. Таким образом, анализ биопленки LSCM очень информативен, особенно опргорностаевым временной ход образования биопленки и обнаружение характерных стадий 9, 10, на стадии адгезии к развитию зрелой биопленки. Он также особенно приспособлен для визуализации структуры биопленки и матрицы 11, 12 или для количественного определения размера биопленки 13, 14. Хотя этот метод пригоден для изучения биопленки на абиотических или биотических тонких поверхностей, изучение бактериальной биопленки на грибковой нитчатых колонии по-прежнему очень сложно. В самом деле, большинство нитчатые грибы строить толстые, сложные, трёхмерной сети в культуре. Даже если толстые объекты могут быть отображены с помощью конфокальной микроскопии, ослабление проникновения лазерного и флуоресцентное излучение часто снижают качество конечных изображений на глубину 50 мкм 15. Кроме того, поскольку грибковые колонии не являются жесткими, ят трудно обрабатывать микроорганизмы, не нарушая биопленки. Из - за толщины образцов, несколько микроскопических анализов бактериальных биопленок на грибными гифами, как правило , выполняются только на небольшой части грибковой колонии, поэтому , содержащий лишь немногие гифы 16, 17, 18. Все это ограничивает нашу способность описывать распределение биопленки на грибковые колонии и, таким образом, может привести уклоны в анализ в случае гетерогенного распределения биопленки внутри грибковой колонии.
Чтобы преодолеть эти трудности, мы приводим метод для роста и анализа бактериальной биопленки на грибными гифами. Этот метод был применен для изучения образования биопленки в Pseudomonas Шогезсепз BBc6 на гифы эктомикоризных базидиомицета Laccaria биколор S238N. Эти два леса-почвенные микроорганизмы, ранее были описаны для формирования смешаннойбиопленки структуры типа 19, 20. Этот метод легко может быть дополнительно адаптирован для других мицелиальных грибов / бактериальных системах. Изложенный здесь метод основан на сочетании метода грибковой культуры, что позволяет для роста очень тонких колоний гриба, с LSCM и визуализации SEM. Это позволило нам получить микро- (диапазон мкм) и мезо- (диапазон мм) масштабировать вид взаимодействия между двумя микроорганизмами, позволяя для качественной характеристики биопленки. Мы также показали, что образцы можно наблюдать с SEM, что позволяет структурный анализ биологической пленки на уровне нано-масштаба (диапазон нм).
Protocol
1. Получение бактериальными и грибковыми культур
- Получение культур грибов
- Готовят целлофановые мембраны с тем же диаметром, как чашки Петри, и сварить их в ЭДТА (1 г / л в деионизированной воде) в течение 30 мин. Промыть листы с деионизированной водой и автоклав их дважды.
- Приготовьте грибковой предварительной культуры инокулируя грибковый агар пробки на соответствующей агаровой среде, покрытой ЭДТА предварительно обработанной целлофановой мембраны. Выдержите его при оптимальной температуре роста для получения колониям около 1 см в диаметре.
- Для Л. двухцветной S238N, инкубировать при 25 ° С в течение 5 дней на среде с агаром Pachlewski Р5 из 0,5 г diNH4 тартрат, 1 г KH 2 PO 4, 0,5 г MgSO 4 · 7H 2 O, 5 г мальтозы D + , 20 г глюкозы D +, 1 мл 10% тиамина-HCl, 1 мл разбавленного раствора 1/10 микронутриентов (6 г / л сульфата железа, 0,27 г / л молибдена trioxyde; 8,45 г / л борной кислоты, 5 г / L человекganese сульфат; 5 г / л сульфат меди; 2,27 г / л сульфата цинка) доводят до 1 л деионизированной водой; и 20 г агара; рН 5,5.
- Из грибкового предварительной культуры, прививают новую агара пластину, покрытую ЭДТА предварительно обработанную целлофановой мембраны, содержащей среду агара с низким содержанием углерода, чтобы способствовать радиальному расширению колоний.
- Для инокуляции чашки Петри, осторожно поцарапать внешнюю зону (где клетки имеют такую же физиологическое состояние) грибковой колонии из предварительной культуры с скальпелем и передать гифы на новую чашку с агаром.
- Выдержите при оптимальной температуре роста, пока новые колонии не приблизительно 1 см в диаметре. Для Л. двухцветной S238N, инкубировать их при 25 ° С в течение 5 дней на Р20 агаровой среде (0,25 г Dinh 4 тартрата; 0,5 г KH 2 PO 4; 0,25 г MgSO 4 · 7H 2 O, 1 г глюкозы D + ; 0,5 мл 10% -ного тиамина-HCl, 0,5 мл разбавленного раствора 1/10 микронутриентов (КФ 1.1.2.1), доливают до 1 л деионизированной водой; и 20 г агара; рН 5,5).
Примечание: В связи с предварительной культуры на целлофан, вторая культура не будет содержать агаре в центральных пробок. Агаровые пробки должны быть удалены для дальнейшего анализа биопленки, так как эти пробки ввести агар и питательные вещества, которые могут создать перекосы в анализе. Этот шаг касается только видов грибов, которые хранятся и размножали на чашках, и это не является необходимым для грибов, которые распространяются от спор или замороженных запасов.
- Приготовление бактериальных культур
- Используйте стерильную петлю для сбора от 2 до 3 отдельных колоний бактерий из культуры на соответствующей агаровой среде и инокуляции 25 мл жидкого Лурии-Бертани (LB) среде (или любой другой подходящей среде, в зависимости от используемого штамма). Для П. Шогезсепз BBc6, инкубировать ночной культуры при 28 ° С при осторожном встряхивании (~ 150 оборотов в минуту).
Примечание: Использование штаммапомечены флуоресцентным белком, таким как GFP, является предпочтительным, так как это позволяет избежать выполнения двойного окрашивания (грибок и бактерии) до микроскопических наблюдений. Время, скорость перемешивания, и температура инкубации зависит от используемого штамма, то цель состоит в том, чтобы получить культуры в конце экспоненциального роста.
- Используйте стерильную петлю для сбора от 2 до 3 отдельных колоний бактерий из культуры на соответствующей агаровой среде и инокуляции 25 мл жидкого Лурии-Бертани (LB) среде (или любой другой подходящей среде, в зависимости от используемого штамма). Для П. Шогезсепз BBc6, инкубировать ночной культуры при 28 ° С при осторожном встряхивании (~ 150 оборотов в минуту).
2. Получение N In Vitro биопленки бактерий на грибной колонии
- Центрифуга бактериальной культуры при 5000 х г в течение 3 мин и приостанавливать осадок в 25 мл стерильного фосфатного буфера 0,1 М калия (25 г / л KH 2 PO 4 и 2,78 г / Л.К. 2 HPO 4, рН 5,8). Повторите этот шаг , один раз и корректировки конечного бакконцентратах до 10 9 клеток / мл тем же буфером.
- Заполните микропланшет 6-луночный с 5 мл бактериальной суспензии (или стерильного 0,1 М калий-фосфатного буфера для отрицательного контроля).
- Вырезать целлофановую оболочку Fungаль культуры стерильным лезвием бритвы, чтобы получить квадраты целлофан с одной грибковой колонии на каждой мембране. Осторожно снимите целлофан квадраты, содержащие гифы из твердой среды с помощью пинцета и передать квадрат целлофана, содержащий гиф в лунку микропланшета, содержащей бактериальную суспензию.
- Слегка встряхните микропланшет в то время как грибковые колонии все еще прикреплены к целлофан; Затем удалите целлофановые листы, оставляя грибковые колонии в пластине.
- Инкубируйте микропланшет при осторожном перемешивании (~ 60 оборотов в минуту) при температуре, адаптированной к исследуемых микроорганизмов.
Примечание: Время инкубации зависит от скорости создания биопленки и стадии анализа. Для P. Шогезсепз BBc6 / л. биколор, инкубировать при температуре 20 ° С в течение 30 мин, чтобы получить на ранней стадии развития биопленок и до 16 часов, чтобы получить зрелые биопленки.
3. Лазерное сканирование конфокальной микроскопии Анализ формата биопленкиион
- Базовые приготовления
- Чтобы удалить планктонные бактерии и бактерии электростатически , прикрепленные к гиф, полоскание грибок путем переноса его на новый 6-луночный микропланшет , заполненную 5 мл сильного солевого раствора (NaCl, 17 г / л) 17; осторожно встряхивают в течение 1 мин.
- Перенести грибок на новый 6-луночный микропланшет, содержащий 5 мл стерильного фосфатного буфера 0,1 М калий, осторожно встряхивают в течение 2 мин, а также передавать грибок на свежий калий-фосфатного буфера.
- Вырезать часть грибковой колонии быть визуализируют с помощью скальпелем, держа его в буфере фосфат калия, таким образом, что полученный раздел содержит около половины грибковой колонии.
- Для того, чтобы окрасить образец, передать его в чашке Петри заполнены стерильной водой, содержащей соответствующий флуоресцентный краситель (в зависимости от цели анализа), и инкубировать в темноте.
- Для визуализации грибковые сеть, использовать, например, Конго красный (0,1% конечная соncentration, 5 мин инкубации), зародыши пшеницы agglutin (РГА) лектин, конъюгированного с Alexa Fluor 633 (10 мкг / мл конечной концентрации, 10 мин инкубации) или FUN1 (10 мкМ конечная концентрация, 10 мин инкубации).
- При использовании нефлуоресцирующего-меченый бактерии, контрастирующая бактериальных клеток с ДНК специфических флуоресцентных зондов среди многочисленных клеточных проникающего красителей ДНК коммерчески доступных. Например, можно использовать DAPI (0,25 мкг / мл конечная концентрация 10 мин инкубации).
- Для визуализации матричных белков, используют белок пятно 21.
- После окрашивания промыть образец путем переноса его в чашку Петри, содержащую крышку 10 мл стерильного 0,1 М фосфата калия и осторожно встряхивают в течение 1 мин.
- Половина погрузите слайд в чашку Петри крышкой и деликатно довести секцию выреза плавающим над горкой. Затем медленно удалить слайд из буферного раствора, что позволяет образец мягко оседают на слайде.
- Наконец, добавьте 10 мкл анти-выцветанию монтажной среды к образцу и покрыть ее покровным стеклом.
Примечание: После того, как ползун подготовлен, микроскопический анализ должен быть выполнен как можно скорее (в течение не более 30 мин), чтобы избежать изменений в структуре биопленки.
- Конфокальной микроскопический анализ
- Проверьте слайды под конфокальной лазерной микроскоп с 10-кратным или 40х объективом в сочетании с программным обеспечением визуализации.
Примечание: Здесь, многолучевой сканирующий конфокальный микроскоп оборудован 405, 488 и 561 нм лазеров возбуждения, детектор Gaasp PMT и 10X 0,3 NA и 40Х 1.2 Цели NA использовалась.- Выполнение обработки изображений с использованием параметров, адаптированных к типу данных, запрашиваемых и к нехватки времени. Использование лазерных длинах волн возбуждения / эмиссии в соответствии с красителем, используемой и recommendati изготовителядополнения. Использование комбинации плитки сканирования и функции Z-стека, чтобы получить глобальные 3D вид грибковой колонии и биопленки.
Примечание: Изображения на рисунке 3 , были получены с использованием следующих параметров: 8 бит / пиксель, в среднем = 2, пиксель = 1,58 обитать микросекунды, плитки сканирование 5х5 изображений с онлайн - шить (10% покрытия, пороговое значение = 0,7); Z-шаг = 2 мкм.
- Выполнение обработки изображений с использованием параметров, адаптированных к типу данных, запрашиваемых и к нехватки времени. Использование лазерных длинах волн возбуждения / эмиссии в соответствии с красителем, используемой и recommendati изготовителядополнения. Использование комбинации плитки сканирования и функции Z-стека, чтобы получить глобальные 3D вид грибковой колонии и биопленки.
- Для визуализации данных 3D, использовать один из многочисленных бесплатных или коммерческих программного обеспечения (они предлагают множество вариантов для 3D-рендеринга).
- Например, для отображения данных Z-Stack в виде 2D проекций максимальной интенсивностью, вычитать канал светлого поля, регулировать яркость и контрастность, а также объединить каналы для создания составного изображения. Если они присутствуют, устранить ломтиков без сигнала на концах Z-стека. Затем выполнить проекцию максимальной интенсивности 2D и преобразовать результат в цвет RGB. Используйте функцию "Z проекта" в программном обеспечении 22 ImageJ для получения изображения рвозмущало здесь 2D проекций максимальной интенсивностью.
- Проверьте слайды под конфокальной лазерной микроскоп с 10-кратным или 40х объективом в сочетании с программным обеспечением визуализации.
4. Электронная микроскопия Анализ
- Подготовка образцов, как описано для LSCM, за исключением того, на шаге 3.1.2, передача биопленки в стерильной воде вместо буфера на основе фосфата калия после стадий промывки. Это позволяет избежать образования кристаллов соли в процессе стадии дегидратации, которая будет возмущать изображений SEM.
- Передача биопленки в держатель образца и удаления избытка воды; только позволяют небольшую пленку воды, чтобы покрыть образец.
- Переносят образец в камере переменного давления сканирующего электронного микроскопа (VP-SEM); заморозить до -50 ° С на стадии охлаждения Пельтье; и дайте ему медленно заморозить сухой, находится прямо в камере SEM, с 100 Па переменного давления, установленного в течение 15 часов.
- После завершения сушки вымораживанием, извлечения образца и передать его в систему осаждения пленки высокого вакуума. Покрыть образец с 2 нм platinuм (измерение кварц) в атмосфере аргона в плазме (2,5 х 10 -2 мбар, 35 мА).
- Обратите внимание на образец с покрытием с помощью сканирующего электронного микроскопа, оснащенного пушки полевой эмиссии (FEG), используя высокое разрешение "в объективе" детектор и электронное высокое напряжение 1 кВ.
Representative Results
Общая схематичное процедура грибковой культуры и подготовки биопленки приведены на рисунке 1. Метод культивирования позволило получить грибковые колонии от 20 до 50 мкм , содержащие несколько слоев гиф, позволяя микро- и мезомасштабную анализ гидратированного живой биопленки с использованием LSCM. Применение метода позволило приобретение высококачественных изображений P. Шогезсепз BBc6 биопленок на L. биколор гиф по формированию биопленки (рис 2 - 4).
Мезомасштабного анализ биопленок продемонстрировал гетерогенная распределение биопленки Р. Шогезсепз BBc6 на гиф L. биколор S238N (рисунки 2 и 3). Мезомасштабная анализ также позволил для отслеживания формирования биопленок с течением времени (рис3) с первых шагов, в котором только некоторые бактерии были прикреплены к гиф (рис 3а), с образованием густой, зрелой биопленки (рис 3b). Высокое разрешение мезо-масштабных изображений позволило нам выполнить микропланировка анализ на одних и тех же изображений , с тем чтобы получить Колонию архитектур (фиг.3С - г).
Анализ микро-масштабе в сочетании с конкретными маркировки позволили нам сделать еще один шаг в биопленки характеристике. Здесь, Sypro рубин 23, которая маркирует большинство классов белков, был применен к образцам (рисунок 4) и показывает присутствие белков в матрице.
Наконец, дальнейшие детали структуры биопленки были получены с помощью SEM изображений одного и того же образца после обезвоживания и покрытия (рисунок 5). SEM изображения при условии,доступ к наномасштабе, таким образом, давая доступ к матричной структуре.
Рисунок 1: Общая схематичное процедура грибковой культуры и подготовки биопленки. На этом рисунке описываются основные этапы способа, из культур микроорганизмов к образцу анализов. Более подробная информация приведена в протоколе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: BBc6 биопленки Передел на грибковой колонии. Образца было получено после того, как 18 ч взаимодействия при 10-кратным увеличением. Изображение получено с помощью 2D максимальной интенсивности проекции 3D изображений конфокальной микроскопии. Серая решетка на FIGUвновь изображает мозаичные позиции. L. биколор гифы окрашивали Конго красный (красный) и бактерии являются GFP-меченый (зеленый). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Ранние и поздние этапы формирования BBc6 биопленки на L. биколор гиф. Это изображение было получено с помощью 2D максимальной интенсивности проекции 3D изображений конфокальной микроскопии. Визуализацию проводили при 40-кратном увеличении. (А) биопленок переделу через 2 ч взаимодействия. (Б) биопленки передел после 14 ч взаимодействия. (С) Расширение белого прямоугольника в (а). (Г) Увеличение белого прямоугольника в (б). Грибковые гифы окрашивали Конго красный (красный) и бактерии являются GFP-таgged (зеленый). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Матрица окрашивание BBc6 биопленки на L. биколор гиф. (А) биопленок после 16 ч взаимодействия. (Б) Увеличение белого прямоугольника в (а). Визуализацию проводили при 40-кратном увеличении, и эти изображения были получены с помощью 2D максимальной интенсивности проекции 3D изображений конфокальной микроскопии. Бактерии являются GFP-меченый (зеленый), гриб окрашивали fun1 (темно-зеленый), и белки окрашивали С. Рубин (красный). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: SEM визуализации BBc6 биопленок на L. биколор гиф. SEM визуализации проводили при 2360X, EHT: 1кВ. Перед изображениями, образец медленно сублимационной сушке в камере SEM и покрыта платиной. Зеленые стрелки указывают на бактериальные биопленки и желтые стрелки указывают на грибными гифами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Бактериальные биопленки извлекаются во многих средах и изучаются с 1950 - х годов, что привело к развитию целого ряда методов для их анализа 24. Классические методы для количественного определения и мониторинга биопленки включают в себя микро-титр анализы и, наиболее широко используемый метод, кристаллический фиолетовый (CV) окрашивания. Эти методы являются быстрыми, низкая стоимость, и простой в обращении 25 и особенно полезны для количественной оценки общей биомассы биопленки или для выполнения жизнеспособности и матрицы количественной оценки анализов. На другой стороны, "omics" методы также могут быть использованы в исследованиях биопленки, что позволяет количественных и функциональных анализов биопленок 26, 27. Несмотря на преимущества микро-титр пластины и "omics" методами, несколько существенных признаков биопленки не могут быть захвачены с этими методами, что затрудняет полное понимание этого процесса. Такие особенности включают в матричную структуруs, бактериальные колонии архитектуры, клеток / клеточных взаимодействий и моделей колонизации, которые являются ключевыми данными для понимания как функционирования биопленок и динамику их формирования. Несмотря на способности микроскопии для захвата этих функций, микроскопия анализ бактериальных биопленок на нитчатых грибов все еще являются дефицитными. Это происходит главным образом за счет роста нитчатых грибов, который часто образует колонии толстые, сложные, трёхмерной сети. Формирование бактериальных биопленок на грибов часто встречается в различных средах и в значительной степени участвуют в различных областях 4 (например, медицина, сельское хозяйство и окружающая среда.); следовательно, имеет решающее значение для разработки новых методов для облегчения их расследования. С этой целью мы объединили метод для создания очень тонких грибковые колонии с микроскопической визуализации бактериальных биопленок. Кроме того, мы предложили набор инструментов микроскопии качественно проанализировать эти биопленки. Успех метода опираетсяспособность производить очень тонкие колонии Гифальная и применять соответствующие красители. Эти вопросы обсуждаются ниже.
Из - за сложных структур биопленки, понимание их функции требует многомасштабное подхода 28, 29. Распределительные модели биопленок, бактериальной архитектуры колонии и матричной структуры и состава анализируются в различных масштабах (т.е., мезомасштабную и микромасштабных). Кроме того, наноразмерных разрешение позволяет получить доступ к ячейке / клеточных физических взаимодействий и нано-структуры матрицы. Таким образом, разработанный метод позволяет легко многомасштабное анализ бактериальных биопленок, сформированных на грибковой колонии в.
В большинстве исследований LSCM анализы биопленки ограничены микро-масштабе, мезомасштабного обычно выполняется с помощью оптической когерентной томографии 30, 31,
Такое сочетание анализов дали доступ к параллельно биопленки переделе на грибковые колонии, бактериальный архитектуру колонии вдоль развивающейся биопленки и матричную структуру. Анализ мезомасштабного показал гетерогенный распределение бактериальных биопленок на грибковые колонии (фиг.2 и 3). Это наблюдение не было бы возможно с протоколами, которые только позволяют визуализацию небольшого участка грибной колонии, которая не обязательно представителем всей колонии. Таким образом, в то время какчасто пренебрегают, анализ мезомасштабного может дать ценную информацию о структуры распределения биопленки.
И, наконец, разработанный метод может быть использован для анализа образцов с различными методами микроскопии, в том числе и сканирующей электронной микроскопии. Здесь, SEM использовалась для достижения наноразмеров и для получения бактериальной пространственную организацию внутри биопленки. Она выполнена очень хорошо с тонкими грибных колоний, в то время как SEM допускается только изображений поверхности. В отличие от LSCM, СЭМ, однако, требуется образец обезвоживание и, чаще всего, покрытие с проводящим металлом. Этот процесс обезвоживания может изменить биологические структуры, когда он должным образом не выполняется и может потребовать оптимизации. Здесь образец обезвоживания с использованием медленного лиофилизации использовали 33. Тем не менее, применение обоих LSCM и SEM для образцов позволит производительность корреляционного микроскопии в том же месте образца.
Несмотря на преимуществаописанного выше, существуют некоторые ограничения. Во-первых, оно не может быть применимо ко всем видам грибов. В самом деле, этот метод культивирования разработан для грибов, распространяющихся радиально на поверхности твердой среды. Этот метод не может быть пригодным для грибов , образующих в основном воздушные гифы (например, Fusarium Sp.) Или для микро-аэробные грибов , распространяющихся в основном внутри агар. Кроме того, грибы унижающие целлофан может быть проблематичным , а также (например., Trichoderma зр.). Во-вторых, важно отметить, что стратегия окрашивания является критической точкой, и выбор пятно должно быть сделано тщательно, так как пятно не должно мешать биопленку. Например, мы заметили, что Calcofluor Белый вызвало частичное разрушение биопленки (данные не показаны), вероятно, из-за высокого рН этого пятна. Кроме того , некоторые красители получают гетерогенную окрашивание (например., Конго красный), в то время как другие получают однородную окраску (например., Клеточная стенка окрашивание с WGA лектин), что дает неоднородное качество изображения.Кроме того, важно иметь в виду, что некоторые красители не могут быть полностью специфичны. Например, WGA пятна не только грибковым клеточных стенок , но и N-ацетилнеураминовой кислоты в грамположительных стенок бактериальных клеток и адгезинов производства грамположительных и -отрицательное бактерий в процессе образования биопленки 34, 35. Поэтому, используя флуоресцентный белок меченых бактерий и / или грибов рекомендуется во избежание многократного окрашивания. Если используются несколько красителей, они не должны химически мешать, и спектры их излучение не должны перекрывать друг друга.
Мезомасштабная анализы требуют большого сканируемой области, и, следовательно, LSCM может отнимать много времени (40 мин до 1 ч, в зависимости от толщины образца) и узкое место анализа большого количества образцов. Тем не менее, могут быть сделаны коррекции в зависимости от типа данных, необходимых. Можно уменьшить время захвата и размера изображения путем изменения качества изображения. Например, высокое разрешениенет необходимости анализировать биопленки общий передел.
И, наконец, некоторые ограничения необходимо учитывать при выборе для отображения Z- данные стека в виде 2D или 3D проекции. Двумерные проекции являются хорошим способом суммировать данные, но информация о глубине теряется, и перекрывающиеся структуры становятся скрытыми. С другой стороны, 3D-проекции позволяют визуализировать с разных точек зрения, но они часто оказывают мало в случае пространственной сложности.
В заключение, мы уже сообщали, метод определения характеристик бактериальных биопленок на гиф на структурном уровне. Методика может быть распространена на другие приложения. В самом деле, этот метод позволяет производительность функциональной или химических свойств бактериальных биопленок, образующихся на грибными гифами. Из - за большого разнообразия существующих флуоресцентных систем репортер, анализ LSCM могут быть использованы для различных целей 29. Например, флуоресценция микрофонныйroscopy может быть использован для контроля градиента рН 36 или молекулы диффузию в биопленки 37. Кроме того, этот метод позволяет проводить анализ сообществ в многовидовых биопленок. Например, флуоресцентная гибридизация , ориентированные на конкретные группы бактерий в особенно полезен для изучения специфических бактериальных переделу в многовидовой биопленки 38, 39. Последние, многочисленные флуоресцентные красители могут быть использованы для характеристики матричного состава биопленки 21. Здесь, белки были направлены с использованием Sypro, который окрашивает широкий спектр белков, в том числе матричных белков (рисунок 4), но и другие красители позволяют для визуализации других важных матричных компонентов, таких как экзополисахаридов или внеклеточной ДНК. Интересно, что все эти анализы могут быть выполнены в мезомасштабную с использованием описанного способа. Поскольку LSCM могут быть выполнены на живых образцах,можно также достичь покадровой обработки изображений с использованием, например, coverwell камеры, особенно хорошо подходит для тонких колоний гриба. Этот вариант особенно интересен, поскольку формирование биопленок представляет собой сложный, динамичный процесс. И, наконец, для количественной цели, сообщенное метод может повысить точность автоматического количественного анализа, сделав это возможным количественное определение на мезомасштабными изображениях. Это может преодолеть биопленки гетерогенность и статистические вопросы 29.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Falcon Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 08-772-33 | Used in 2.2 & 3.1 |
| Congo Red | Fisher Scientific | C580-25 | Used in 3.1.4.1 |
| FUN 1 Cell Stain | Thermo Fisher Scientific | F7030 | Used in 3.1.4.1 |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | Used in 3.1.4.1 |
| DAPI solution | Thermo Fisher Scientific | 62248 | Used in 3.1.4.2 |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Used in 3.1.4.3 |
| FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain | Thermo Fisher Scientific | F10318 | Used in 3.1.4.4 |
| Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Used in 3.1.7 |
| LSM780 Axio Observer Z1 | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| ZEN 2.1 lite black software | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| High Vacuum Coater Leica EM ACE600 | Leica | Used in 4 | |
| GeminiSEM-FEG | Zeiss | Used in 4 |
References
- Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).
- Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
- Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14558-14563 (2009).
- Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29 (3), 293-296 (2004).
- Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. , 739-743 (2008).
- Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00 (0), 1-10 (2014).
- Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7301-7309 (2005).
- Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94 (1), 149-156 (2010).
- Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8 (9), 623-633 (2010).
- Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244 (2012).
- Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28 (1), 1-5 (2014).
- Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
- Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6 (12), 1399-1437 (2011).
- Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
- Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. , (2014).
- Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176 (1), 22-36 (2007).
- Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2 (4), 560-568 (2010).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
- Rasband, W. S. imagej. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
- Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2 (5), 486-498 (2002).
- Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25 (1), 31-42 (2013).
- Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31 (4), 477-485 (2009).
- Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10 (9), 4105-4119 (2011).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8 (3), 203-208 (2009).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
- Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11 (3), 34001 (2006).
- Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47 (7), 2531-2542 (2013).
- Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47 (6), 2085-2095 (2013).
- Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34 (1), 26-36 (2012).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).
- Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).
- Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6 (3), (2011).
- Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155 (8), 2603-2611 (2009).
