Summary
Vi præsenterer en protokol for anvendelse af interferometrisk fotoaktiverede Lokalisering Microscopy (iPALM), en 3-dimensionel single-molekyle lokalisering super opløsning mikroskopi metode til billeddannelse af actincytoskelettet i vedhængende pattedyrceller. Denne fremgangsmåde giver lys-baserede visualisering af nanostørrelse strukturelle træk, der ellers ville forblive uløste ved konventionel diffraktionsbegrænset optisk mikroskopi.
Abstract
Fluorescensmikroskopi muliggør direkte visualisering af specifikke biomolekyler i cellerne. Men for konventionel fluorescensmikroskopi, er den rumlige opløsning er begrænset af diffraktion til ~ 200 nm inden billedplanet og> 500 nm langs den optiske akse. Som følge heraf fluorescensmikroskopi har længe været stærkt begrænset i observationen af ultrastrukturelle træk i celler. Den seneste udvikling i super opløsning mikroskopi metoder har overvundet denne begrænsning. Især fremkomsten af photoswitchable fluoroforer muliggør lokalisering-baserede superopløsningsteknologi mikroskopi, som giver opløsningsevne nærmer sig molekylær-længde skala. Her beskriver vi anvendelsen af en tre-dimensionelle super opløsning mikroskopi metode baseret på single-molekyle lokalisering mikroskopi og multifase interferometri, kaldet interferometrisk fotoaktiverede Lokalisering Microscopy (iPALM). Denne metode giver næsten isotropisk beslutning omordre på 20 nm i alle tre dimensioner. Protokoller til visualisering af filamentøse actincytoskelettet, herunder prøvepræparation og drift af iPALM instrument, er beskrevet her. Disse protokoller er også let tilpasses og lærerigt for studiet af andre ultrastrukturelle funktioner i celler.
Introduction
Visualiseringen af komplekse cellulære strukturer har længe været en integreret biologiske indsigt og opdagelse. Selvom fluorescensmikroskopi kan billede celler med høj molekylvægt specificitet, dens opløsningsevne er begrænset af diffraktion til ~ 200 nm i billedplanet (x, y eller lateral dimension) og> 500 nm langs den optiske akse (z, eller aksiale dimension) 1,2. Derfor har observation af ultrastrukturelle træk historisk set været begrænset til elektronmikroskopi (EM). Heldigvis har den seneste udvikling af super opløsning mikroskopi omgået denne grænse, så rumlig opløsning i 10 - 100 nm rækkevidde 1-6. Især tilgange super resolution baseret på enkelt molekyle lokalisering, kendt af akronymer såsom PALM (fotoaktiverede Lokalisering Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence fotoaktiverede Lokalisering Microscopy) 5 (d) STORM (direkte Stochastic Optical Genopbygning Microscopy) 6,7, PAINT ( Point Ophobning for Imaging Nanoscale Topography) 8, GSDIM (grundtilstand Depletion Microscopy efterfulgt af individuelle molekylære tilbagevenden) 9, eller SMACM (Single-Molecule Active-Control Microscopy) 10, samt deres 3-dimensionelle (3D) implementeringer, såsom interferometrisk PALM (iPALM) 11 eller 3D-STORM 12, har været værdifulde i at afsløre nye indsigter i nanoskala organisering af talrige biologiske strukturer, herunder neuronale axoner og synapser 13, fokale sammenvoksninger 14,15, celle-celle vejkryds 16, nuklear porer 17 og centrosomer 18-20, for at nævne nogle få.
En anden ultrastrukturelle træk i celler, for hvilke super opløsning mikroskopi er potentielt nyttig er actincytoskelettet. Komplekset meshwork af filamentøse (f) actin i cellen cortex spiller en væsentlig rolle i kontrollen af cellulær form og mekaniske egenskaber 21. Organisationen of f-actin er aktivt og dynamisk reguleret selvom mange regulatoriske proteiner, som har stor indflydelse polymerisering, tværbinding, omsætning, stabilitet, og netværk topologi 22. Selv om karakterisering af f-actin meshwork arkitektur er vigtig for mekanistiske indsigt i en bred vifte af cellulære processer, den lille størrelse (~ 8 nm) af F-actin filamenter hæmmer deres observation ved konventionel diffraktionsbegrænset lysmikroskopi; således, visualiseringen af actin fine struktur har hidtil udelukkende været udført af EM. Her beskriver vi protokoller til visualisering af f-actincytoskelettet i klæbende pattedyrceller, ved hjælp af iPALM super opløsning mikroskopi teknik til at drage fordel af sin meget høj præcision kapacitet i 3D 11,23. Selvom iPALM instrumentet er højt specialiseret, har instruktion om at oprette et sådant instrument blevet beskrevet for nylig 23, mens adgang til iPALM mikroskop vært ved Howard Hughes Medical Institute er også blevet stillet til rådighed for forskersamfundet med minimale omkostninger. Derudover prøvepræparation, der er beskrevet heri, er umiddelbart til alternative 3D super opløsning tilgange, såsom dem baseret på astigmatisk defokusering af punktspredningsfunktionen (PSF) 12 eller bi-plane afsløring 24, som er mere bredt tilgængelige.
Vi bemærker, at en nødvendig ingrediens for enkelt-molekyle lokalisering-baserede super opløsning mikroskopi generelt er den photoswitchable fluorophor 25, som giver de tre kritiske krav til single-molekyle lokalisering-baserede super opløsning mikroskopi, der skal opfyldes: i) høje enkelt-molekyle lysstyrke og kontrast i forhold til baggrunden signaler; ii) sparsomme fordeling af enkelte molekyler i en given billedramme; og iii) høj rumlig densitet på mærkning er tilstrækkelig til at indfange profilen af den underliggende struktur (også kendt som Nyquist-ShanFiler, som ikke kriterium prøveudtagning) 26. Således for tilfredsstillende resultater, bør der lægges vægt ligeligt på både ordentlig forberedelse af prøver til at optimere fluoroforen photoswitching og bevare den underliggende ultrastruktur, samt på instrumentering og overtagelser aspekter af forsøgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Imaging Klargøring
- Da baggrund fluorescens signaler forstyrrer fluorescens fra fluoroforen etiketter, rense dækglas ved først at skylle dem i deioniseret vand (Hedeselskabet 2 O) og derefter luft-tørre dem med trykluft. Efterfølgende udfører plasmaætsning i et plasma renere i 15 s, eller længere, hvis det er nødvendigt.
- For at aktivere afdrift korrektion og iPALM kalibrering, brug # 1.5 runde (22 mm diameter) pre-rensede dækglas indlejret med fluorescerende nanopartikler som referencemærker, der tjener som meget fotostabile referencemærkerne for pålidelig kalibrering og drift korrektion. På grund af den lange tid, der kræves erhvervelse at akkumulere tilstrækkelig fluorofor densitet (> 15 - 30 min), prøve afdrift er uundgåelig.
- Placer hver fiducialed dækglas i en 6-brønds vævskulturplade. Sterilisere dem ved ultraviolet (UV) stråling i et laminar flow-bænk i 15 min.
- I en steril laminar flow hætte, forberede fibronectin løsning til dækglas coating ved at fortynde 1 mg / ml fibronectin stamopløsning i steril Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) til en slutkoncentration 2 - 10 ug / ml. Skyl hvert dækglas tre gange med DPBS og inkuberes med 2 ml af fibronectin opløsningen natten over ved 4 ° C. Efterfølgende aspireres ud fibronectin opløsning og skylles en gang med DPBS.
- Skyl cellerne kortvarigt med DPBS. Inkuber med 1 - 2 ml trypsin i et par min ved 37 ° C, indtil cellerne løsnes og stands med ~ 10 ml frisk serumholdigt cellekulturmedium. For eksempel til humane navlevene endotelceller (HUVEC), bruge stort fartøj endotel dyrkningsmedium suppleret med store fartøj endotelceller faktorer og penicillin eller streptomycin.
- Replate cellerne onto fibronectin-overtrukne dækglas (for sparsomme tæthed, plade <50.000 celler pr dækglas) og opretholde kulturen i en inkubator indstillet til 95% fugtighed, 5% CO2, og 37 & #176; C.
- For korrekt opbevaring af de fine strukturer i f-actincytoskelettet, brug buffer løsninger baseret på gode s buffer reagenser 27.
- For eksempel forberede Phem buffer som en 2x stamopløsning (120 mM PIPES, 50 mM Hepes, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 7,0 med KOH) ved opløsning 6,5 g HEPES, 3,8 g EGTA og 190 mg MgCl2 i ~ 300 ml Hedeselskabet 2 O, med pH justeret til 7,0 ved dråbevis tilsætning af koncentreret KOH-opløsning; derefter tilsættes Hedeselskabet 2 O for at bringe volumen til 500 ml. Sterilisere bufferen ved hjælp af en 0,22-um filter, skal den opbevares ved 4 ° C, og fortynde det 1: 1 med Hedeselskabet 2 O før brug.
- For de bedste resultater med høj mærkning af f-actin tæthed, brug phalloidin konjugeret med organiske fluoroforer, såsom Alexa Fluor 647. På det ønskede tidspunkt efter celle genudpladning, fikseres cellerne som følger:
- Aspireres medierne fra hver kultur godt der indeholder cell eksemplar. Forsigtigt, men hurtigt dispensere 2 ml varm (37 ° C) ekstraktion fikseringsmidler indeholdende 0,25% glutaraldehyd i Phem puffer med 0,25% Triton X-100. Inkuber ved stuetemperatur til 1 - 2 min. For efterfølgende trin, bruge 2 ml fiksativ eller afkølende buffer pr dækglas, medmindre andet er angivet.
- Udskift udvinding fiksativ med en 2,5% glutaraldehyd fiksativ i Phem buffer og lad prøverne inkuberes i 10 - 12 min. Dette og følgende trin udføres alle ved stuetemperatur.
- Aspirer ud fikseringsmidler og forsigtigt erstatte dem med Phem buffer. Tilt og hvirvel forsigtigt, og derefter vaske igen med Phem. Gentag to gange.
- For at slukke autofluorescens fra glutaraldehyd, som kan overvælde signaler fra de ønskede fluoroforer, inkuberes prøverne med en frisklavet quenching buffer indeholdende NaBH4 ved en masse koncentration på 0,1% i Phem. vil observeres kraftig bobler. Lejlighedsvis trykke prøven parabol forsigtigt til dislodge boblerne. Lad det inkubere i 5 - 10 min.
- Aspirer ud quenching-buffer og forsigtigt erstatte det med Phem puffer. Skyl et par gange for at rydde boblerne. Afpipetteres i 2 ml Phem buffer og lad det inkubere i mørke i 5 minutter. Gentag to gange og lad prøven hvile i Phem buffer når du er færdig.
- Forbered en luftfugtighed kammer til phalloidin inkubation ved hjælp af en stor plastik petriskål polstret med et stykke køkkenrulle generøst fugtet med 5 - 10 ml Hedeselskabet 2 O. Sæt en stor plade af ren Parafilm oven på det våde køkkenrulle.
- På grund af den relativt høje pris på mærket phalloidin, bruge en lille volumen for hver mærkning. For høj mærkning tæthed, starte med en koncentration på 0,3 uM. Forbered ~ 60 pi pr dækglas under anvendelse phalloidin-Alexa Fluor 647 i Phem puffer.
- Pipette 55 - 60 pi af phalloidin opløsningen på Parafilm arket i fugtighedskammeret. Ved hjælp af fine pincet, forsigtigt fjerne prøven coverglass. Vær omhyggelig med at notere den korrekte celle-holdige ansigt.
- Hurtigt og forsigtigt trykke væk overskydende buffer ved at røre ved kanten af dækglasset med et foldet stykke delikat absorberende papir, og derefter placere dækglas cellen nedad på dråbe phalloidin løsning på Parafilm. Sørg for at der ikke er bobler fanget af dækglasset.
- Placer dækslet på fugtigt kammer. Pak kammeret i aluminiumfolie for at beskytte det mod omgivende lys, og lad prøven inkuberes natten over ved 4 ° C. Prøven kan holdes i denne tilstand i adskillige dage. Sørg for, at fugtigheden kammer forbliver fugtig, hvis der er planlagt lang lagring.
- Forud for billedbehandling, blidt placere dækglas celle side op på en ny 6-brønds plade indeholdende 2 ml Phem buffer per brønd.
- Forbered ilt-opfanget thiol-baserede imaging puffere under anvendelse af følgende stamopløsninger: 1 M glucose, 1 M cysteamin, og 100x glucoseoxidase / katalaseenzymet mixture (4 mg katalase og 10 mg glucoseoxidase i 100 pi Phem buffer, blandet godt ved hvirvelbehandling) 28. Lige før billeddannelse, bland 75 pi 1 M glucoseopløsning, 30 pi 1 M cysteamin opløsning, og 3 pi 100x stock enzymblanding. Juster lydstyrken til 300 pi med Phem buffer og bruge umiddelbart efter blanding at montere prøven.
- For iPALM, forberede den billeddannende prøve ved hjælp af en pre-rengjort # 1.5 dækglas (22 mm diameter).
- Alternativt bruge et objektglas (3 "x 1") med en dobbeltsidet klæbende spacer at hjælpe ved opstilling, hvis astigmatisme-baserede 3D-STORM 12 skal anvendes i stedet.
- For at samle billedbehandling prøve, bruge fine pincet til forsigtigt at fjerne prøven dækglas fra bufferen godt. Så hurtigt og forsigtigt trykke væk overskydende buffer ved at røre ved kanten af dækglasset med foldede absorberende papir.
- Placer dækglas celle opad på et stykke rent linse papir. Skyl prøvenved at placere 30 - 50 pi imaging buffer på prøven, og fjerne overskydende buffer ved at vippe og trykke med foldede absorberende papir.
- Gentag skylning trin et par gange, og derefter placere 30 - 50 pi imaging buffer på prøven. Blot tørre kanten af dækglasset og placere flere meget små prikker af hurtigt hærdende epoxy på tørrede område.
- Sænk langsomt anden forud renset # 1.5 dækglas (almindeligt, rund dækglas, 18 mm i diameter) på midten af cellen indeholder 22-mm dækglas. Lad imaging buffer våd begge dækglas ved kapillarvirkning. De små prikker af hurtigt hærdende epoxy skal overholde begge dækglas.
- Tryk forsigtigt på den samlede prøve ved hjælp foldet absorberende papir til at sprede trykket jævnt. Brug tilstrækkeligt tryk til at gøre prøvecellen-tyndt og jævnt (<15 um), men ikke så meget som at knuse cellerne. Gauge den korrekte tykkelse ved at observere Newtons ringe mønster. Sørg også for at udføre denne step forsigtigt for at minimere luftbobler. Hvis det er nødvendigt, øve med tomme dækglas flere gange på forhånd.
- Forsegl prøven med smeltet vaseline-lanolin-paraffin (VALAP, bestand fremstillet af 100 g hver af vaseline, lanolin, og paraffin, smeltet sammen) 29, skyl den forseglet prøve med Hedeselskabet 2 O, og blæse tør med trykluft. Prøven er nu klar til montering på mikroskopet til billeddannelse.
2. Prøve Placering og iPALM Alignment
- Flyt fjederbelastede top objektivlinse opad for at muliggøre fjernelse af prøveholderens. Placer de forseglede genstanden fremstillet i trin 1.10 på prøveholderen og sikkert med flere små sjældne jordarters magneter. Påfør fordybelse olie på begge sider af den billeddannende prøven. Placer holderen prøven tilbage den optiske vej ind og sænk forsigtigt den øverste objektiv.
- Tænd excitation lasere. Tænd Electron Multiplying Charge-Coupled Device (EMCCD) kamera i ramme-transfer mode.
- Rotere i den korrekte emissionsfiltre. Aktiver en mekanisk lukker til at blokere den øverste strålegang (figur 1A) og åbne den nederste strålegangen. Bringe bunden objektivlinse i fokus ved translation i små trin ved hjælp piezoaktuatoren.
- Når referenceenergi er i fokus, åbne øverste strålegangen og blokerer den nederste bjælke, og bring den øverste objektivlinse i fokus på en lignende måde. Overvåg bredden af referenceenergi på computerens skærm for optimal fokus.
- For korrekt centrering, åben både den øverste og nederste stråle stier. Manuelt justere den øverste objektiv mens den nederste mål holdes konstant ved hjælp af et par af mikro-fine skruerne, indtil de referencemærker billederne overlapper så tæt som muligt, helst inden for en pixel.
- Efterfølgende udføre finjusteringer, så de referencemærker billeder i trin 2.3 overlapper inden for en tiendedel af en EMCCD pixel. Juster toppen2-akse piezo-monterede spejle via kontrol-software, mens du holder både objektive linser og bunden refleksion spejle konstant. Sammenligne centrene af referencemærkerne i top og bund objektive synspunkter via computerens skærm til at styre processen.
3. Kalibrering af iPALM Setup
BEMÆRK: Da fluorescensemission er usammenhængende, for at blive observeret indblanding i iPALM, længder stien gennem den øverste og nederste mål skal være tæt på hinanden, inden for få mikrometer. Dette kan opnås som følger:
- Med lasere på, kontinuerligt kameraerne streaming, og begge de øverste og nederste strålebaner åben, svinge prøveholderen z-piezo anvendelse af en sinusformet spænding bølgeform genereres af kontrol softwaren til en kontinuerlig z-akse oscillation over en størrelsesorden på 400 nm .
- Ved at udnytte den kendsgerning, at når ud af optimal opstilling, den referenceenergi intensitet varierer lidt med than svingning, manuelt oversætte den motoriserede strålesplitter samling op eller ned, indtil intensiteten af de referencemærker oscillerer som følge af den ønskede single-photon interferens effekt. Dette betyder den tæt matchning af de optiske vejlængder. En top-til-dal-forhold på> 10 kan opnås under optimale tilfælde (figur 1D).
- For at sikre, at både amplitude og fase ved hver overflade er så ensartet som muligt over marken, justere den nederste spejl af bjælken splitter forsamling i små skridt til at finjustere hullet og tilt vinkler. Udfør beam splitter fin justering ved at oversætte prøven i 8 nm z-trin i løbet af 800 nm.
- Overvåg referenceenergi intensitet blandt kameraer # 1 - 3. Juster højden, position og hældning af bunden spejl inden stråledeleren forsamling i små skridt, således at svingningerne fase af kamera # 1 i forhold til kamera # 2 er maksimeret, ideelt ved 120 ° (Figur 1B-D).
- Når den førstetilpasningen er færdig, oversætte prøven til at scanne for et passende synsfelt, der indeholder både celler til billede og flere referencemærkerne nærheden. Placer en indhegning rundt i systemet til at blokere falsk lys og forstyrrelser i omgivelserne. Når det billeddannende område er fundet, gennemføre proceduren i trin 3.4 igen, og registrere kalibreringskurven til brug i efterfølgende z-koordinat ekstraktioner ved hjælp af kommandoen "Acquire Kalibrering Scanner vs Sample Piezo Position" i den primære grænseflade.
4. Data Acquisition
- Når et ønsket område er fundet og kalibreringskurven er opnået, indtaste de relevante filnavne i softwaren. Åbne både top og bund strålebaner. Øge excitation magt 642-nm laser til maksimum. For Alexa Fluor 647, kan en indledende periode med fluorophor slukke være behov (figur 2A).
- Eksponere med en konstant 642-nm excitation i 5 minutter eller længere, hvis det er nødvendigt, indtil single molekyle blinkende observeres (figur 2B). Den software giver en automatisk stigning på 405-nm foto aktivering i løbet af købet. Et stort antal erhvervelse rammer er normalt kræves for trådformede funktioner til at være klart synlig (> 50.000 frames). Når du er klar, begynder købet af rå billedsæt ved hjælp af kommandoen "Start iPALM Acquisition" i den primære grænseflade.
- Under købet, tune fotoaktivering niveau ved at justere intensiteten af 405-nm laser til at opretholde den rette blinkende tæthed efter behov (se eksempler i figur 2B).
BEMÆRK: Når købet er gennemført, vil softwaren automatisk konvertere billedfiler i den korrekte binært format. Datalageret i beregningen serveren er monteret som en netværksbaseret drev, hvor data kan kopieres direkte der til yderligere behandling.
5. Databehandlingog analyse
- Udfør lokalisering analyse ved hjælp af en specialfremstillet udviklet software til at udtrække bedste tilpasning parametre for alle enkelte molekyler samt for referencemærkerne 11,15,23. Dette giver ikke kun de x, y-koordinat, men også den intensitet, der anvendes til kalibreringskurven analyse.
- Importer de rå kalibreringsdata erhvervet i trin 3.5 ved hjælp af kommandoen "Uddrag Peaks flere etiketter" under menuen "Filer" for at udføre den enkelt-molekyle lokalisering. Efter den indledende lokalisering analyse koordinater fås fra kameraer # 1 - 3 år er til stede i røde, grønne og blå kanaler, henholdsvis og kan gemmes til yderligere analyse ved hjælp af kommandoen "Gem Forarbejdet som IDL (SAV)" under " File "menuen.
- For at bringe data fra kameraer # 1 - 3 ind registrering ved hjælp af de fluorescerende referencemærkerne indlejret på dækglas, vælge flere lyse referencemærkerne at give dækning af det centrale billede (f.eksFigur 1 B) ved hjælp af kommandoen "Anchor Referencemærker Points" under menuen "Billede Transformations". Brug den tredobbelte sæt af lokalisering koordinater fra kameraer # 1 - 3 fås fra de lyse referencemærkerne i trin 5.1 til at beregne rotation og skalering matrix, der vil bringe kameraer # 1 og # 3 i register med kamera # 2. Med et tilstrækkeligt stort antal referencemærkerne, kan højere ordens polynomium vridning udføres for bedre passer.
- Når omdannelsen matrix beregnes, transformere de rå data af kameraer # 1 - 3 sammen for at opnå de summerede rådata. Udføre en anden runde af lokalisering analyse til opnåelse af en mere præcise x, y-koordinat og til at bestemme det relative bidrag af hvert kamera kanal til det summerede rådata; bruge kommandoen "Transform Rå, Gem og Gem Sum (dat)" under menuen "Billede Transformations". Denne intensitetsforhold indeholder z-koordinat oplysninger.
- Vælg en lys fiducial og udføre z-kalibrering montering ved hjælp af funktionen "Test Wind Punkt 3D" i pop-up dialogboks ved at klikke på "Z-koordinat Operations" under menuen "Specielle funktioner". Dette vil passe 3-sinusformede funktioner til intensiteterne af de 3 kamerakanaler at bestemme kalibreringskurven. Kalibreringen filen derefter gemmes til senere brug på de vigtigste datasæt.
- For at teste kvaliteten af kalibreringskurven udføre z-koordinat ekstraktion som tidligere 23 beskrevet. For velopdragen referencemærkerne på et godt kalibreret systemet, bør z-koordinat skalere lineært, da kalibreringen datasæt er taget med en lineær sweep i z-position. Endvidere bør z-stillingerne i alle referencemærkerne skalere med en lignende skråning.
- Når en tilfredsstillende kalibrering opnås, udføre lokalisering og transformation analyse for de rå billeddata datasæt erhvervet i trin 4 efter samme fremgangsmåde beskrevet i trin 5,1-5,3. Når du er færdig, skal du lægge kalibreringen filen fra trin 5.4 og udfører z-koordinat ekstraktion ved hjælp af funktionerne "Pick WND File" og "Uddrag Z koordinat" i pop-up dialogboks ved at klikke på "Z-koordinat Operations" under menuen "Specielle funktioner".
BEMÆRK: Siden erhvervelsen tid er> 15 min, mekanisk drift kan forventes. - For at udføre afdrift korrektion i x, y, skal du vælge en lys fiducial fra lokalisering koordinater. Denne referenceenergi bør være til stede i alle rammer. Brug derefter x, y-koordinat afdrift af fiducial at tilpasse alle andre koordinater inden for samme ramme tilbage i registrering (figur 3A-B) ved hjælp af funktionen "Test / Skriv Guide Star" under menuen "Billede Transformations". Z-koordinat registrering kan udføres på samme måde ved at gå "Test Guide Star" og "Skriv Guide stjerne" funktioner i pop-up dialogboks ved at klikke på "Z-koordinat Operations" under menuen "Specielle funktioner".
- Da prøven kan udvise svag hældning, udføre tilt korrektion ved at levere de x, y, z-koordinater for 3 referencepunkter definerer det plan, som bør fastsættes niveau ved hjælp af funktionen "Fjern XYZ Tilt" i pop-up dialogboks ved at klikke på " Z-koordinat Operations "under menuen" Specielle funktioner ".
- Efter Drift og tilt rettelser, gemme lokalisering koordinater. Rekonstruere en super opløsning billede til yderligere analyse (figur 4A-D) ved hjælp af kommandoen "Render" på de vigtigste interface. Farve kan anvendes til at angive z-koordinat. Alternativt kan et sidebillede af det valgte område også gøres. De lokalisering koordinater kan eksporteres som tekstfiler for yderligere kvantificering eller rekonstruerede billede kan gemmes som en .tif-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritiske krav til iPALM er opretningen, registreringen, og kalibrering af de optiske systemer. Disse er nødvendige for at sikre korrekt indgreb i den 3-vejs stråledeler forudsætning for z-koordinat udvinding. For at aktivere kontinuerlig overvågning, konstant punktkilder af fluorescens er nødvendige. Dette kan opnås med fluorescerende Au eller bi-metalliske nanopartikler 23 hvis fotoluminescens skyldes lokaliseret overfladeplasmonresonans (LSPR). De fungerer som en stabil enkelt dipol på belysning og kan typisk lokaliseres med 5 - 10 nm nøjagtighed. Disse kommercielt tilgængelige nanopartikler udsender en lysstyrke inden for området fra de fleste enkelt-molekyle fluoroforer, således at begge de fluoroforer og referencemærkerne kan afbildes med lignende excitation intensiteter og forstærkningsindstillinger på EMCCD kameraer, uden mætning (figur 1B). Desuden er disse referencemærkerne også i høj grad facilitate fokusering, hvorved kan overvåges den tilsyneladende bredde af referencemærkerne under justeringen fokus. Også, stringent rengøring af dækglasset overflade, såsom ved Piranha ætsning eller plasma rengøring, er også påkrævet, eftersom falsk baggrundsfluorescens af urensede eller dårligt rengjorte dækglas nemt kan overvælde enkelt-molekyle signaler, som beskrevet tidligere.
iPALM afhængig af flerfase interferometri at muliggøre høj præcision z-koordinat måling samtidigt med PALM (for x, y). I iPALM instrument, kan hver udsendt fluorescens foton anses for at udbrede gennem både optiske stier, som så selv blande sig i en custom-fabrikeret 3-vejs beam splitter. Z-koordinat er således kodet i fasen af forstyrrede foton. Forskellene i ~ 120 ° af output bjælker fra 3-vejs stråledeler resultat i intensiteten variation af de enkelt-molekyle billeder mellem 3 camer gensidig fasesom, så z - koordinat ekstraktion fra en kalibreringskurve. Baseret på dette, det iPALM prøve fatningssamlingen er et væsentligt element, idet den er udstyret med et par af piezoelektriske aktuatorer, der tillader nm præcision translation i z, der kan anvendes til justering og kalibrering.
Ved korrekt fokus og tilpasning vil oversættelsen af prøven langs z-aksen generere en interferensvirkning. Dette viser sig som svingningerne i den referenceenergi intensitet mellem de tre kamerakanaler (Figur 1C-D). Disse svingninger indikerer også, at både den øverste og nederste optiske strålebaner næsten matches, hvilket tillader enkelt-foton interferens. Normalt, ved drejning på instrumentet, de indledende faser af hvert kamera vil ikke optimal og scanningen af z-stillingen er nødvendig som et diagnostisk værktøj til kalibrering og justering. At nå frem til de optimale faser, den nederste spejl af stråledeleren(Figur 1A) kan justeres ved hjælp af piezoelektriske tip-tilt fase. Kalibreringen scanning af z-stillingen er taget efter hver lille 10 - 20 nm justering. Intensiteten af referenceenergi i hver kanal bestemmes derefter ved lokalisering analyse (dvs. påmontering af en 2D-Gauss-funktion). Intensiteten normaliseret ved totale intensitet kan tilnærmes med en sinusformet bølgeform, så fase sigt skal beregnes; Således kan fase svarer til hvert kamera bestemmes, som det ses i figur 1C. Vi bemærker, at single-foton indblanding princip anvendes i iPALM også kan påvises ved hjælp af en meget enklere 2-vejs beam splitter. Men en 2-vejs stråledeler er upraktisk for 3D super opløsning mikroskopi siden ved eller nær grænsen for destruktiv interferens, signalet i én kanal er minimal, hvilket resulterer i støjende estimater af intensitet og lokalisering koordinater, som effektivt begrænser z-koordinat beslutsomhed til ringedee hvor begge kameraer har betydelig intensitet (<100 nm). Det mindste antal kanaler er nødvendige for at overvinde denne effekt er tre, og 3- og 4-vejs projektion systemer er blevet beskrevet i litteraturen 11,30.
Under optimale betingelser, for en 3-vejs stråledeler, bør faseforskellene mellem de 3 kameraer være ca. 120 °. Det 3-vejs stråledeler for iPALM indeholder 3 reflekterende grænseflader, som diagrammet i figur 1A. Stråleseparatoren er placeret over en flad dielektrisk spejl, med en tynd hul fyldt med brydningsindeks-matching olie, for at tillade finjustering af vejlængder inden stråleseparatoren og opnå forskelle optimale fase. Som vist i figur 1C-D, ved korrekt tilpasning til iPALM, kameraerne er tæt på en 120 ° gensidig faseforskel. I praksis er en faseforskel over 105 ° er generelt acceptabel. En sådan kalibrering både indicates at systemet er godt afstemt, og at den vil blive anvendt til efterfølgende z-koordinat ekstraktion. Det er også nyttigt at evaluere kalibreringskurven frembragt ved hjælp af forskellige referencemærkerne. De fleste referencemærkerne med moderat lysstyrke generelt udsender som en enkelt dipol, hvilket giver velopdragne kalibreringskurver. lejlighedsvise aggregater af referencemærkerne (ofte dem med ekstrem lysstyrke), kan dog opføre sig på en unormal måde, hvilket giver upålidelige kalibreringskurver. Det er også tilrådeligt at vælge referencemærkerne nær centrum af billedfeltet og nær området af biologisk interesse (figur 1B), navnlig eftersom den høje NA mål linse anvendes i iPALM opsætningen ikke er flad-felt rettet. Den effektive field-of-view er begrænset til det centrale område, fremgår af de større referencemærker bredder mod kanten af feltet.
Efter den indledende justering, felterne-of-view indeholder celler med ønskelig morphology og flere referencemærkerne at sikre god kalibrering vælges til billeddannelse. Dette kan opnås ved langsomt at oversætte prøveholderen anvendelse af 2-aksede servomotoren drev. Oversættelse af prøven vil resultere i en vis defokusering, fordi prøven ikke altid helt flad. Derfor skal fokus være justeres kontinuerligt under oversættelsen. Når Billedfeltet er valgt, til en anden runde af kalibrering optimerer kalibreringskurven derefter gennemføres med finjustere systemet tilpasning og for at opnå den faktiske kalibreringskurve. Er vigtigt, at områder under kernen eller i nærheden af områder med heterogen brydningsindeks (f.eks luftbobler) undgås i almindelighed, da disse vil forårsage signifikant ændring af den relative vejlængder, forvrænge z-koordinat.
Med mærkning høj densitet, kan fluorescens signaler fra organiske fluoroforer såsom Alexa Fluor 647 være meget lyse. Som vist in Figur 2A, med den rette buffer præparat indeholdende en høj koncentration af thiol (-SH) -grupper 31, fluorophoren bør hurtigt slukkes under højt excitationsbelysning. Dette resulterer i, at de fluorescenssignaler fra flertallet af molekylerne. På et enkelt tilfælde et meget lille mindretal af fluoroforer stokastisk vende tilbage til "on" tilstand. Disse forventes at blive tyndt fordelt, og dermed kan visualiseres som enkelte molekyler til én eller et par frames før skifte "off". De photoswitching dynamik er stærkt afhængig af excitationsintensitet og koncentrationen af -SH, og dermed for et givet system, skal der drages omsorg for at optimere korrekt mærkning tæthed, især da en relativt høj excitationsintensitet (640 - 647 nm) nødvendig for at slukke et flertal af Alexa Fluor 647-molekyler. Hvis excitation er ikke tilstrækkelig stærk, en betydelig del af Alex Fluor 647 viljeforbliver i "on" tilstand, hvilket resulterer i høj baggrund, vanskeligheder med at observere enkelt molekyle fluorescens, og i sidste ende, dårlig kvalitet enkelt-molekyle lokalisering resultater. Under en korrekt afbalanceret tilstand, bør enkelt-molekyle rådata indeholde et tilstrækkeligt stort antal molekyler (hundreder) pr ramme (figur 2B), mens hvert molekyle er sparsom nok til at tillade utvetydig detektion og lokalisering analyse. Det er også værd at bemærke, at for iPALM, principperne for photoswitching er identiske med dem af PALM eller STORM, og dermed kan prøverne ordentligt forberedt til iPALM anvendes direkte på de mere enkle 3D-PALM eller 3D-STORM-systemer. At erhverve en tilstrækkelig høj tæthed af molekyler for at tilfredsstille Nyquist sampling, normalt 50.000 eller flere rammer af rådata er påkrævet (dvs. 150.000 samlede rammer for de 3 kameraer). Som købet skrider frem, kunne en stigende brøkdel af fluoroforer være udtømt ved destruktiv fotoblegning, hvilket resulterer i SparSer enkelt molekyle tæthed. For at kompensere for dette, kan korte pulser af 405 nm blåt lys (405 nm) belyses på prøven med mellemrum for at fremme fluorophor aktivering.
På grund af den lange erhvervelse tid, der kræves, optimale resultater for iPALM (eller single-molekyle lokalisering mikroskopi generelt) kræver lav prøve afdrift og / eller god drift korrektion. For eksempel ved hjælp en eksponeringstid på 50 ms i ramme transfer mode (20 Hz frame rate), den samlede erhvervelse tid til 50.000 frames er 42 min. I denne periode, forventes mekanisk drift i løbet af snesevis af nm. Faktisk, i tillæg til den høje lokalisering præcision og høj densitet mærkning, beslutningen afhænger også af afdrift korrektion kvalitet. Der er flere oprindelse til disse driver med termisk udsving er en væsentlig årsag. På grund af denne betragtning, hvor det er muligt, er iPALM dele custom-bearbejdet ved hjælp Invar, en lav termisk ekspansion legering, eller rustfrit stål,begge har meget lavere varmeudvidelsesegenskaber end messing eller aluminium. Desværre er dette pålægger også yderligere omkostninger i forhold til aluminium, som er et mere almindeligt anvendte metal til optomekaniske komponenter, bliver meget billigere og lettere at bearbejde. Andre kilder til drift kan være mekaniske vibrationer fra perifert udstyr, omgivende miljøer, eller luftstrømme. Disse bør minimeres ved at placere systemet i en egnet indkapsling og ved at omdirigere luftstrømmen retning i mikroskopet området. Opsætningen bør bygge på en forskningsbaseret kvalitet optisk bord og, om muligt, fan-holdige komponenter skal placeres ud for den optiske bordet. Trods alle forholdsregler, vil en vis mængde af afdrift tilbage. Kritisk skal disse driver minimeres således, at billedet forbliver i fokus hele købet tid. I vores systemer, disse passive metoder er tilstrækkelige til at minimere afdrift til acceptable niveauer. Dog bør det være muligt at gennemføre aktive afdrift comerstatning metoder til at aktivere langsigtet og høj præcision billedbehandling 32.
Efter forarbejdning af de rå data, kan 3D-localization koordinater opnås med typisk 5 - 10 mio enkelt-molekyle toppe pr datasæt. Som vist i figur 3, kan afdrift som en funktion af tid visualiseres fra localization koordinater referencemærkerne. Flere referencemærkerne kan anvendes til at beregne den gennemsnitlige afdrift korrektion bane (figur 3A-B). Det er også almindeligt at bortfiltrere toppe som passer dårligt til 2D-Gauss-funktion under lokalisering analyse. Dette kan skyldes falske lyde eller delvist overlappende enkelt-molekyle toppe og kan differentieres ved det store resterende square error beregnet under tilpasningsprocessen. Toppe med lav lysstyrke (som angivet ved foton count) og dermed større usikkerhed (dvs. større end ~ 25 nm) er også frafiltreret, ens disse sandsynligvis skyldes ikke-specifik baggrundsfluorescens. Tilsvarende er toppe for hvilke intensiteter fra de 3 kamera kanaler passer dårligt på kalibreringskurven også afvist, da z-koordinaterne opnåede er upålidelige. Det skal bemærkes, at det fulde indhold af iPALM (og lokalisering mikroskopi generelt) information er massiv, da analyseresultaterne ikke kun i fluorophoren koordinater, men også i flere andre parametre såsom intensitet, bredde, lysstyrke osv imidlertid i praksis, da relativt få beregningsværktøjer er i øjeblikket tilgængelige til analyse i koordinatsystemet rummet, er lokalisering koordinater typisk gengives eller rekonstruerede i pixel-baserede billeder til yderligere analyse.
Den almindeligt anvendte metode til genopbygning iPALM billede er at repræsentere hver lokalisering koordinere med en normaliseret 2D Gauss-funktion, med lokaliseringen usikkerhed indstillet som Gaussian bredde 33. Således høj præcision koordinater (typisk single-molekyle toppe med høj lysstyrke mod lav baggrund) vises som skarpe og smalle toppe, mens de lave præcision koordinater (typisk lav lysstyrke eller høj baggrund enkelt molekyle toppe) vises som lysdæmper og bredere toppe. På denne måde hvert molekyle bidrager den samme mængde intensitet til billedet. For et 3D datasæt, kan z-koordinat være repræsenteret ved hjælp af farve, typisk baseret på en nuance skala (figur 4C-D). Alternativt kan billederne vises som et sidebillede (x, z eller y, z) fremspring eller som volumen. En række offentligt tilgængelige software kan bruges til at visualisere sådanne oplysninger 34.
Som vist i figur 4-6, iPALM billeder giver en væsentlig forbedring i forhold diffraktionsbegrænset fluorescensmikroskopi. F-actin arkitektur i HUVEC-celler kan visualiseres med meget forbedret rumlig resolution. I de områder af cortex, kan netværk af forskellige filamenter ses, mens der i stress fibre, bundter og lamellipodia er de tætpakkede f-actin netværk observeret at have en filamentøs tekstur, selvom enkelte filamenter ikke skelnes. Dette skyldes sandsynligvis de begrænsninger, der både lysstyrke fluoroforerne og lokalisering præcision. Tilstedeværelsen af distinkte corticale filamenter foreslår, at ultrastruktur af f-actin-netværket er tilstrækkeligt velbevaret; dermed iPALM kunne være et nyttigt redskab til at karakterisere det kortikale arkitektur. I figur 5 er en sub-region i en HUVEC celle vises med de profiler af en glødetråd actin kvantificeret. Det kan ses, at z-histogram af et filament er omkring 15 nm i bredden, relativt små sammenlignet med ~ 45 nm for den tværgående (x, y) visning, der viser, at iPALM giver en væsentlig forbedring opløsning i z-opløsning i forhold til x-, y-planet, som forventet. Eftersom actual diameter f-actin er ~ 8 nm, er det uklart, om den observerede glødetråd er enkelte fibres et bundt af et par tråde. Korrelative billeddannelse ved hjælp iPALM og EM kunne være en nyttig strategi for yderligere karakterisering af f-actin arkitektur, selvom denne fremgangsmåde ikke er blevet anvendt til at studere f-actin endnu 23.
Figur 1: Skematisk diagram af iPALM 3-D Super Resolution Microscopy. En) Skema for iPALM optik. De dobbelte objektive linser (Nikon, NA 1,49 60X) give hver udsendt fluorescens foton at udbrede gennem både den øverste og nederste optiske stråle stier, og de er omdirigeret til at blande sig i stråledeleren af et par spejle orienteret ved 22,5 °. Fasen af selv-forstyrret foton er direkte proportional med Az, således koder for z-koordinaten af fluoroforen, og kan måles osing en 3-vejs stråledeler med gensidig faseforskelle på ~ 120 ° mellem de tre output bjælker. De er fokuseret af rør linser (L1-L3, f = 400 nm) og filtreres ved emission filter (F1 - F3). Hver enkelt molekyle synes derfor med forskellige intensiteter mellem kameraer (EMCCD1-3), men på tilsvarende x, y-koordinater. (A) er gengivet og modificeret fra ref. 11. (B) Diffraktion-begrænset billede af HUVEC celler mærket for f-actin med Alexa Fluor 647. Lyspunkter betegne Au nanopartikel referencemærkerne. De fasevinkler for kameraer # 1 - 3, repræsenteret af røde, grønne og blå linjer henholdsvis centreret på hver referenceenergi, med faseforskellen mellem kameraer # 1 - 3 ud indikeret. Målestok:. 5 um (C) Referencemærker billeder, der viser de interferometriske effekter. Billeder af en Au nanopartikel fiducial for hvert kamera (CCD1-3) eller total (sum), taget som z-position (i nm, på nederste række) scannes for kalibreringen. Intensiteten inden each kamera kan ses at oscillere med en faseforhold, som vist i (B). (D) iPALM kalibreringskurve. Prøven forskudt langs z-aksen. Intensiteten af en Au nanopartikel fiducial for EMCCD1-3 er showet som rød, grøn og blå linjer, henholdsvis (øverst). Disse er normaliseres derefter og passer til at bestemme forskelle fase (nederst). Under tilpasningen er systemet justeres for at opnå de maksimale faseforskelle mellem alle tre kameraer. Kalibreringskurven er taget på hver billedbehandling sted at bruge i udvinding af z-koordinat af hver enkelt molekyle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Single Molecule Imaging af Photoswitching AlEXA Fluor 647-phalloidin actin Labels. (A) Indledende photoswitching trin. F-actin i fikserede celler er mærket ved en høj tæthed af phalloidin konjugeret til Alexa Fluor 647. Høj intensitet belysning i et thiolholdige billedbufferen resulterer i hurtig frakobling af de fleste fluoroforer. (B) Repræsentative rammer af rå single-molekyle rammer. Ved steady-state blinker, skal den aktiverede Alexa Fluor 647 være tilstrækkeligt sparsom, at individuelle enkelte molekyler vises som en PSF-sized stedet. Billeder af de samme celler er vist i (A), er vist med invers kontrast. Scale barer i A og B:. 5 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Drift Korrektion ved hjælp multip. le referencemærkerne Lokalisering koordinater for fire referencemærkerne (A, x-koordinaten, B, y-koordinat) blev anvendt til at beregne afdrift under anvendelse polynomium fittings (5 th orden, fit parametre på øverste højre hjørne). Den gennemsnitlige drift bane tillader korrektion af drift med sub-5 nm præcision (x: 3,085 nm, y: 3,606 nm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Visualisering af 3-D f-actin Arkitektur efter iPALM. (A) diffraktionsbegrænset billede af HUVEC-celler med F-actin mærket med Alexa Fluor 647-phalloidin (svarende til delområder af cellen i figur 2). Den lyspunkt skyldes de Au nanopartikel referencemærkerne.
Figur 5: Nanoscale Dimension af f-actin visualiseret ved iPALM. (A) Rekonstrueret iPALM billede HUVEC celler med f-actin mærket b y Alexa Fluor 647-phalloidin. Farven angiver z-koordinat ifølge farvestang. Målestok:. 1 um (B) tværgående tværsnit histogram af x, y-koordinater lokalisering langs den lange akse af indrammede areal i (A). Til opnåelse histogrammet, bliver koordinaterne projiceret på den lange akse af boksen og sammenflettede med en 5-nm bin-størrelse. Den grå kurve angiver en gaussisk bedste tilpasning til histogrammet, med en fuld bredde ved halvt maksimum (FWHM) af 43,88 nm. (C) Histogram af z-positionen af geografiske koordinater i indrammede areal i (A). Z-positioner binned med en bin størrelse på 1 nm. Den grå kurve viser en gaussisk bedste tilpasning til histogrammet, med en FWHM på 17,50 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
/files/ftp_upload/54774/54774fig6.jpg "/>
Figur 6:. Sammenligning af iPALM Imaging af f-actin Brug af forskellige mærkningsreagenser Rekonstrueret iPALM billeder af f-actin mærket ved anvendelse Alexa Fluor 647-konjugeret phalloidin (A), Alexa Fluor 568-konjugeret phalloidin (B), eller ved transfektion med actin -mEos2 fusionsprotein-ekspressionsvektor (C). Scale barer (AC):. 1 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det optiske system i iPALM er baseret på en 4-π dobbelt imod objektiv design, som vist i figur 1A. Opsætningen er konstrueret ved hjælp af både custom-bearbejdede og kommercielle opto-mekaniske dele, som beskrevet tidligere 23 og anført i tabel 1. Ud over vores setup, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) er vært for et system, der er tilgængeligt for det videnskabelige samfund på Advanced Imaging Center på Janelia Research Campus. For den fulde mekaniske tegninger, kontrol skemaer, og software, er læserne opfordres til at spørge Harald Hess på HHMI for yderligere information. En primær fordel for brug iPALM samt andre enkelt-molekyle lokalisering mikroskopimetoder til visualisering f-actin er den relative lethed af prøvefremstilling sammenlignet med EM-teknikker, som generelt kræver barske prøve behandling, møjsommelig forberedelse, og højtuddannede fagfolk 3,23 . Additionally, fluorescens er naturligvis modtagelig for multikanal billedbehandling, som stadig er svært for EM. Ikke desto mindre, som beskrevet yderligere nedenfor, er der flere nuværende begrænsninger for tilgang, både hvad angår prøvepræparation og billedbehandling proces. Først, som det er tilfældet for forberedelse EM prøve, skal der drages omsorg for at sikre en god ultrastrukturelle bevarelse af prøverne 35, da en protokol passende for en diffraktion-begrænset niveau af opløsning kan forårsage alvorlige forstyrrelser på nanoskala niveau. For actin billeddannelse, korrekt fiksering af cellerne er en vigtig faktor, der påvirker modellen kvalitet. Glutaraldehyd er et foretrukket fiksativ da den bevarer cytoskelettet og membranen meget godt, men i tilfælde af co-farvning med antistof, kunne epitop sites blive påvirket. I sådanne tilfælde kan paraformaldehyd tilbyde et acceptabelt kompromis, da det har en tendens til bedre at bevare antistof epitop sites. Vigtigere for enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi, disse fixativ tendensat generere baggrund autofluorescens; således, post-fiksering quenching af borhydrid er nødvendig, især i tilfælde af glutaraldehyd.
Derudover korrekt udvælgelse af fluoroforer og strategier mærkning er blandt de vigtigste faktorer for vellykkede eksperimenter. På grund af den nanoskala dimension af f-actin, er høje tætheder af etiketter forpligtet til at fange de underliggende trådformede netværk, som fastsat af Nyquist sampling teorem 36. For actin, phalloidin tillader mærkning meget høj densitet, med en lang række organiske fluoroforer tilgængelige fra mange producenter. Men da phalloidin er giftigt, celle fiksering og permeabilisering påkrævet. Alternative strategier for live-cell kompatibel actin mærkning omfatter brug fusion af fluorescerende proteiner (FP), enten med monomert actin eller med små actinbindende polypeptider. Vi fandt imidlertid, at disse har tendens til at give en lavere densitet mærkning sammenlignet med phalloidin (
39. Det gælder også for de fordele og begrænsninger ved iPALM. Sammenlignet med andre 3-dimensionelle super opløsning mikroskopiteknikker har iPALM lå højest-løsning optisk tilgang til dato, især langs z-aksen, med z-opløsning næsten 2 gange bedre end x, y-resolution 11. Men afhængigheden af iPALM på interferometri for en høj z-opløsning indeholder desuden en restriktion på den billeddannende dybde, da kalibreringskurven er periodisk. Med andre ord, z-koordinaterne gentage hver 250 nm eller deromkring (for ~ 700 nm emissionsbølgelængder af Alexa Fluor 647). I praksis kan dette løses ved at anvende TIRF belysning, som begrænser excitation zone til inden for det flygtige felt dybde <200 nm fra dækglasset. Således, fluorophorer dybere ind i prøven ikke er spændt og forbliver usynlig. Men dette begrænser også de biologiske strukturer, der kan afbildes til dem i umiddelbar nærhed af dækglasset, såsom fokale adhæsioner, kortikal cytoskelet og ventral plasmamembranen, mens flere indvendige strukturer er uden for rækkevidde. For faste prøve, en mulighed at udføre cryosectioning 40. Men en sådan fremgangsmåde er meget besværlig og kræver specialiseret ekspertise, der ikke er almindeligt tilgængelige.
Alternativt kan iPALM tilpasses til et udvidet z-interval ved at kombinere interferometri med astigmatisk-defokusering skema 12, skal i 3D-STORM. Denne fremgangsmåde giver dobbelt z-koordinat udlæsninger, den første af interferometri, som er høj præcision, men periodisk, og den anden ved astigmatisk defokusering, hvilket er mindre præcis, men ikke-periodisk. Sidstnævnte kan så bruges til at "pakke" eller bryde degenerationen afde interferometriske z-koordinater, således at den tredobling af iPALM billedbehandling dybde til ~ 750 nm, effektivt nærmer iboende omdrejningspunkt dybde af høje NA objektive linser. Med fase udpakning har iPALM blevet anvendt til billede strukturer dybt inde prøverne, såsom mitochondrier, omend med lidt reduceret præcision i alle 3 dimensioner grund af den yderligere defokusering 40.
En anden iboende begrænsning i iPALM er billeddannelseshastighed. Da et stort antal rammer er forpligtet til at opnå en høj tæthed af lokalisering koordinater, kameraet hastighed er normalt grænsen for køb sats. Med de nuværende EMCCD kameraer kører på 10 - 20 MHz udlæsning satser, er ti minutter nødvendige for et tilstrækkeligt antal rammer. Sådanne lange tidsskalaer kræver, at prøven skal fastsættes. Her seneste fremskridt inden kamerateknologi, såsom meget hurtigere videnskabelige Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) kamera, kan muliggøre en hurtig stigning i imaldrende hastighed 41, selv om dette ikke er blevet implementeret for iPALM endnu. For nogle enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi tilgange, kan en tæt enkelt-molekyle felt analyseres med en modificeret algoritme 42 eller komprimeret sensing 43. Tilpasningen af sådanne strategier kan også fremskynde iPALM ved at tillade tættere enkelt molekyle billeder og dermed færre frames.
Med begrænsninger i hastighed og billedbehandling rækkevidde og styrker i rumlig opløsning, en stor ansøgning om iPALM er som en ultrastrukturelle metode, der udnytter fordelene ved fluorescerende mærkning at afsløre nanoskala organisering af specifikke proteiner 14,15,44. Yderligere forbedringer, både i form af optik og fluoroforen teknologier, bør gøre det muligt yderligere forbedring i iPALM rumlig opløsning. F.eks iPALM billedbehandling beskæftiger en relativt simpel første ordens tilnærmelse tilgang, hvor hver enkelt molekyle modelleret af en 2D-Gauss-funktion og somdrikkes at være en isotopisk gennemsnit dipol. Denne kunne styrkes med nyere metoder, som anvender en mere nøjagtig model af point-spread funktion og dipol orientering eller eksplicit behandling af optiske aberrationer tværs af synsfeltet til markant at forbedre rumlig opløsning. Ligeledes har photocaging blevet rapporteret, hvilket forbedrer fluorophor lysstyrke ved størrelsesordener 45. Faktisk da centrale elementer i deres ultrastrukturelle organisation er blevet godt karakteriseret, kunne f-actincytoskelettet være en yderst værdifuld modelsystem til test yderligere metodologiske udvikling i iPALM. Evnen til at analysere protein organisation ved lysmikroskopi med ægte EM-niveau opløsningsevne forventes i høj grad at forbedre vores forståelse af utallige aspekter af cellulær struktur og funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
YW og PK takker midler støtte fra Singapore National Research Foundation, tildelt PK (NRF-NRFF-2011-04 og NRF2012NRF-CRP001-084). Vi takker også MBI åbne lab og mikroskopi core faciliteter til støtte infrastruktur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100 mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200 mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200 mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100 mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D.
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C.
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C.
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
