نقدم بروتوكول لتطبيق التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)، 3-الأبعاد جزيء واحد توطين طريقة سوبر قرار المجهر، لتصوير الهيكل الخلوي الأكتين في خلايا الثدييات ملتصقة. هذا النهج يسمح التصور القائم خفيفة من الميزات الهيكلية النانوية التي من شأنها أن تبقى على خلاف ذلك دون حل نتيجة التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود.
مضان المجهر يمكن رؤية مباشرة من الجزيئات الحيوية محددة داخل الخلايا. ومع ذلك، للفحص المجهري مضان التقليدية، ويقتصر القرار المكانية التي الحيود إلى ~ 200 نانومتر داخل الطائرة صورة و> 500 نانومتر على طول المحور البصري. ونتيجة لذلك، المجهر مضان منذ فترة طويلة محدودة للغاية في مراقبة ملامح التركيبية داخل الخلايا. والتغلب على التطورات الأخيرة في طرق الفحص المجهري سوبر القرار هذا الحد. على وجه الخصوص، وظهور fluorophores photoswitchable تمكن القائم على توطين سوبر قرار المجهري، والتي تنص على حل السلطة يقترب من النطاق طول الجزيئي. هنا، نحن تصف تطبيق سوبر طريقة قرار المجهر ثلاثي الأبعاد على أساس واحد جزيء المجهري التعريب والتداخل متعدد المراحل، ودعا التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM). يوفر هذا الأسلوب قرار موحد الخواص على ما يقرب منترتيب 20 نانومتر في جميع الأبعاد الثلاثة. بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي الأكتين الخيطية، بما في ذلك إعداد العينات وتشغيل أداة iPALM، توصف هنا. هذه البروتوكولات هي أيضا قابلة للتكيف بسهولة ومفيدة لدراسة الخصائص التركيبية الأخرى في الخلايا.
كان التصور من الهياكل الخلوية المعقدة منذ فترة طويلة جزءا لا يتجزأ من رؤى البيولوجية والاكتشاف. على الرغم من أن الفحص المجهري مضان يمكن أن خلايا صورة مع خصوصية جزيئية عالية، ويقتصر حل السلطة عن طريق حيود إلى ~ 200 نانومتر في الطائرة صورة (س، ص، أو البعد الأفقي) و> 500 نانومتر على طول المحور البصري (ض، أو البعد المحوري) 1،2. وبالتالي، فإن مراقبة ملامح التركيبية تاريخيا تقتصر على المجهر الإلكتروني (EM). لحسن الحظ، فإن التطورات الأخيرة في القرار المجهر السوبر والتحايل هذا الحد، مما يتيح القرار المكانية في 10 – مجموعة نانومتر 100 1-6. على وجه الخصوص، نهج سوبر قرار بناء على توطين جزيء واحد، والمعروف من قبل المختصرات مثل نخلة (PhotoActivated التعريب المجهري) 4، FPALM (الإسفار PhotoActivated التعريب المجهري) 5 (د) STORM (مباشر الاستوكاستك البصرية التعمير المجهري) 6،7، والطلاء ( بوتراكم كثافة التصوير النانو طبوغرافية) 8، GSDIM (الدولة الأرضي استنفاد المجهر تليها عودة الجزيئية الفردية) 9، أو SMACM (أحادي جزيء نشط تحكم المجهري) 10، وكذلك () تطبيقات على 3 الأبعاد 3D، مثل PALM التداخل (iPALM) 11 أو 3D-STORM 12، كانت قيمة في الكشف عن رؤى جديدة في المنظمة النانو العديد من الهياكل البيولوجية، بما فيها المحاور العصبية والمشابك 13، الالتصاقات البؤرية 14،15، تقاطعات خلية خلية 16، المسام النووية 17 وجسيم مركزي 18-20، على سبيل المثال لا الحصر.
ميزة أخرى التركيبية في الخلايا التي سوبر قرار المجهر مفيد يحتمل أن تكون هي الهيكل الخلوي الأكتين. شبكه معقدة من الخيطية (و) -actin في القشرة خلية يلعب دورا أساسيا في التحكم في شكل الخلوية والخصائص الميكانيكية 21. المنظمة سبنشاط وحيوي ينظم و و الأكتين على الرغم من العديد من البروتينات التنظيمية التي تؤثر بقوة البلمرة، يشابك، والدوران، والاستقرار، وهيكل الشبكة (22). ومع ذلك، على الرغم من أن توصيف العمارة شبكه-و أكتين مهم للرؤى الآلية إلى مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية، وحجم صغير (~ 8 نانومتر) من شعيرات و أكتين يعيق مراقبتهم من قبل التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود. وبالتالي، فإن التصور من هيكل غرامة الأكتين وحتى الآن تم تنفيذ حصريا من قبل EM. هنا، نحن تصف بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي، و الأكتين في خلايا الثدييات الملتصقة، وذلك باستخدام سوبر قرار تقنية المجهر iPALM للاستفادة من قدرتها دقة عالية جدا في 3D 11،23. على الرغم من أن أداة iPALM متخصصة للغاية، وقد وصفت تعليمات حول إعداد مثل هذا الصك مؤخرا 23، في حين أن الوصول إلى المجهر iPALM استضافته هوكما أحرز جناح معهد هيوز الطبي المتاح للمجتمع البحوث بأقل تكلفة ممكنة. بالإضافة إلى ذلك، أساليب إعداد العينات المذكورة هنا قابلة للتطبيق مباشرة إلى النهج البديلة 3D السوبر القرار، مثل تلك التي تقوم على defocusing اللابؤرية وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية) 12 أو ثنائية طائرة الكشف عن 24، والتي تتوفر على نطاق أوسع.
ونلاحظ أن عنصر ضروري لقرار المجهر سوبر استنادا توطين جزيء واحد في العام هو fluorophore photoswitchable 25، والذي يسمح الشروط الثلاثة الهامة للأساس توطين جزيء واحد سوبر قرار المجهر الواجب توافرها: أ) ارتفاع واحد جزيء السطوع والتباين بالنسبة إلى الإشارات الخلفية؛ ب) توزيع متفرق من الجزيئات واحدة في إطار صورة معينة. وثالثا) كثافة مكانية عالية من وضع العلامات كافية لالتقاط الملامح العامة للهيكل الأساسي (المعروف أيضا باسم نيكويست شاالمعيار أخذ العينات nnon) 26. وهكذا، للحصول على نتائج مرضية، ينبغي التشديد على قدم المساواة على كل من الإعداد المناسب من العينات لتحسين fluorophore photoswitching والحفاظ على التركيب الدقيق الأساسي، فضلا عن أدوات القياس واكتساب جوانب التجارب.
ويستند النظام البصري من iPALM على تصميم موضوعي 4 و- ð ثنائي تعارض، كما هو مبين في الشكل 1A. يتم إنشاء الإعداد باستخدام أجزاء كل من عرف تشكيله والتجارية البصريات الميكانيكية، كما هو موضح سابقا 23 والمدرجة في الجدول 1. بالإضافة إلى الإعداد لد…
The authors have nothing to disclose.
ستشغل وPK الامتنان الدعم المالي من مؤسسة البحوث الوطنية في سنغافورة، منحت لPK (جبهة الخلاص الوطني، NRFF-2011-04 وNRF2012NRF-CRP001-084). كما نشكر مختبر والأساسية المجهر مفتوحة مرافق MBI لدعم البنية التحتية.
optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
baseplate | local workshop | customized | |
turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |