JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Tre-dimensionel Super Resolution Mikroskopi af F-actinfilamenter af Interferometrisk fotoaktiverede Lokalisering Microscopy (iPALM)

Published: December 01, 2016
doi:
10.3791/54774
,
1Department of Biology,South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering,National University of Singapore

Summary

Vi præsenterer en protokol for anvendelse af interferometrisk fotoaktiverede Lokalisering Microscopy (iPALM), en 3-dimensionel single-molekyle lokalisering super opløsning mikroskopi metode til billeddannelse af actincytoskelettet i vedhængende pattedyrceller. Denne fremgangsmåde giver lys-baserede visualisering af nanostørrelse strukturelle træk, der ellers ville forblive uløste ved konventionel diffraktionsbegrænset optisk mikroskopi.

Abstract

Fluorescensmikroskopi muliggør direkte visualisering af specifikke biomolekyler i cellerne. Men for konventionel fluorescensmikroskopi, er den rumlige opløsning er begrænset af diffraktion til ~ 200 nm inden billedplanet og> 500 nm langs den optiske akse. Som følge heraf fluorescensmikroskopi har længe været stærkt begrænset i observationen af ​​ultrastrukturelle træk i celler. Den seneste udvikling i super opløsning mikroskopi metoder har overvundet denne begrænsning. Især fremkomsten af ​​photoswitchable fluoroforer muliggør lokalisering-baserede superopløsningsteknologi mikroskopi, som giver opløsningsevne nærmer sig molekylær-længde skala. Her beskriver vi anvendelsen af ​​en tre-dimensionelle super opløsning mikroskopi metode baseret på single-molekyle lokalisering mikroskopi og multifase interferometri, kaldet interferometrisk fotoaktiverede Lokalisering Microscopy (iPALM). Denne metode giver næsten isotropisk beslutning omordre på 20 nm i alle tre dimensioner. Protokoller til visualisering af filamentøse actincytoskelettet, herunder prøvepræparation og drift af iPALM instrument, er beskrevet her. Disse protokoller er også let tilpasses og lærerigt for studiet af andre ultrastrukturelle funktioner i celler.

Introduction

Visualiseringen af ​​komplekse cellulære strukturer har længe været en integreret biologiske indsigt og opdagelse. Selvom fluorescensmikroskopi kan billede celler med høj molekylvægt specificitet, dens opløsningsevne er begrænset af diffraktion til ~ 200 nm i billedplanet (x, y eller lateral dimension) og> 500 nm langs den optiske akse (z, eller aksiale dimension) 1,2. Derfor har observation af ultrastrukturelle træk historisk set været begrænset til elektronmikroskopi (EM). Heldigvis har den seneste udvikling af super opløsning mikroskopi omgået denne grænse, så rumlig opløsning i 10 – 100 nm rækkevidde 1-6. Især tilgange super resolution baseret på enkelt molekyle lokalisering, kendt af akronymer såsom PALM (fotoaktiverede Lokalisering Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence fotoaktiverede Lokalisering Microscopy) 5 (d) STORM (direkte Stochastic Optical Genopbygning Microscopy) 6,7, PAINT ( Point Ophobning for Imaging Nanoscale Topography) 8, GSDIM (grundtilstand Depletion Microscopy efterfulgt af individuelle molekylære tilbagevenden) 9, eller SMACM (Single-Molecule Active-Control Microscopy) 10, samt deres 3-dimensionelle (3D) implementeringer, såsom interferometrisk PALM (iPALM) 11 eller 3D-STORM 12, har været værdifulde i at afsløre nye indsigter i nanoskala organisering af talrige biologiske strukturer, herunder neuronale axoner og synapser 13, fokale sammenvoksninger 14,15, celle-celle vejkryds 16, nuklear porer 17 og centrosomer 18-20, for at nævne nogle få.

En anden ultrastrukturelle træk i celler, for hvilke super opløsning mikroskopi er potentielt nyttig er actincytoskelettet. Komplekset meshwork af filamentøse (f) actin i cellen cortex spiller en væsentlig rolle i kontrollen af cellulær form og mekaniske egenskaber 21. Organisationen of f-actin er aktivt og dynamisk reguleret selvom mange regulatoriske proteiner, som har stor indflydelse polymerisering, tværbinding, omsætning, stabilitet, og netværk topologi 22. Selv om karakterisering af f-actin meshwork arkitektur er vigtig for mekanistiske indsigt i en bred vifte af cellulære processer, den lille størrelse (~ 8 nm) af F-actin filamenter hæmmer deres observation ved konventionel diffraktionsbegrænset lysmikroskopi; således, visualiseringen af ​​actin fine struktur har hidtil udelukkende været udført af EM. Her beskriver vi protokoller til visualisering af f-actincytoskelettet i klæbende pattedyrceller, ved hjælp af iPALM super opløsning mikroskopi teknik til at drage fordel af sin meget høj præcision kapacitet i 3D 11,23. Selvom iPALM instrumentet er højt specialiseret, har instruktion om at oprette et sådant instrument blevet beskrevet for nylig 23, mens adgang til iPALM mikroskop vært ved Howard Hughes Medical Institute er også blevet stillet til rådighed for forskersamfundet med minimale omkostninger. Derudover prøvepræparation, der er beskrevet heri, er umiddelbart til alternative 3D super opløsning tilgange, såsom dem baseret på astigmatisk defokusering af punktspredningsfunktionen (PSF) 12 eller bi-plane afsløring 24, som er mere bredt tilgængelige.

Vi bemærker, at en nødvendig ingrediens for enkelt-molekyle lokalisering-baserede super opløsning mikroskopi generelt er den photoswitchable fluorophor 25, som giver de tre kritiske krav til single-molekyle lokalisering-baserede super opløsning mikroskopi, der skal opfyldes: i) høje enkelt-molekyle lysstyrke og kontrast i forhold til baggrunden signaler; ii) sparsomme fordeling af enkelte molekyler i en given billedramme; og iii) høj rumlig densitet på mærkning er tilstrækkelig til at indfange profilen af ​​den underliggende struktur (også kendt som Nyquist-ShanFiler, som ikke kriterium prøveudtagning) 26. Således for tilfredsstillende resultater, bør der lægges vægt ligeligt på både ordentlig forberedelse af prøver til at optimere fluoroforen photoswitching og bevare den underliggende ultrastruktur, samt på instrumentering og overtagelser aspekter af forsøgene.

Protocol

1. Imaging Klargøring Da baggrund fluorescens signaler forstyrrer fluorescens fra fluoroforen etiketter, rense dækglas ved først at skylle dem i deioniseret vand (Hedeselskabet 2 O) og derefter luft-tørre dem med trykluft. Efterfølgende udfører plasmaætsning i et plasma renere i 15 s, eller længere, hvis det er nødvendigt. For at aktivere afdrift korrektion og iPALM kalibrering, brug # 1.5 runde (22 mm diameter) pre-rensede dækglas indlejret med fluorescerende nanopartikler som …

Representative Results

Kritiske krav til iPALM er opretningen, registreringen, og kalibrering af de optiske systemer. Disse er nødvendige for at sikre korrekt indgreb i den 3-vejs stråledeler forudsætning for z-koordinat udvinding. For at aktivere kontinuerlig overvågning, konstant punktkilder af fluorescens er nødvendige. Dette kan opnås med fluorescerende Au eller bi-metalliske nanopartikler 23 hvis fotoluminescens skyldes lokaliseret overfladeplasmonresonans (LSPR). De fungerer som en stabi…

Discussion

Det optiske system i iPALM er baseret på en 4-π dobbelt imod objektiv design, som vist i figur 1A. Opsætningen er konstrueret ved hjælp af både custom-bearbejdede og kommercielle opto-mekaniske dele, som beskrevet tidligere 23 og anført i tabel 1. Ud over vores setup, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) er vært for et system, der er tilgængeligt for det videnskabelige samfund på Advanced Imaging Center på Janelia Research Campus. For den fulde me…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

YW og PK takker midler støtte fra Singapore National Research Foundation, tildelt PK (NRF-NRFF-2011-04 og NRF2012NRF-CRP001-084). Vi takker også MBI åbne lab og mikroskopi core faciliteter til støtte infrastruktur.

Materials

optical table Newport, CA  RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators 
vibration isolator for optical table Newport, CA  S-2000 
laser-642 Newport, CA  1185055 output power=100mw
laser-561 Newport, CA  1168931 output power=200mw
laser-488 Newport, CA  1137970 output power=200mw
laser-405 Newport, CA  1142279 output power=100mw
broadband dielectric mirrors  Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter  Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter  AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA  05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts  New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner  New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK  DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra  available
fibronectin  Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde  Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
 Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4)  Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine  Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil  Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L., et al. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

Tags

3D Super Resolution MicroscopyIPALMF-actin FilamentsUltrastructural VisualizationSingle Molecule LocalizationCell Sample PreparationImaging BufferCover Glass AssemblyEpoxy SealingNewton’s Rings Pattern

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image