우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.
형광 현미경은 세포 내 특정 생체 분자를 직접 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 종래의 형광 현미경, 공간 해상도는 광축을 따라 결상면과> 내지 500nm에서 ~ 200 nm의 회절에 의해 제한된다. 결과적으로, 형광 현미경은 오랫동안 심각한 세포 내 미세 기능의 관찰에 한정되었다. 초 해상 현미경 방법의 최근 발전은 이러한 한계를 극복하고있다. 특히, 광전 환성 형광체의 출현 분자 길이 스케일에 접근 해상력을 제공하는 기반 지역화 초 해상 현미경을 가능하게한다. 여기서는 간섭계 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM)이라는 단일 분자 파악 현미경 다상 간섭에 기초하여 입체 초 해상 현미경 법의 적용을 설명한다. 이 방법은에 거의 등방성 해상도를 제공세 가지 차원에서 20 나노 미터의 순서. iPALM 악기의 시료 준비 및 운영을 포함하여 사상 액틴 세포 골격을 시각화 프로토콜, 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포에서 다른 미세 구조 기능 연구에 쉽게 적응과 교훈입니다.
복잡한 세포 구조의 시각화는 오랫동안 생물 통찰력과 발견을 통합하고있다. 형광 현미경은, 그 해상력이 ~ 200 화상면에 나노 (X, Y, 또는 측 방향 치수) 및> 500 nm의 광학 축 방향 (Z, 또는 축 방향 치수)에 회절 고분자 특이성 화상 세포 제한 할 수 있지만 1, 2. 따라서, 미세 기능 관찰 역사적 전자 현미경 (EM)로 제한되어왔다. 100 nm의 범위 1-6 – 다행히, 슈퍼 해상도 현미경의 최근 발전은 10에서 공간 해상도를 가능하게,이 제한을 회피했다. 특히, 슈퍼 해상도는 같은 PALM (광 활성화 현지화 현미경) 4, FPALM은 (형광 광 활성화 현지화 현미경) 5 (d)에 STORM (직접 확률 광학 재건 현미경) 6, 7, PAINT (같은 약어로 알려진 단일 분자 현지화에 기반 접근 방법 포이미징 나노 지형) 8 INT의 축적은, GSDIM (접지 상태 고갈 현미경 9) 개별 분자 반환 한 다음, 또는 SMACM (단일 분자 액티브 제어 현미경) (10),뿐만 아니라 그들의 3 차원 (3D) 구현, 간섭 PALM (iPALM) 11 3D-STORM (12)는 신경 세포의 축삭을, 다수의 생물학적 구조의 나노 조직에 새로운 통찰력을 드러내는 포함 귀중한되었습니다 및 초점 유착 14, 15, 세포 – 세포 접합 (16), 원자력이 17 모공, 13 시냅스 및 중심체 18 ~ 20 등이 있습니다.
슈퍼 해상도 현미경은 잠재적으로 유용하는 세포의 또 다른 미세 기능은 액틴 세포 골격이다. 셀 피질 필라멘트 (F) 액틴의 복잡한 그물 세공은 세포 형태 및 기계적 특성 (21)의 제어에 중요한 역할을한다. 조직 오F의 F-액틴 적극적 동적 강하게 중합, 가교, 회전율, 안정성 및 네트워크 토폴로지 (22)에 영향을 미치는 수많은 조절 단백질 비록 조절된다. 그러나, F – 굴지 그물 세공 구조의 특성은 세포 과정의 다양한 범위, 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 자신의 관찰을 방해은 F-액틴 필라멘트의 작은 크기 (~ 8 ㎚)에 기계적인 통찰력에 대한 중요하지만, 따라서 액틴 미세 구조의 시각화 종래 독점적 EM에 의해 수행되었다. 여기서는, 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격 F-시각화 3D 11,23에 매우 높은 정밀도 기능을 활용할 iPALM 초 해상 현미경 기술을 사용하는 프로토콜을 기술한다. iPALM 악기는 매우 전문 있지만, 이러한 장비를 설정하는 방법에 대한 지시는 최근 23 설명되어있는 호 주최 iPALM 현미경에 액세스하는 동안구 휴즈 의학 연구소는 또한 최소의 비용으로 연구 커뮤니티에 제공하고있다. 또한, 본원에 기재된 시료 제조 방법은 더 광범위하게 사용할 수있는 등의 점 확산 함수 (PSF)의 난시 디 포커싱 기반으로하는 다른 3D 슈퍼 해상도 방법, (12) 또는 이중면 검출부 (24)에 직접적으로 적용될 수있다.
우리는 일반적으로 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 필요한 성분이 충족되어야 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 세 가지 핵심 요구 사항을 수있는 광전 환성 형광 25이므로주의 : ⅰ) 높은 단일 분자 배경 신호의 밝기 및 대비 상대; ⅱ) 소정의 이미지 프레임 내의 단일 분자의 희박한 분포; 또한 나이 퀴 스트 – 샤로 알려진 기본 구조 (의 프로필을 캡처하기에 충분한 라벨 및 ⅲ) 높은 공간 밀도nnon 샘플링 기준) 26. 따라서, 만족스러운 결과를 위해, 형광체의 강조 photoswitching을 최적화하고 기본 미세 구조를 보존 할뿐만 아니라, 실험 기기 및 수집 측면하는 시험편의 적절한 준비를 모두 동등하게 배치되어야한다.
도 1a에 도시 된 바와 같이 iPALM의 광학계는, 4 π 이중 대향 대물 설계에 기초한다. 표 1에 이전 (23) 설명 및 나열된 설정은 사용자 정의 가공 및 상업 모두 광학 기계 부품을 사용하여 구성된다. 우리의 설치뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI)는 Janelia 연구 캠퍼스에서 고급 이미지 센터에서 과학계에 액세스 할 수있는 시스템을 호스팅합니다. ?…
The authors have nothing to disclose.
YW 및 PK는 감사 PK (NRF-NRFF-2011-04 및 NRF2012NRF-CRP001-084)에게 수여 싱가포르 국립 연구 재단에서 자금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 인프라 지원을위한 MBI 개방 실험실과 현미경의 핵심 시설을 주셔서 감사합니다.
optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
baseplate | local workshop | customized | |
turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |