Introduction
A determinação da estrutura de uma biomolécula é um pré-requisito fundamental para a compreensão da sua função. Dois métodos bem estabelecidos para a determinação da estrutura são microscopia de elétrons crio e cristalografia de raios X 1, 2. Hoje em dia, ambos os métodos proporcionam informação estrutural de alta resolução com uma resolução até o nível Angstrom. Estes dois métodos têm sido utilizados extensivamente para elucidar a estrutura de biomoléculas grandes, tais como complexos de proteína. Embora os métodos existentes têm sido constantemente melhorado ao longo das últimas décadas, a complexidade das estruturas biológicas ainda representa um grande desafio para a biologia estrutural, especialmente quando grandes complexos, dinâmicos e transitórios são investigados 3.
A fim de estudar a dinâmica dos complexos macromoleculares ea relação estrutura-função em particular, metodologias de molécula única tem provinformações úteis ided 4. Várias novas estratégias foram desenvolvidas fornecendo uma abordagem ortogonal sobre a aquisição de informação estrutural e dinâmica. Exemplos são de alta velocidade AFM 5, 6 manipulação mecânica, microscopia de fluorescência localização 7, bem como uma única molécula de Transferência de Energia de Ressonância de Förster (smFRET) 8, 9. Desde muito cedo na FRET tem sido denominado uma régua molecular, devido à distância a dependência na escala de comprimento de 10 biomacromoléculas.
Uma aplicação particularmente interessante do smFRET é usar a informação obtida a partir de medições de distância smFRET inferir estrutural informações 11, 12, 13, 14, 15 >, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Devido à elevada resolução de tempo de smFRET, a posição dos elementos móveis de uma estrutura de proteína pode ser localizada. No entanto, a fim de extrair a informação quantitativa a partir de dados smFRET importantes parâmetros de correcção sobre as moléculas de corante precisa de ser determinada durante a medição 24. Com estes factores de correcção, a eficiência de FRET FRET E pode ser calculado usando a fórmula
,
onde A e I D Figura 2). O fator β representa cross-talk, a fuga de emissões de doadores para o canal receptor e é calculado
onde eu A e I 'D são as intensidades de fluorescência do dador e da molécula receptora após a foto branqueamento da molécula receptora.
O factor γ corrige a diferença nas eficiências de detecção em relação nos dois canais, bem como as diferenças no rendimento quântico de fluorescência do dador e o corante aceitador. É calculado de cada traço do tempo individual,
Note-se, que esta descrição negligencia excitação directa da molécula aceitadora, que por vezes se torna importante e que seria necessário para ser corrigido para assim. Para determinar esses fatores de correção é útil para excitar tanto o doador, bem como o receptor em um esquema de alternância 25, a fim de diferenciar entre mudanças foto-física e dinâmica estrutural.
A fim de não só obter eficiências smFRET quantitativos, mas também informações sobre a estrutura quantitativa, o Sistema de Nano-Posicionamento (NPS) foi introduzido em 2008 26. O nome foi escolhido com base nas suas semelhanças com o sistema de posicionamento global por satélite (GPS). O NPS é uma técnica híbrida que combina smFRET e os dados de cristalografia de raios-X para a localização de posições de corante desconhecidos em complexos biomacromolecular. O Crystal estrutura serve como uma armação de referência e os resultados smFRET são utilizadas para obter informação sobre a distância entre uma posição desconhecido fluoróforo (antena) e uma posição conhecida a partir da estrutura cristalina (satélite). Em experiências consecutivas as distâncias entre a antena e vários satélites são medidos e a posição da antena é determinada por meio de um esquema de análise estatística rigorosa com base na estimativa de parâmetros Bayesiano. Como resultado, não só a posição mais provável da antena é calculado, mas a sua distribuição incerteza 3D completa, a chamada posterior, visualizado por volumes credíveis. Além disso, o NPS foi expandido para permitir a análise de redes atinjam 27 smFRET.
O NPS tem sido utilizado para resolver um certo número de questões importantes na transcrição eucariótica, ou seja, o curso do ADN a montante, o DNA não-molde e o ARNm nascente no co alongamento de ARN polimerase IImplex 12, 28, também demonstra o efeito de factores de iniciação da transcrição 26 e a arquitectura dinâmico de um promotor-aberto complexo 29. Além disso, o NPS foi usada para elucidar a estrutura do complexo de archaea aberta de ARN polimerase 30 e, em particular, a posição de início de transcrição factor de TFE, que se liga competitivamente ao mesmo local como o factor de alongamento da transcrição Spt4 / 5 31.
Desde então, uma série de abordagens baseadas smFRET estruturais foram publicados 15, 18, 21, 23. Ao comparar diferentes métodos baseados smFRET estruturais, torna-se claro que a aparente precisão do método é altamente dependente da escolha particular de modelos de corante. Note-se quemoléculas de corante pode apresentar um comportamento espacial e de orientação diferente, dependendo do seu ambiente local.
Para este fim, Fast-NPS foi introduzido 32. Fast-NPS usa um algoritmo de amostragem avançada reduzindo os tempos de cálculo drasticamente. Além disso, o NPS-rápida permite a realização de uma análise estrutural e para cada molécula de corante o utilizador pode escolher a partir de um conjunto de cinco modelos diferentes de corante, que serão descritos a seguir. O modelo mais conservador, chamado de clássico, assume que o corante ocupa apenas um, mas desconhecida, posição. Nesta posição, o fluoróforo pode rodar livremente no interior de um cone, cujo tamanho é determinado a partir do seu respectivo anisotropia de fluorescência (dependente do tempo). A orientação do cone não é conhecida, o que conduz a grandes incertezas na conversão eficiências smFRET medidos em distâncias. A este respeito, é o modelo conservador, uma vez que irá conduzir à menor precisão em comparação com o outro modo de corantels. Somente para distâncias muito curtas caso as suposições feitas pelo modelo de liderança clássico para a determinação da posição visivelmente incorreto. Para valores smFRET típicos, a posição correta é sempre incluído no comparativamente grande volume credível.
No entanto, uma vez que uma maior precisão é desejável, é importante para desenvolver e testar modelos de corantes alternativos, que poderiam ajudar a melhorar a precisão. Se o corante gira muito mais rápido do que o seu tempo de vida de fluorescência inerente, o assim chamado modelo ISO pode ser aplicada. Aqui, o factor de orientação de K 2 (necessária para o cálculo do raio Förster isotrópico característica 
) Está definido para 2/3. Como resultado, os volumes são calculados credíveis quase duas ordens de grandeza menor, em comparação com aqueles no modelo clássico 32. No caso em que o fluoróforo é encontrada num ambiente que permite não só reori rápidoentação, mas o movimento adicionalmente rapidamente em todo o seu volume acessível, deve ser utilizado o modelo meanpos-iso. Neste modelo, o corante ocupa efetivamente apenas uma posição média, onde a média espacial é representada por uma conversão de distância polinomial 15. Este modelo aplica-se, por exemplo, a (geralmente hidrofóbico) corante está ligado a uma região hidrofílica, por exemplo, o ADN. Aplicação do modelo meanpos-iso leva a uma redução adicional do tamanho dos volumes credíveis por um factor de aproximadamente dois. No entanto, um corante ligado a uma proteína pode ligar-se reversivelmente a várias manchas hidrofóbicas em seu volume estericamente acessíveis (AV). Um fluoróforo que instantaneamente alterna entre essas regiões, mas dentro de uma região sofre livre rotação e movimento rápido localizado é melhor descrito pelo modelo VAR-meanpos-iso. Para uma situação semelhante em que o corante não é livre para girar VAR-meanpos modelo se aplica. Mais d etails sobre esses modelos podem ser encontrados em nossa recente publicação 32.
Estes modelos oferecem um extenso repertório de explicar especificamente para os diversos ambientes de um corante pode encontrar e aplicá-las com sabedoria otimiza sua precisão de localização. Em Fast-NPS cada molécula corante ligado a uma posição específica pode ser atribuído a um modelo individual, de modo que Fricção-parceiros são autorizados a ter modelos diferentes. Isto permite a modelagem ilimitadas e próxima do natureza. No entanto, é importante que uma executa testes estatísticos rigorosas para assegurar que o resultado obtido pela combinação modelo final ainda está em concordância com os dados experimentais. Estes testes são incluídos no software Fast-NPS.
A fim de aplicar Fast-NPS para dados experimentais é requerida a medição de (apenas) de três parâmetros de entrada. Em primeiro lugar, o corante de par isotrópico Förster específica raios (/54782/54782eq5.jpg "/>) Têm de ser determinados. Portanto, o rendimento quântico (QY) do corante dador, os espectros de emissão de fluorescência de dador e absorção de aceitador os espectros têm de ser medidos. Essas medições podem ser efectuadas em grandes quantidades, usando um espectrómetro de padrão e um espectrómetro de fluorescência padrão. Para cada par, a R 0 é, então, calculado usando a PhotochemCAD gratuito e pode ser usado na análise de NPS. Além disso, as (tempo-resolvido) anisotropias de fluorescência das moléculas de corante precisa para ser obtido usando uma polarização (e tempo) sensível espectrômetro de fluorescência. no entanto, os parâmetros de entrada mais importantes para fast-NPS são as eficiências smFRET medidos em uma configuração de microscopia de fluorescência única molécula, tais como um total microscópio reflexão interna de fluorescência (TIRFM) .
Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a obtenção de dados smFRET e aplicando Fast-NPS (Figura 1).
Protocol
1. Pré-requisitos e Equipamentos de Laboratório
NOTA: O conjunto da câmara de medição é descrito na Figura 3. A sanduíche de concepção da câmara de medição é constituído por três componentes principais: uma lâmina de vidro de quartzo (sílica fundida), uma película de vedação e uma lamela que veda a câmara de fluxo. A câmara de medição é montado sobre um suporte de amostra de personalização. As dimensões da câmara de amostra e suporte metálico são voltadas para atender a uma lâmina de microscópio de vidro de quartzo padrão (76 mm x 26 mm).
- Corte de quartzo lâminas de vidro usando uma broca de diamante (0,75 mm) nas posições indicadas na Figura 4. A concepção das lâminas de vidro de quartzo é assimétrica, a fim de diferenciar entre os dois lados de cada lâmina.
NOTA: As lâminas de quartzo pode ser re-utilizado depois da medição até que a superfície se torna riscada. - Para montar as câmaras, usar suportes de amostra de metal personalizado como representado na Figura 5 </ Strong>. Os suportes de amostras conter dois fios (M4), a fim de ligar uma entrada e uma tubagem de saída para a câmara de fluxo. Além disso, a utilização de fios (M3), para montar a câmara da amostra no suporte de metal, bem como roscas (M3) para fixar o suporte de prisma para a metade inferior do suporte de metal.
- Realizar as medições smFRET em um tipo de prisma total de microscópio reflexão interna de fluorescência (TIRFM) (Figura 6).
NOTA: O TIRFM apresenta três lasers: um verde (532 nm, Nd: YAG) e um laser vermelho (643 nm, diodo laser) para a excitação do dador e as moléculas de corante aceitador, bem como um laser azul (491 nm , laser de estado sólido bombeado-diodo) para o branqueamento de fundo impurezas fluorescentes na câmara da amostra antes da medição smFRET. Os três feixes de laser são espacialmente combinado e pode ser seleccionado através de um filtro sintonizável acústico-óptico (AOTF). A luz de fluorescência é coletada por um objectivo elevado abertura, dividido em um doador e um acceptou canal, utilizando um espelho dicróico e projetadas em duas câmeras EM CCD. A câmara da amostra é ligado a uma fase micrómetro permitindo o movimento em x e y-sentido com dois motores de passo. Um terceiro motor piezo é usado em conjunto com um IR-laser e um detector sensível à posição para construir um sistema de auto-foco para assegurar foco ideal durante todo o experimento.- Use alternada de excitação laser (ALEX) quando a dinâmica nas trajetórias de tempo FRET são observados 25. Essa dinâmica pode ser causada por qualquer mudanças conformacionais dentro das moléculas ou por flutuações na luminosidade receptor e piscando aceitador.
NOTA: ALEX permite a discriminação entre essas duas causas possíveis e evita erros de interpretação das trajetórias FRET dinâmicos. No entanto, por razões de simplicidade, a parte do protocolo é restringido à análise dos filmes produzidos sem o Alex.
Cuidado: lasers de classe 3B são usados na configuração de fluorescência única molécula. Garantir que adequada laprecauções de segurança ser, de acordo com os regulamentos governamentais locais, foram tomadas antes que o sistema é operado.
- Use alternada de excitação laser (ALEX) quando a dinâmica nas trajetórias de tempo FRET são observados 25. Essa dinâmica pode ser causada por qualquer mudanças conformacionais dentro das moléculas ou por flutuações na luminosidade receptor e piscando aceitador.
- Realizar a medição de absorção utilizado para a determinação do rendimento quântico de um espectrómetro de UV-VIS (ver Materiais e Métodos).
- Executar a medição do espectro de emissão de fluorescência de dador, o espectro de absorção de aceitador e a anisotropia de fluorescência num espectrómetro de fluorescência (ver Materiais e Métodos).
- Prepare câmaras de amostras de acordo com procedimentos publicados 33. Alternativamente, o procedimento descrito em [34] pode ser usado.
- Rotular as amostras investigadas com um dador-aceitador molécula corante par adequado para smFRET e assegurar que há uma porção de biotina para a imobilização na superfície da câmara de amostras.
NOTA: Para localizar uma posição corante antena desconhecido com o software Fast-NPS são necessários diferentes construções de amostra. Cada construção needs ter uma etiqueta na posição de corante antena desconhecido e uma etiqueta numa posição de satélite conhecido a partir da estrutura de cristal. Pelo menos três construções diferentes com corantes ligados à posição da antena de satélite e três posições diferentes são requeridas para resultados precisos. Medidas entre antenas, bem como entre os satélites também são úteis para melhorar a precisão, no entanto, isso requer troca de moléculas de corante que precisa ser corretamente inseridos na análise.
2. Montagem do fluxo de Chambers em um suporte personalizado
- Puxe tubo de silicone (0,8 mm de diâmetro, 2,4 mm de diâmetro externo) para parafusos guia ocos (M4) e cortar o tubo em ambas as extremidades retas deixando uma saliência de 1 cm em ambos os lados, usando uma lâmina afiada. Ajustar a saliência do tubo de cerca de 2 mm no lado do parafuso de guia.
- Montar a câmara de fluxo no suporte da amostra de uma maneira que os orifícios da corrediça de vidro de quartzo combinar os fios no suporte da amostra. Apertarorifícios de entrada e de saída de parafusos com cuidado para garantir que a entrada e a saída da câmara de amostra são ainda penetrável. Suavemente aperte os quatro parafusos do suporte de vidro acrílico para fixar a posição da câmara de fluxo.
- tubagem cortada de silicone (0,58 mm ID, 0,96 mm de diâmetro externo) dentro de 20 centímetros de comprimento. Insira uma das peças para a entrada e o parafuso de saída da câmara de medição. Fechar o tubo de entrada e de saída, usando uma pinça.
NOTA: As câmaras de amostras montadas pode ser armazenado à temperatura ambiente até duas semanas.
3. smFRET de medição em TIRF Microscópio
- Usar uma seringa, para lavar a câmara de amostras com 500 uL de PBS. Impedir as bolhas de ar que entra na câmara de amostra em todos os momentos através da criação de uma gotícula no fim da tubagem de admissão antes de mudar para uma solução tampão diferente.
- Lave a câmara de amostras com 100 uL neutravidina solução (ml em PBS / 0,5 mg) e incubar 15 min a temperatura ambiente.
- lavara solução neutravidina com 500 ul de PBS.
- Parafuso do suporte do metal para o prisma para a câmara de amostra.
- Montar a câmara da amostra para a fase micrómetro da TIRF-microscópio. Certifique-se de montar a câmara de amostra horizontalmente o mais reto possível na frente da objectiva para evitar desfocagem durante o processo de digitalização.
- Inicie o software que controla as câmaras EM-CCD e o software para controlar os motores piezoeléctricos do palco.
- Ajuste o foco da objetiva do microscópio, olhando para os reflexos do laser de IR.
- Coloque o prisma (PS991, N = 1,52) na parte superior do suporte de prisma de metal. Ajustar a posição lateral do prisma para certificar-se de que os feixes de laser atingiu o prisma em seguida, utilizar um adesivo e incubar com luz UV durante 5 min.
NOTA: Prisma Montada pode ser reutilizado por limpeza. - No "Aquisição Setup" software de controle de câmera clique e definir os seguintes parâmetros de aquisição: 100 ms INTEGRATtempo ion, 401 frames / filmes (câmera verde), 400 quadros / filme (câmera vermelho), multiplicadores de elétrons ganham 225, pré-amplificador de 5x de ganho e de leitura taxa de 3 MHz a 14 bit.
- Crie uma pasta no disco rígido local para a medição. Escolha um nome desejado para os arquivos de medição, por exemplo, ano-mês-dia. No software configurações de ir para o "Auto-Save" cavaleiro, permitir "Auto save" e escolher o formato de arquivo * .sif para a aquisição filme. Selecione a pasta no disco rígido. Use o nome da pasta como filestem.
- Ativar o "AutoIncrement" (valor ajustado início a 1) função. Permitir a ligação de um operador para o nome do arquivo. Use "DON" e "ACC" para o doador e do canal receptor, respectivamente. Escolha "_" como separador.
- No software de controlo da câmara, clique no "Video" para iniciar a imagem ao vivo da câmera e fundo lixívia de fluorescência por digitalizar a câmara de amostra usando intensidade máxima do laser de todos os três lasers (COMcombinada ≈3,000 W / cm 2 para 10 s por campo de visão).
- Desligue o laser azul. Diminuir a intensidade do laser verde a cerca de 200 W / cm2 e cerca de 40 mW / cm 2 para o laser vermelho alternadas se excitação com laser (Alex) é usado.
- Dilui-se a amostra fluorescente biotinilado até uma concentração de 50-100 pM. Carga de 100 mL da solução. A amostra está imobilizada na superfície da câmara após ligação.
NOTA: Certifique-se de não sobrecarregar a câmara. moléculas vizinhas devem ser separados uns dos outros. - Se necessário, carregue um adicional de 100 ul de uma amostra 2x mais concentrado para a câmara.
- Veda-se o tubo de entrada e de saída da câmara de medição, utilizando grampos após o carregamento é concluído.
- Desligue todos os lasers e usar os piezo-motores para mover a câmara de fluxo dois campos de visão ainda mais.
- No software de controle de câmera clique em "Tome sinal" para iniciar a gravação do filme e alternarsobre o laser ao mesmo tempo. Assegure-se que mais de 80% das moléculas são branqueadas até ao final do filme ajustando a potência do laser.
- Repita os passos de 3,17 e 3,18 para a região câmara de amostra pré-branqueado todo.
4. Aquisição do Mapa de Transformação ( "beadmap")
- Preparar uma câmara de fluxo conforme descrito nas secções 1.1, 1.2 e 2.
- Use esferas multi-espectrais fluorescentes revestidas com avidina, que mostram a emissão de fluorescência do dador e do aceitador de canal. Vortex a lingua durante 1 min, depois dilui-se 50 ul de estoque em 50 mL ddH 2 O. Vortex novamente durante 1 min, sonicar 1-2 min, depois vortex mais 10 s.
- Realizar passos descritos para medições smFRET (Seção 3,5-3,10).
- Carga de 100 uL (1) o volume da câmara de as 1: 2 diluídas esferas fluorescentes para dentro da câmara de fluxo. Esperar 10 min para as pérolas fluorescentes para se ligar à superfície.
- Use os parâmetros de aquisição em 3,9, mas change duração do filme a 26 (câmera verde) e 25 (câmera vermelho) eo ganho de multiplicador de elétrons a 10.
- Definir a intensidade do laser verde para um valor de 20 W / cm2.
- Tome um filme em um campo de visão com aproximadamente 50-100 esferas.
5. Processamento e Análise de Dados smFRET
- Utilizar o costume escrito de FRET SM software para a análise da beadmap (ver Materiais e Métodos) e os filmes adquiridos. Inicie o programa viewPlot1.m.
- Clique em Análise | Análise Batch, desmarque a opção "Alex" se não tiver sido utilizado. Para um melhor desempenho escolher o limiar de pico descoberta "alta". Pressione OK".
- Escolha "Não" quando perguntado se um beadmap já foi analisado. Procure a pasta que contém o beadmap adquirida e selecione o arquivo .sif * (clicando duas vezes sobre ele). Na janela seguinte, prima diálogo "OK".
NOTA: Se um beadmap já analisou em uma medida anteriormento, escolha "SIM" aqui e selecione o beadmap salvas, navegando até a pasta correta e clicando duas vezes no arquivo * .map beadmap. Continue com o passo 5.8. - Escolha duas contas individuais posicionados em cantos opostos do campo de visão. As intensidades de pixel são-codificados por cores de azul escuro (baixa intensidade) ao vermelho escuro (alta intensidade).
- Clique no centro do primeiro cordão. Se o centro da molécula pode ser localizado de forma clara pela codificação de cores, escolha "SIM" ou então clique em "NÃO" e escolher um par molécula diferente.
- Posicionar o cursor sobre o pixel, mostrando a intensidade máxima e pressione "Keep". Repetir o processo com o segundo canal.
- Clique na molécula no canto oposto e repita os passos 5.5 e 5.6.
NOTA: O deslocamento de pixels relativa dos dois canais é exibida na janela de comando eo mapa de transformação é automaticamente salvo como arquivo * .map para a pasta que contém o beadmap * .sif arquivo <./ Li> - Para carregar os filmes doador e receptor (* .sif) para a "análise de lote", navegue até a pasta, selecione todos os filmes que serão analisados e clique em "OK". Na janela de diálogo seguinte, pressione "OK".
NOTA: A análise lote termina quando a última faixa exibida na janela de comando começa com "análise acabamento ...". As moléculas detectadas são exibidos em uma nova janela, o que também indica o desvio relativo do dador e aceitador do canal determinada a partir do mapa de transformação. - Para carregar os arquivos de filme em lote clique em File | Load. Desmarque a opção "Alex" se não tiver sido utilizado. Defina o smoothwidth a 10 e clique em "OK". Escolha a pasta que contém os arquivos * .ttr e clique em "selecionar tudo" e "OK" na próxima menu de contexto.
- Se o traço exibida apresenta as fases características smFRET (Figura 2) Pressione o botão de alternância "Não selecionado" e primeiroselecionar o ponto de tempo do início do evento FRET movendo a linha com o cursor do mouse e clicando no botão esquerdo do mouse. Próximo seleccionar o ponto de tempo do branqueamento da molécula receptora e, finalmente, o ponto de tempo do branqueamento da molécula dadora.
- Na janela seguinte, a eficiência FRET é representada em azul. Para selecionar a imprensa traço no botão "Sim", caso contrário escolha "Não". Para voltar a aceder a um traço do tempo, clique no botão "Anterior".
- Repita o procedimento até a última molécula do filme.
- Depois de analisar a última molécula em um filme salvar os traços selecionados, clicando em "Arquivo | Salvar". Salvar os traços selecionados na mesma pasta que os arquivos * .sif.
- Repita os passos de 5,10-5,13 para todos os filmes adquiridos.
- Execute o combine_fret_results.m programa. Selecione a pasta que contém os arquivos * res e todos os arquivos * .FRETonly_trace. Salve os arquivos FRET FRET e quadro-wise molécula-wise como MW.dat eFRW.dat, respectivamente.
NOTA: Os arquivos * .dat são salvos como arquivos ASCII. O arquivo FRW.dat contém seis colunas e uma linha para cada FRET-frame. A sexta coluna contém a eficiência FRET frame-sábio corrigido. O arquivo MW.dat contém 21 colunas e uma linha por molécula FRET selecionado. A terceira coluna contém a eficiência FRET molécula-wise.
6. Resultados smFRET dados em histogramas
NOTA: Para extrair a eficiência smFRET média de todos os dados smFRET gravados os dados do quadro-wise ou os dados molécula-wise são plotados em histogramas e analisados usando Gaussian cabe (múltiplos) picos. No que se segue, o protocolo usa um software de análise de dados comercial (ver Lista de Materiais). No entanto, qualquer outro software disponível pode ser usado em substituição.
- Abra um software de análise de dados (veja a Lista de Materiais). Clique em File | Import | ASCII múltipla. Selecione a pasta que contém o arquivo FRW.dat. Selecione o arquivo e pressione "OK & #34 ;. Aceite a opção de entrada com "OK" sem uma mudança.
- Escolha a terceira coluna C (Y) contendo as eficiências FRET corrigidos, clique com o botão direito na coluna e selecione Plot | Estatísticas | Histograma. Na janela do histograma, clique duas vezes nas colunas e desmarque "binning automática" e selecione um escaninho de tamanho desejado, por exemplo, 0,05. Também escolher os valores inicial e final, por exemplo, -0,025 e 1,025.
- Selecione as colunas do histograma clicando com o botão esquerdo sobre eles. Em seguida, clique com o botão direito e escolha "ir para Bin Planilha". Selecione a coluna "conta" clicando com o botão esquerdo sobre ele e, em seguida, clique com o botão direito e selecione Plot | Coluna / Bar / Pie | Coluna.
- Na trama bar coluna ir para Análise | Montagem | Nonlinear ajuste de curva | diálogo Abrir. Escolha "Gaussian" em função, em seguida, ir para o piloto "Parâmetro". Desmarque auto parâmetro de inicialização. Corrigir o valor do deslocamento (y0) em 0. Clique em "Ajustar".
NOTA: A função de ajuste, bem como o de montagemcaudas são agora apresentados na trama coluna. O valor "xc" indica o centro da função de ajuste, ou seja, a média da eficiência de FRET, que serve como o parâmetro de entrada para o software NPS.
7. A medição do rendimento quântico
- Executar a determinação do rendimento quântico com o método relativa semelhante à do procedimento descrito por Würth et ai. 35, usando rodamina 101 dissolvido em etanol (QY = 91,5%) como um padrão.
- Gravar os espectros de absorção a um espectrómetro de UV-VIS, utilizando um volume de 80 mL numa cuvete de absorção de comprimento de percurso de 1 cm. A absorvância no comprimento de onda que vai ser usada para excitação de fluorescência tem de ser igual ou inferior a 0,05.
- espectros de emissão registro em um espectrômetro de calibrado-lamp operado em modo de fóton-contagem. Realizar as medições com polarizadores Glan-Thompson na excitação (0 °) e emissão (54,7 °) caminho (condições ângulo mágico), utilizando um spectr ai largura de banda de cerca de 5 nm e 2,5 nm para a excitação e emissão monocromador, respectivamente. Medir amostras depois transferi-los para uma tina de fluorescência com 3 milímetros de comprimento caminho cuidar que a taxa de contagem não exceda 10 6 s -1.
- Calcular o rendimento quântico de acordo com a
em que n e n STD são os índices de refracção do solvente da amostra e o padrão, respectivamente. f (λ) e f_Std (λ) são as intensidades de fluorescência da amostra e do padrão no λ comprimento de onda. Um (λ ex) e um std (λ ex) são a absorvância da amostra de referência e no comprimento de onda de excitação e Φ STD é o rendimento quântico do padrão.
le "> 8. Cálculo do Isotrópica Förster Radius- Calcular o raio isotrópico Förster (
) A partir do espectro de emissão da molécula dadora, o espectro de absorção da molécula receptora, o rendimento quântico do dador e o índice de refracção do meio. Use o PhotochemCAD freeware para o cálculo do . No entanto, qualquer outro software disponível pode ser usado em vez de 36.
) A partir do espectro de emissão da molécula dadora, o espectro de absorção da molécula receptora, o rendimento quântico do dador e o índice de refracção do meio. Use o PhotochemCAD freeware para o cálculo do 9. A medição das anisotropias
- Determinar anisotropias de fluorescência em estado estacionário de gravações de espectros de fluorescência com várias configurações polarizador de excitação / emissão (v / v, V / H, H / V, H / H) 36.
- Calcular a-fator G, que corrige para artefactos polarização do instrumento, para cada comprimento de onda dorelação
e usá-lo para calcular o valor de anisotropia para cada comprimento de onda:
onde eu xy indica a intensidade de excitação polarização x e polarização emissão y.
- Calcular a média dos valores em toda a gama espectral de emissão de fluorescência para calcular a anisotropia do estado estacionário.
10. Instalação de Software Fast-NPS
- Baixar UCSF Chimera de http://www.cgl.ucsf.edu/chimera e seguir o guia de instalação.
- Ir para o site do "Instituto de Biofísica"em Ulm University: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Baixe a versão atual do Fast-NPS e extraí-lo para uma pasta de escolha. Abra a subpasta "Redistributable" e instale o ++ Redistributable Visual C, que é apropriado para o sistema.
11. Centrar o arquivo PDB
- Abra o arquivo pdb (s) de interesse em Chimera. Selecione todos os átomos do complexo macromolecular e calcular as coordenadas do centróide (Ferramentas | Análise de estrutura | Eixos / Planos / Centróides | Definir centróide ... | Ok).
- Abra o Log Responder (Favoritos | Responder Log) e da Ferramenta de Transformação (Ferramentas | Movimento | transformar as coordenadas). Introduzir as coordenadas do centróide mostrado na resposta Log na caixa de texto "Shift" da janela de transformar as coordenadas e mudar o sinal de todas as coordenadas. Pressione o botão "Aplicar" e salve o arquivo com "Save PDB" (Arquivo | Salvar PDB).
12. Definiçãoos priores Posição
NOTA: Todos os valores são considerados na angstrom.
- Inicie a linguagem de computação técnica e alterar a pasta actual para a pasta Fast-NPS local. Digite na janela de comando: FastNPS.
- Criar um novo jobfile no Project Manager (Project | New).
- Configurar a posição anterior (Ferramentas | corante modelo anterior).
- No painel "fundamentos anteriores" definir a resolução espacial da posição anterior, digitando seu valor (2 é recomendado).
- Excluir o interior da macromolécula, ativando a caixa de seleção e clicar no botão "load PDB". Selecionar e carregar o arquivo PDB centrado conforme descrito na Seção 11.
- Especifique o diâmetro aproximado (13 Å é recomendado, ver discussão) do corante, digitando o seu valor.
- Introduzir uma distância esqueletonização, ou seja, a distância que a molécula de corante pode penetrar na macromolécula (2 A é recomendado).
- Nopainel de "tamanho máximo antes" introduzir as coordenadas mínimas e máximas da posição anterior (recomendado: x em [-150.150], y em [-150.150] e z em [-150.150]).
- Ao definir um satélite, ative a opção "anexo via ligante flexível" no painel "fundamentos anteriores" e entrar no painel "ligador" as coordenadas do átomo (no arquivo pdb centrado) na qual a molécula do corante é anexado. Além disso, especificar o comprimento e o diâmetro do ligante ao introduzir os valores (13-A e 4,5 A são recomendados, ver discussão). Em caso de uma antena ignorar este ponto.
- Pressione o botão "calcular o volume acessível".
- Salvar a posição anterior e, opcionalmente, exportá-lo para fins de visualização utilizando o software como Chimera.
13. Definir a geometria da rede
- Abra a janela Definir Medição (Modo | Edit Geometry).
- Criar uma nova molécula do corante pressionando o bumbumem "New" no "Corantes" do painel.
- Defina sua anisotropia de fluorescência (Seção 9) inserindo um valor e selecione um modelo de corante dentro do menu suspenso "modelo Dye".
- Pressione o botão "Load", selecione a posição correspondente antes e marque a caixa de seleção Ativar do corante. Repetir este procedimento para todas as tintas, isto é, para todas as antenas, bem como para todos os satélites.
- Depois de criar todos os corantes, definir as medições. Criar uma nova medição, clicando em "New" no "Medições" do painel.
- Selecione seus parceiros FRET nos menus suspensos "Dye1" e "Dye2" abaixo.
- Digite a eficiência smFRET com o erro e do raio Förster isotrópico deste par corante.
- Por fim, marque a caixa de seleção Ativar da medição. Repita este procedimento para todas as medições.
NOTA: Muitas vezes a rede se torna cada vez mais complexo, de modo que o usuário pode ficar confuso. A fim de Prevent erros, verifique a rede visualmente, premindo o botão "Verificar rede". A figura mostra as tinturas activados e indica as medições por meio de linhas que interligam os corantes FRET.
14. Cálculo
- Abra a janela de cálculo (Modo | Cálculo).
- Se cada corante na rede tem um modelo específico atribuído, selecione "Definido pelo usuário" e iniciar o cálculo pressionando "Cálculo". Para ter todos os corantes no mesmo modelo, selecione um dos cinco modelos (clássico, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso e var-meanpos) e continuar.
NOTA: A janela de comando irá indicar o progresso do cálculo. Fast-NPS vai fazê-lo com uma mensagem pop-up, quando o cálculo tiver sido concluída.
15. Visualização de resultados
- A fim de exportar os volumes credíveis dos corantes, abra a visualização Janela de Resultados (Modelo | Ver Resultados).
- densidades de corante de exportação:
- Exportarcorantes isoladamente ou todos ao mesmo tempo. Para exportar um único corante selecione-o no painel "Corantes exibida" e pressione "Densidade Export". Digite uma resolução (2 é recomendado) e escolha um tipo de arquivo para exportação. À direita a densidade é visualizado e algumas de suas características matemáticas são mostradas.
- Para exportar todos os corantes simultaneamente empurrar "Batch Export".
- Abra os arquivos de densidade, resultando em quimera.
16. Verificação de consistência de Chosen Modelo Combinação
- Abra a visualização Janela de Resultados (Modelo | Ver Resultados). Se no painel "Informações de cálculo", a caixa de texto "Consistência" apresenta um valor inferior a 90% o modelo atual não representa as eficiências smFRET medidos suficiente e é, portanto, inconsistente.
- No caso de inconsistência apertar o botão "Consistência detalhada". Procurar as medições que têm um valor abaixo de 90%. Se um ou mais de corantes são predominantemente envolvidos nestas medições, seus modelos são susceptíveis de causar a inconsistência. Considerar diferentes modelos de corante para estes corantes e execute novamente o cálculo Fast-NPS.
Representative Results
A transcrição é o primeiro passo para a expressão do gene em todos os organismos. Em Archaea, a transcrição é efectuada por um único RNA polimerase (RNAP). Em comparação com eucariontes, o RNAP archaeal tem uma semelhança estrutural marcante com os seus homólogos eucariotas ao ter uma maquinaria transcricional mais simples. Assim, Archaea pode ser usado como um sistema modelo para o estudo de iniciação da transcrição eucariótica pela RNA polimerase II (pol II). Recentemente, a arquitetura completa do complexo aberto archaeal RNA polimerase foi determinada a partir de uma única molécula de FRET e NPS. Os dados da análise NPS foi usado para construir um modelo do complexo promotor completa archaeal aberta, que fornece informações úteis sobre o mecanismo de iniciação da transcrição.
Para elucidar esta estrutura, a eficiência smFRET foram medidos entre moléculas de corante antena desconhecidos localizados dentro do promotor com abertasplex e várias moléculas de corante por satélite conhecidos que foram incorporadas em cinco locais de referência na RNAP, cujas posições são conhecidas a partir de estruturas cristalográficas (APO-ID: 2WAQ) 37. Os corantes de antena foram ligados a qualquer uma das posições diferentes no DNA não-molde, de TFB, TBP ou TFE. A rede completa utilizada neste estudo consistiu em mais do que 60 distâncias medidas.
A Figura 7 representa o modelo do complexo aberto promotor arquea completa construída a partir da análise de NPS. É composto pelo promotor de cadeia dupla de DNA (claro e azul escuro), a RNA polimerase (cinza) eo início fatores de transcrição TBP (roxo), TFB (verde) e TFE (amarelo). O modelo é sobreposta com os resultados da análise de NPS, os volumes credíveis, que foram calculados usando o modelo clássico (A), o modelo ISO (B), o modelo meanpos-iso (C), o modelo de var-meanpos-iso (D) e VAR-meanpos modelo (E).
Figura 1: Fluxo de trabalho da aquisição e processamento dos parâmetros necessários para o cálculo Fast-NPS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de intensidade de fluorescência traço do tempo de um evento smFRET. As intensidades de fluorescência do dador (verde) e a molécula receptora (vermelho) que mostra as três fases características, nomeadamente i: smFRET, II: doador de fluorescência após a fotodegradação aceitador, III: fundo de fluorescência após a fotodegradação dador.g2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação esquemática da câmara de fluxo para experiências smFRET. A câmara de fluxo é montado em um suporte de metal personalizado com suportes de vidro acrílico. A sanduíche de concepção da câmara de fluxo compreende um vidro de quartzo (sílica fundida) deslize com dois furos para a fixação de tubos de entrada e saída, um filme de selagem e uma lamela que fecha a câmara de fluxo. O prisma para TIRF iluminação é montado na metade inferior da câmara de fluxo. parafusos guia ocos fornecer a entrada e saídas para a câmara de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Preparação da lâmina de vidro de quartzo e a película selante. Desenho mecânico da lâmina de vidro de quartzo, indicando as posições dos furos (dada em milímetros). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Desenho mecânico da câmara de fluxo. As medidas de suporte de prisma do alumínio, acrílico suportes de vidro e estrutura de montagem de alumínio são dadas em milímetros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
igura 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/>
Figura 6: Ilustração esquemática da configuração TIRF tipo prisma usado para experimentos smFRET. Abreviaturas para componentes ópticos: A, abertura; DM, espelho dicróico; F, filtro de emissão; G, lente; M, espelho; O, objetiva; P, prisma; PSD, a posição sensível de foto-diodos; S, amostra; PS, estágio posicionamento; T, telescópio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Os resultados da simulação das diferentes suposições do modelo. Todas as imagens mostram a RNA polimerase archaeal (PDB-ID: 2WAQ, vista de cima), juntamente com o modelo de promotor de DNA (DNAt e ntDNA em azul e ciano, respectivamente), TBP (roxo), TFB (verde) e TFE (amarelo)na archaeal abrir complexa 30. Os volumes credíveis são sobrepostas para os resultados da simulação NPS de (A) o modelo clássico, (B) o modelo iso, (C) o modelo meanpos-iso, (D) o modelo VAR-meanpos-iso e (E) do var -meanpos modelo. Todos os volumes são mostrados em 68% credibilidade. O clássico e as redes var-meanpos são consistentes com os dados smFRET. Em contraste, as redes em que para todos os corantes é escolhido o iso, meanpos-iso ou o modelo VAR-meanpos-iso são incompatíveis com os dados medidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Apresenta-se o procedimento de instalação e experimental para determinar com precisão a eficiência FRET entre corantes ligados através de elementos de ligação flexíveis a biomacromoléculas, ou seja, ácidos nucleicos e / ou proteínas.
A fim de assegurar medições precisas smFRET (secção 3), que é fundamental para excluir o ar da câmara de fluxo em qualquer momento durante a medição. Além disso, certifique-se de não sobrecarregar a câmara de fluxo com fluoróforos. Os fluoróforos devem ser claramente separadas para garantir a análise correta. Como pares smFRET, que não apresentam branqueamento do doador tem que ser excluídos da análise, certifique-se de que> 80% das moléculas no campo de visão são branqueados no final do filme. Para ter em conta não homogeneidades na amostra do factor-β e o factor γ, corrigindo os cross-talk e relativas eficiências de detecção do canal de dador e aceitador, respectivamente, são calculados para cada par de FRET individualmente.
Para as medições sobre o espectrômetro de fluorescência (Secções 7 a 9) um bom compromisso entre a intensidade do sinal ea resolução espectral dos dados gravados tem de ser encontrada. Para este efeito, as fendas na via de excitação e emissão do espectrómetro de fluorescência têm de ser adaptados dependendo do instrumento usado e a concentração da amostra.
Além disso, apresentamos o método de análise Fast-NPS para obter informações estrutural da MACROM transitória ou dinâmicocomplexos olecular. NPS foi aplicado para revelar o caminho do filamento de DNA não-molde e a posição dos factores de iniciação de transcrição no complexo aberta de ARN-polimerase de archaea. Usando a rede de mais de 60 medições de distâncias diferentes, mostramos que a Fast-NPS, equipado com um motor de amostragem recém-implementado (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. em preparação), reduz o tempo necessário para a análise desta rede smFRET complexo por ≈2 ordens de grandeza, em comparação com o método de NPS global original 27. a robustez do algoritmo está enraizada em um sampler Metropolis-dentro-Gibbs combinada com um esquema de têmpera paralelo. Fast-NPS mostra reprodutibilidade exata dos resultados da rede e é consistente com os resultados publicados anteriormente 30.
Vários métodos diferentes foram publicados com o objetivo de inferir informações estruturais a partir de medições smFRET 11 up>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Todas estas abordagens fornecem apenas um modelo de corante específico. Assim, corantes, que não cumprem as suposições feitas pelo respectivo modelo, não pode ser usado ou levar a informações estruturais falsa. Fast-NPS, pelo contrário, permite seleccionar para cada molécula de corante de um modelo diferente. Isto ajuda a explicar diferente comportamento conformacional de ambas, a molécula de corante em si, bem como o ligante utilizado para a sua fixação. Os arredores moleculares locais da molécula do corante, bem como as suas propriedades físicas vai determinar qual o modelo que é mais adequada.
Para a rede smFRET analisados do complexo de iniciação de archaea, um pressuposto isotrópica para todas as moléculas de corante conduz a uma diminuição drástica in o tamanho dos volumes credíveis, em comparação com o modelo clássico. Em combinação com uma dinâmica posição média para todas as moléculas de corante da mediana de todos os tamanhos de volume credíveis (a 95%) reduz-se a menos de 0,5 Nm 3. No entanto, estes traseiros molécula corante já não são consistentes com suas medidas smFRET, indicando que as suposições feitas levam a informação estrutural falsa. Em contraste, os posteriores determinados no modelo clássico são consistentes com as eficiências smFRET determinados.
Como o pressuposto de posição isotrópico e / ou dinâmico de uma média de todos os corantes levar a inconsistências, Fast-NPS permite antecedentes molécula do corante em que cada corante pode ser atribuída uma das cinco modelos. Cada modelo usa o mesmo volume acessível. O algoritmo para o cálculo dos AVs corante faz várias suposições. Na primeira, forma espacial do fluoróforo é aproximada por uma esfera. Assim, um diâmetro tendo em conta wid do fluoróforoth, altura e espessura deve ser utilizado (Seção 12). Além disso, a forma do ligante é aproximada por uma haste flexível. Os valores apresentados na Secção 12, foram calculados para o corante Alexa 647 ligado por via de um ligante de 12-C. Até à data, não é possível determinar com exactidão, a priori, qual o modelo mais adequado, dada a geometria experimental, e, portanto, todos os modelos devem ser testados. Em geral, uma irá escolher o modelo que dá o menor tamanho possível posterior, enquanto continua a ser consistente com os dados. Para testar se uma escolha de modelos é consistente com os dados smFRET, calcula-se tanto a parte posterior e a probabilidade. Consistência significa que mais de 90% das amostras recolhidas a partir da posterior estão dentro do intervalo de confiança de 95% da probabilidade.
Embora seja verdade que quanto menor a anisotropia, quanto menor for a distância incerteza, numa rede smFRET disposições geométricas das moléculas de corante também tem que ser tida em conta. Assim, enquanto Representing moléculas de corante com uma baixa anisotropia de fluorescência com um modelo de iso é uma primeira escolha típica, o teste de consistência fornece um meio mais diretas para a escolha do modelo de corante correta. A escolha óptima de modelos de corante podem conduzir a um aumento drástico na precisão de localização e, ao mesmo tempo, manter a consistência da rede com os seus dados de FRET.
Para resumir, Fast-NPS permite obter informações sobre a estrutura e dinâmica dos grandes complexos macromoleculares. Em contraste com os métodos estruturais comuns, tais como cristalografia de raios-X ou microscopia electrónica de crio este permite o monitoramento complexos altamente flexíveis ou transientes, assim aumentando grandemente o nosso entendimento mecanicista de processos biológicos complexos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowchamber preparation | |||
| Customized metall sample holder | self-built | n/a | |
| quartz-glass slides, 76 mm x 26 mm | Technical Glass Products | 26007 | |
| coverslips, 60 mm x 24 mm | Marienfeld | 101242 | |
| detergent, Hellmanex II | Hellma | 320.001 | |
| ultra-pure water from Synergy UV | Millipore | 2512600 | |
| Zepto plasma cleaner | Diener | n/a | |
| (3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | |
| biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | BIOTIN-PEG-SVA-5000 | |
| Sodium biocarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 Sigma | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S2127 Sigma-Aldrich | |
| sealing film (Nescofilm) | Fisher Scientific | 12981805 | |
| Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD | Saint-Gobain Performance Plastics | 720958 | |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) | Fisher Scientific | 12665497 | |
| Neutravidin | Life Technologies | A2666 | |
| Total internal reflection fluorescence microscope | |||
| Nd:YAG Laser, 532 nm | Newport Spectra-Physics | EXLSR-532-100-CDRH | |
| diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso | Cobolt | 904010050 | |
| diode laser 643 nm, iBeam smart | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | |
| dichroic mirror, 532 RDC | Chroma | F33-540 | |
| dichroic mirror, 476 RDC | Chroma | F33-476z | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic | AOTFnC-VIS | |
| plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm | Thorlabs | LJ1703L1-A | |
| plano-concave cylindrical, f = -300 mm | Thorlabs | ||
| prism, PS 991 | Thorlabs | PS991 | |
| focusing lens, f = 75 mm | Thorlabs | LA1608-B | |
| syringe pump, PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2002 | |
| 2 stepper motors, Z812B | Thorlabs | Z812B | |
| piezoelectric actuator, PE4 | Thorlabs | PE4 | |
| IR diode laser | Edmund Optics | CPS808 | part of the autofocus system |
| dichroic mirror, 775 DCXR | Chroma | 775 DCXR | |
| position-sensing detector (PSD), PDP90A | Thorlabs | PDP90A | part of the autofocus system |
| water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 | Nikon | MRD07601 | |
| dichroic mirror, 645 DCXR | Chroma | 645 DCXR | part of the emission pathway |
| emission filter, 3RD550-510 | Omega Optical | 3RD550-510 | green channel in the emission pathway |
| emission filter, 3RD660-760 | Omega Optical | 3RD660-760 | red channel in the emission pathway |
| EMCCD camera, iXon+ DU897EBV | Andor | AND-20-00032 | |
| EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV | Andor | AND-20-000141 | |
| Miscellaneous | |||
| Varian 50 | Cary | UV-VIS spectrometer | |
| Fluorolog2 | SPEX | fluorescence spectrometer | |
| Solis (V4.15) | Andor | control software for the EM-CCD camera | |
| Apt user utility (V1.022) | Thorlabs | control software for the piezo-motors | |
| Norland Optical Adhesive 68 | Thorlabs | adhesive | |
| PC-AFN-0.8 Nile red | Kisker Biotech | avidin-coated fluorescent multispec beads | |
| Matlab | Mathworks | technical computing language for custon written software | |
| Origin (V9.0) | Originlab | scientific graphing and data analysis software | |
| Hellma 105-202-15-40 | Hellma | 105-202-15-40 | absorption cuvette of 1 cm path length |
| Hellma 105-251-15-40 | Hellma | 105-251-15-40 | fluorescence cuvette with 3 mm path length |
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