We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.
Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.
Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.
Bestemmelse af strukturen af et biomolekyle er en vigtig forudsætning for at forstå dens funktion. To veletablerede fremgangsmåder til strukturbestemmelse er cryo-elektronmikroskopi og røntgenkrystallografi 1, 2. I dag begge metoder giver høj opløsning strukturel information med en opløsning ned til ångstrøm niveau. Disse to metoder er blevet anvendt i vid udstrækning til at klarlægge strukturen af store biomolekyler såsom proteinkomplekser. Selvom de eksisterende metoder til stadighed er blevet forbedret gennem de seneste årtier, kompleksiteten af biologiske strukturer udgør stadig en stor udfordring for strukturel biologi, især når store, dynamiske og transiente komplekser undersøges 3.
For at studere dynamikken af makromolekylære komplekser og strukturen-funktionen forholdet navnlig enkelt-molekyle metoder har provided nyttige oplysninger 4. Flere nye strategier blev udviklet giver et ortogonalt tilgang til at erhverve strukturel og dynamisk information. Eksempler er højhastigheds AFM 5, mekanisk manipulation 6, fluorescens lokalisering mikroskopi 7, samt enkelt-molekyle Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) 8, 9. Siden ret tidligt FRET er blevet betegnet en molekylær lineal, på grund af afstanden afhængighed af længden omfanget af biomakromolekyler 10.
En særlig interessant anvendelse af smFRET er at bruge oplysningerne afstand indhentet fra smFRET målinger for at udlede strukturel information 11, 12, 13, 14, 15 </sup>, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. På grund af den høje tidsopløsning smFRET kan positionen af mobile dele af en proteinstruktur lokaliseres. Men for at udtrække kvantitative oplysninger fra smFRET data vigtige korrektion parametre om farvestofmolekyler skal fastlægges under målingen 24. Med disse korrektionsfaktorer kan FRET effektivitet E FRET beregnes ved hjælp af formlen
,
hvor jeg A og I D </sub> er fluorescensintensiteterne af donor og acceptor-molekylet, henholdsvis (se figur 2). Den β-faktor udgør krydstale, udsivning af donor emission til acceptoren kanalen og beregnes ved
hvor jeg A og jeg D fluorescensintensiteterne af donoren og acceptor-molekylet efter foto blegning af acceptor-molekylet.
Den γ-faktor korrigerer forskellen i de relative detektionseffetiviteter i de to kanaler samt forskellene i fluorescenskvantumudbytte af donoren og acceptoren farvestof. Det er beregnet ud fra hver enkelt gang spor af
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" fo:text-align="center" style = "text-align: center;">Bemærk, at denne beskrivelse negligerer direkte excitation af acceptoren molekyle, som undertiden bliver vigtigt og skulle korrigeres for så godt. Til bestemmelse Disse korrektionsfaktorer er det nyttigt at excitere både donor og acceptoren i en alternerende skema 25 for at skelne mellem foto-fysiske forandringer og strukturelle dynamik.
For ikke blot opnå kvantitative smFRET effektivitet, men også kvantitativ strukturel information, blev Nano-Positioning System (NPS) indført i 2008 26. Navnet blev valgt ud fra sine ligheder med det satellitbaserede Global Positioning System (GPS). NPS er en hybrid teknik kombinerer smFRET og røntgenkrystallografi data til lokalisering af ukendte farvestof positioner i biomacromolecular komplekser. crystal struktur tjener som reference rammen og smFRET Resultaterne anvendes til at opnå afstanden information mellem et ukendt fluorofor position (antenne) og en position, kendt fra krystalstrukturen (satellit). I konsekutive eksperimenter afstandene mellem antennen og flere satellitter måles og positionen af antennen bestemmes ved hjælp af en statistisk stringent analyse, der er baseret på Bayes parameter estimation. Som følge heraf er ikke kun den mest sandsynlige position af antennen beregnet, men dens fuldstændige 3D usikkerhed distribution, den såkaldte posterior, visualiseret ved troværdige volumener. Desuden NPS blev udvidet til at muliggøre analysen af komplette smFRET net 27.
NPS er blevet anvendt til at løse en række vigtige spørgsmål i eukaryot transkription, nemlig under den opstrøms DNA, ikke-template-DNA og det spirende mRNA i RNA-polymerase II forlængelse complex 12, 28, også viser virkningen af transkriptionsinitiering faktorer 26 og den dynamiske arkitektur af en åben-promotor-kompleks 29. Desuden blev NPS anvendt til at klarlægge strukturen af arke RNA Polymerase åben kompleks 30 og navnlig placeringen af transkriptionsinitiering faktor TFE, som binder kompetitivt til samme sted som transskription elongeringsfaktor Spt4 / 5 31.
Siden da har en række smFRET baserede strukturelle tilgange blevet offentliggjort 15, 18, 21, 23. Når man sammenligner forskellige smFRET baserede strukturelle metoder, bliver det klart, at den tilsyneladende nøjagtighed af metoden er meget afhængig af den særlige valg af farvestof modeller. Man bør bemærke, atfarvemolekyler kan udvise forskellige rumlige og orienteringshjælp adfærd afhængigt af deres lokale miljø.
Til dette formål blev Fast-NPS introduceret 32. Fast-NPS anvender en avanceret prøveudtagning algoritme reducere beregningsmetoder tider drastisk. Endvidere Fast-NPS tillader en at udføre en strukturel analyse og for hver farvestofmolekyle brugeren kan vælge fra et sæt af fem forskellige farvestof modeller, som vil blive beskrevet i det følgende. De mest konservative model, kaldet klassisk, ud fra, at farvestoffet kun optager én, men ukendt, position. På denne position kan fluoroforen rotere frit inden for en kegle, hvis størrelse er bestemt ud fra dens respektive (tidsafhængig) fluorescensanisotropi. Orienteringen af keglen er ikke kendt, hvilket fører til stor usikkerhed ved konvertering målte smFRET effektiviteter i afstande. I denne henseende er modellen konservativ, da det vil føre til den mindste præcision i forhold til den anden farvestof tilstandls. Kun for meget korte afstande bør de forudsætninger, som den klassiske model føre til en mærkbart forkert positionsbestemmelse. For typiske smFRET værdier, er den korrekte position altid indesluttet i forholdsvis store troværdige volumen.
Men da en højere præcision er ønskelig, er det vigtigt at udvikle og afprøve alternative farvestof modeller, som kan bidrage til at forbedre præcisionen. Hvis farvestoffet roterer meget hurtigere end dets iboende fluorescens levetid, kan den såkaldte iso modellen anvendes. Her orientering faktoren K 2 (nødvendig til beregning af den karakteristiske isotrope Förster radius ) Er indstillet til 2/3. Som følge heraf er de beregnede troværdige volumener næsten to størrelsesordener mindre sammenlignet med dem i den klassiske model 32. I tilfælde af at fluoroforen er fundet i et miljø, der muliggør ikke kun hurtig reorientation, men derudover hurtige bevægelser over hele dens tilgængelige volumen, bør anvendes meanpos-iso-model. I denne model farvestoffet effektivt optager kun én middelværdi position, hvor udgjorde den rumlige midling af et polynomium afstand konvertering 15. Denne model gælder hvis for eksempel (almindeligvis hydrofobe) farvestof er bundet til en hydrofil region, fx DNA'et. Anvendelse af meanpos-iso-modellen fører til en yderligere reduktion i størrelsen af de troværdige volumener med en faktor på ca. to. et farvestof bundet til et protein, kan dog bindes reversibelt til flere hydrofobe pletter i sin sterisk tilgængelige volumen (AV). En fluoroforen der øjeblikkeligt skifter mellem disse regioner, men inden for en region gennemgår fri rotation og hurtigt lokaliseret bevægelse kan bedst beskrives som VAR-meanpos-iso-model. For en lignende situation, hvor farvestoffet er ikke fri til at rotere VAR-meanpos model gælder. mere d etails om disse modeller kan findes i vores seneste publikation 32.
Disse modeller giver et omfattende repertoire til specifikt redegøre for de forskellige miljøer et farvestof kan komme ud og anvende dem med omtanke optimerer dens lokalisering præcision. I Fast-NPS hver farvestof molekyle bundet til en bestemt position kan henføres til en enkelt model, således at FRET-partnere får lov til at have forskellige modeller. Dette gør det muligt grænseløs og tæt på naturen modellering. Det er imidlertid vigtigt, at man gennemfører krævende statistiske tests for at sikre, at den er opnået ved den endelige model kombination resultatet stadig indforstået med eksperimentelle data. Disse test er inkluderet i Fast-NPS software.
For at anvende Fast-NPS til eksperimentelle data der kræves måling af (kun) tre inputparametre. Først farvestoffet-pair specifik isotrope Förster radier (/54782/54782eq5.jpg "/>) Skal bestemmes. Derfor kvantumsudbyttet (QY) af donorfarvestoffet, donor fluorescensemissionsspektrer og acceptoren absorptionsspektre skal måles. Disse målinger kan udføres i bulk, ved anvendelse af en standard spektrometer og en standard fluorescens spektrometer. for hvert par er Re 0 derefter beregnet ved hjælp af freeware PhotochemCAD og kan anvendes i NPS analyse. Desuden er de (tidsopløst) fluorescens anisotropier af farvestofmolekyler brug skal opnås ved anvendelse af en polarisering (og tid) følsom fluorescens spektrometer. Men de vigtigste inputparametre for Fast-NPS er smFRET effektiviteter målt på et enkeltstrenget molekyle fluorescensmikroskopi setup, såsom en total indre refleksion fluorescens mikroskop (TIRFM) .
Her præsenteres en trin-for-trin-protokol til at opnå smFRET data og anvende Fast-NPS (figur 1).
Vi præsenterer den procedure setup og eksperimenterende til præcist at bestemme FRET effektivitet mellem farvestoffer knyttet via fleksible linkere til biomakromolekyler, dvs, nukleinsyrer og / eller proteiner.
For at sikre præcise smFRET målinger (Afsnit 3), er det afgørende at udelukke luft fra strømmen kammeret på ethvert tidspunkt under målingen. Desuden skal du sørge for ikke at overbelaste flow kammer med fluoroforer. De fluoroforer skal være klart adskilt for at sikre korrekt analyse. Som smFRET par, der ikke viser blegning af donoren skal udelukkes fra analysen, skal du sørge for, at> 80% af molekylerne i synsfeltet bleges i slutningen af filmen. At tage højde for inhomogeniteter i stikprøven den β-faktor og γ-faktor, korrigere de cross-talk og relative detektionseffetiviteter af donoren og acceptoren kanal henholdsvis beregnes for hver FRET-par individuelt.
<p class= "Jove_content"> indstillinger kameraet (integration tid, elektron multiplikator gain, forforstærker gain og udlæsning sats beskrevet i afsnit 3.9) skal indstilles til værdier giver den bedste afvejning mellem signal støjforhold, dynamikområde og tid-opløsning. De skal være re-justeret for forskellige eksperimenter, eller hvis forskellige hardware bruges. Antallet af rammer skal være høj nok til at sikre, at det meste af donormolekylerne blegemiddel i observationstiden.Ved målinger på fluorescens spektrometer (§§ 7 til 9) et godt kompromis mellem signalet intensiteten og den spektrale opløsning af de registrerede data skal findes. Til dette formål slidserne i excitation og emission pathway af fluorescensen spektrometer skal tilpasses afhængig af det anvendte instrument og koncentrationen prøven.
Desuden præsenterer vi Fast-NPS analyse metode til at opnå strukturel information af forbigående eller dynamisk MACROMolecular komplekser. NPS er blevet anvendt til at afsløre banen for den ikke-template-DNA-strengen og positionen af transkription initieringsfaktorer i arke RNA-polymerase åben kompleks. Brug af netværk af mere end 60 forskellige afstandsmålinger, viste vi, at Fast-NPS, udstyret med en nyligt gennemført prøveudtagning motor (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. under udarbejdelse), reducerer den nødvendige tid til analyse af denne komplekse smFRET netværk ved ≈2 størrelsesordener, i forhold til den oprindelige globale NPS metode 27. Algoritmen robusthed er rodfæstet i en Metropolis-inden-Gibbs sampler kombineret med en parallel hærdning ordning. Fast-NPS viser nøjagtig reproducerbarhed af net resultater og er i overensstemmelse med resultater tidligere 30 offentliggjorte.
Flere forskellige metoder er blevet offentliggjort til formål at udlede strukturel information fra smFRET målinger 11 </sop>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Alle disse metoder giver kun én bestemt farvestof model. Således farvestoffer, der ikke opfylder de forudsætninger, som den respektive model, kan ikke bruges, eller føre til falske strukturel information. Fast-NPS, tværtimod tillader udvælgelse for hver farvestofmolekyle en anden model. Dette bidrager til at forklare forskellige konformationel opførsel af begge, farvestofmolekylet selv, samt linkeren anvendes til dets fastgørelse. De lokale molekylære omgivelser af farvestofmolekylet, samt dets fysiske egenskaber vil bestemme, hvilken model er mest hensigtsmæssig.
For det analyserede smFRET netværk af arke initieringskompleks, en isotropisk antagelse for alle farvestofmolekyler fører til en drastisk reduktion in størrelse troværdige volumener i forhold til den klassiske model. I kombination med en dynamisk position gennemsnit for alle farvestofmolekyler medianen af alle troværdige volumenstørrelser (ved 95%) reducerer til mindre end 0,5 nm 3. Men disse farvestof molekyle posteriors ikke længere stemmer overens med deres smFRET målinger, hvilket indikerer, at de antagelser gjort føre til falske strukturel information. I modsætning hertil posteriors bestemt i den klassiske model er i overensstemmelse med de bestemte smFRET effektiviteter.
Som antagelsen af isotrope og / eller dynamisk position gennemsnit for alle farvestoffer fører til uoverensstemmelser, Fast-NPS giver farvestof molekyle priors, hvor hver farve kan tildeles en af de fem modeller. Hver model bruger samme tilgængelige volumen. Algoritmen til beregning af farvestoffet AVS gør flere antagelser. I første omgang er fluoroforen rumlige form tilnærmet med en kugle. Således en diameter under hensyntagen fluoroforen er width, højde og tykkelse bør anvendes (§ 12). Endvidere er linkeren facon tilnærmet med en fleksibel stang. Værdierne præsenteres i afsnit 12 blev beregnet for farvestoffet Alexa 647 fastgjort via en 12-C linker. Til dato er det ikke muligt nøjagtigt at bestemme på forhånd, hvilken model, der passer bedst, givet en eksperimentel geometri, og dermed alle modeller bør testes. Generelt vil man vælge den model, der giver den mindst mulige bageste størrelse, mens den stadig er i overensstemmelse med dataene. For at teste om et valg af modeller er i overensstemmelse med smFRET data, beregner vi både den bageste og sandsynligheden. Konsistens betyder, at mere end 90% af de indsamlede prøver fra den bageste er inden for 95% konfidensintervallet af sandsynligheden.
Mens det er rigtigt, at jo lavere anisotropi, jo mindre afstanden usikkerhed, i et smFRET netværk geometriske arrangementer af farvestofmolekyler skal også tages i betragtning. Medens representing farvestofmolekyler med en lav fluorescens anisotropi med en iso model er en typisk første valg, konsistensen test giver et mere direkte middel til at vælge den korrekte farve model. Det optimale valg af farvestof modeller kan føre til en drastisk stigning i lokalisering præcision og samtidig bibeholde netværkets sammenhæng med dens FRET data.
For at opsummere, Fast-NPS gør det muligt at få strukturel og dynamisk information af store makromolekylære komplekser. I modsætning til fælles strukturelle fremgangsmåder, såsom røntgenkrystallografi eller cryo-elektronmikroskopi dette giver mulighed for at overvåge meget fleksible eller forbigående komplekser, hvilket i høj grad udvide vores mekanistisk forståelse af komplekse biologiske processer.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.
Flowchamber preparation | |||
Customized metall sample holder | self-built | n/a | |
quartz-glass slides, 76 x 26 mm | Technical Glass Products | 26007 | |
coverslips, 60 x 24 mm | Marienfeld | 101242 | |
detergent, Hellmanex II | Hellma | 320.001 | |
ultra-pure water from Synergy UV | Millipore | 2512600 | |
Zepto plasma cleaner | Diener | n/a | |
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. | Sigma-Aldrich | A3648 | |
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | |
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | BIOTIN-PEG-SVA-5000 | |
Sodium biocarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 Sigma | |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S2127 Sigma-Aldrich | |
sealing film (Nescofilm) | Fisher Scientific | 12981805 | |
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD | Saint-Gobain Performance Plastics | 720958 | |
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) | Fisher Scientific | 12665497 | |
Neutravidin | Life Technologies | A2666 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Total internal reflection fluorescence microscope | |||
Nd:YAG Laser, 532 nm | Newport Spectra-Physics | EXLSR-532-100-CDRH | |
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso | Cobolt | 904010050 | |
diode laser 643 nm, iBeam smart | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | |
dichroic mirror, 532 RDC | Chroma | F33-540 | |
dichroic mirror, 476 RDC | Chroma | F33-476z | |
acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic | AOTFnC-VIS | |
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm | Thorlabs | LJ1703L1-A | |
plano-concave cylindrical, f = -300 mm | Thorlabs | ||
prism, PS 991 | Thorlabs | PS991 | |
focussing lens, f = 75 mm | Thorlabs | LA1608-B | |
syringe pump, PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2002 | |
2 stepper motors, Z812B | Thorlabs | Z812B | |
piezoelectric actuator, PE4 | Thorlabs | PE4 | |
IR diode laser | Edmund Optics | CPS808 | part of the autofocus system |
dichroic mirror, 775 DCXR | Chroma | 775 DCXR | |
position-sensing detector (PSD), PDP90A | Thorlabs | PDP90A | part of the autofocus system |
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 | Nikon | MRD07601 | |
dichroic mirror, 645 DCXR | Chroma | 645 DCXR | part of the emission pathway |
emission filter, 3RD550-510 | Omega Optical | 3RD550-510 | green channel in the emission pathway |
emission filter, 3RD660-760 | Omega Optical | 3RD660-760 | red channel in the emission pathway |
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV | Andor | AND-20-00032 | |
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV | Andor | AND-20-000141 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Miscellaneous | |||
Varian 50 | Cary | UV-VIS spectrometer | |
Fluorolog2 | SPEX | fluorescence spectrometer | |
Solis (V4.15) | Andor | control software for the EM-CCD camera | |
Apt user utility (V1.022) | Thorlabs | control software for the piezo-motors | |
Norland Optical Adhesive 68 | Thorlabs | adhesive | |
PC-AFN-0.8 Nile red | Kisker Biotech | avidin-coated fluorescent multispec beads | |
Matlab | Mathworks | technical computing language for custon written software | |
Origin (V9.0) | Originlab | scientific graphing and data analysis software | |
Hellma 105-202-15-40 | Hellma | 105-202-15-40 | absorption cuvette of 1 cm path length |
Hellma 105-251-15-40 | Hellma | 105-251-15-40 | fluorescence cuvette with 3 mm path length |