We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.
Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.
Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.
एक बायोमोलिक्यूल की संरचना का निर्धारण अपने कार्य को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है। संरचना निर्धारण के लिए दो अच्छी तरह से स्थापित तरीकों क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 1, 2 हैं। आज, दोनों तरीकों Angstrom स्तर तक नीचे एक संकल्प के साथ उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। इन दो तरीकों जैसे प्रोटीन परिसरों के रूप में बड़े biomolecules की संरचना को स्पष्ट करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। हालांकि मौजूदा तरीकों लगातार पिछले दशकों के दौरान सुधार किया गया है, जैविक संरचनाओं की जटिलता अभी भी संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए एक बड़ी चुनौती बन गया है, विशेष रूप से जब, बड़ी गतिशील और क्षणिक परिसरों 3 जांच कर रहे हैं।
macromolecular परिसर की गतिशीलता और विशेष रूप से संरचना समारोह संबंधों का अध्ययन करने के लिए, एकल अणु के तरीके नीति हैided उपयोगी जानकारी 4। कई नई रणनीति संरचनात्मक और गतिशील जानकारी प्राप्त करने पर एक orthogonal दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए विकसित किया गया। उदाहरण के लिए उच्च गति AFM 5, यांत्रिक हेरफेर 6, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी स्थानीयकरण 7, साथ ही एकल अणु Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (smFRET) 8, 9 रहे हैं। काफी जल्दी झल्लाहट पर चूंकि Biomacromolecules 10 की लंबाई के पैमाने पर दूरी निर्भरता की वजह से एक आणविक शासक करार दिया गया है।
SmFRET से एक विशेष रूप से दिलचस्प आवेदन दूरी जानकारी smFRET माप से प्राप्त का उपयोग करने के लिए अनुमान है संरचनात्मक जानकारी 11, 12, 13, 14, 15 </sup>, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23। smFRET के उच्च समय संकल्प के कारण, एक प्रोटीन संरचना के मोबाइल पार्ट्स की स्थिति अनुवादित किया जा सकता है। हालांकि, के लिए डाई अणु के बारे में smFRET डेटा महत्वपूर्ण सुधार मापदंडों से मात्रात्मक जानकारी निकालने के लिए माप में 24 के दौरान निर्धारित किया जा करने की जरूरत है। इन सुधार कारकों के साथ, झल्लाहट दक्षता ई झल्लाहट सूत्र का उपयोग कर गणना की जा सकती
,
जहां मैं एक और मैं डी </sयूबी> क्रमश: दाता और स्वीकर्ता अणु, के प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 2 देखें) कर रहे हैं। β-कारक स्वीकर्ता चैनल में पार बात के लिए खातों, दाता उत्सर्जन के रिसाव और से गणना की है
जहां मैं एक और मैं 'डी दाता की प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्वीकर्ता अणु की तस्वीर विरंजन के बाद स्वीकर्ता अणु हैं।
γ-कारक दो चैनलों में रिश्तेदार का पता लगाने क्षमता में अंतर के रूप में अच्छी तरह से दाता के प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज और स्वीकर्ता डाई में मतभेद सही। यह द्वारा हर व्यक्ति समय का पता लगाने से गणना की है
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" fo:text-align="center" style = "text-align: केंद्र;">ध्यान दें, कि इस विवरण स्वीकर्ता अणु, जो कभी कभी महत्वपूर्ण हो जाता है और साथ ही साथ के लिए सही करने की आवश्यकता होगी के प्रत्यक्ष उत्तेजना neglects। इन सुधार कारकों का निर्धारण करने के लिए यह आदेश तस्वीर-शारीरिक परिवर्तन और संरचनात्मक गतिशीलता के बीच अंतर करने के लिए एक बारी में इस योजना के 25 में दोनों दाता के रूप में अच्छी तरह से स्वीकर्ता उत्तेजित करने के लिए उपयोगी है।
आदेश न केवल मात्रात्मक smFRET क्षमता है लेकिन यह भी मात्रात्मक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए, नैनो-पोजिशनिंग सिस्टम (एनपीएस) 2008 26 में शुरू किया गया था। नाम उपग्रह आधारित ग्लोबल पोजिशनिंग सिस्टम (जीपीएस) के लिए अपनी समानता के आधार पर चुना गया था। एनपीएस biomacromolecular परिसरों में अज्ञात डाई पदों के स्थानीयकरण के लिए smFRET और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी डेटा संयोजन एक संकर तकनीक है। गrystal संरचना एक संदर्भ फ्रेम के रूप में कार्य करता है और smFRET परिणाम एक अज्ञात fluorophore स्थिति (एंटीना) और एक स्थिति में क्रिस्टल संरचना (उपग्रह) से भी जाना जाता है के बीच की दूरी के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। लगातार प्रयोगों में एंटीना और कई उपग्रहों के बीच दूरी नापी जाती है और एंटीना की स्थिति एक सांख्यिकीय कठोर विश्लेषण Bayesian पैरामीटर आकलन के आधार पर इस योजना के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। नतीजतन, न केवल एंटीना की likeliest स्थिति गणना की जाती है, लेकिन इसकी पूर्ण 3 डी अनिश्चितता वितरण, तथाकथित पीछे, विश्वसनीय संस्करणों द्वारा कल्पना। इसके अलावा, एनपीएस पूरा smFRET नेटवर्क 27 के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए विस्तार किया गया था।
एनपीएस यूकेरियोटिक प्रतिलेखन में महत्वपूर्ण सवाल है, अर्थात् नदी के ऊपर डीएनए, गैर टेम्पलेट डीएनए और आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय बढ़ाव सह भीतर नवजात mRNA के पाठ्यक्रम की एक संख्या को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैmplex 12, 28, भी प्रतिलेखन दीक्षा के प्रभाव का प्रदर्शन 26 कारकों और एक खुले-प्रमोटर के गतिशील वास्तुकला जटिल 29। इसके अलावा, एनपीएस अर्चेअल शाही सेना पोलीमरेज़ खुले परिसर में 30 और प्रतिलेखन कारक दीक्षा TFE की स्थिति है, जो प्रतिलेखन कारक बढ़ाव Spt4 / 5 31 के रूप में ही साइट के लिए प्रतिस्पर्धात्मक रूप से बांधता है विशेष रूप से संरचना को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
तब से, smFRET आधारित संरचनात्मक दृष्टिकोण के एक नंबर 15, 18, 21, 23 प्रकाशित किया गया है। जब अलग smFRET आधारित संरचनात्मक तरीकों की तुलना, यह स्पष्ट हो जाता है कि विधि का स्पष्ट सटीक डाई मॉडल की खास पसंद पर निर्भर है। एक नोट करना चाहिए किडाई अणु अपने स्थानीय परिवेश के आधार पर अलग स्थानिक और orientational व्यवहार प्रदर्शन कर सकते हैं।
यह अंत करने के लिए, तेजी से एनपीएस 32 पेश किया गया था। फास्ट एनपीएस एक उन्नत नमूना एल्गोरिथ्म गणना बार काफी कम करने का उपयोग करता है। इसके अलावा, तेजी से एनपीएस एक एक संरचनात्मक विश्लेषण करने के लिए और प्रत्येक डाई अणु के लिए उपयोगकर्ता पाँच अलग अलग डाई मॉडल का एक सेट है, जो अगले वर्णित किया जाएगा से चुन सकते हैं अनुमति देता है। सबसे रूढ़िवादी मॉडल, क्लासिक कहा जाता है, यह मानता है कि डाई केवल एक ही है, लेकिन अज्ञात स्थान रखता है। इस स्थिति में, fluorophore एक शंकु, जिसका आकार अपने संबंधित (समय पर निर्भर) प्रतिदीप्ति anisotropy से निर्धारित किया जाता है के भीतर स्वतंत्र रूप से बारी बारी से कर सकते हैं। शंकु के उन्मुखीकरण ज्ञात नहीं है, जब दूरी में मापा जाता smFRET क्षमता परिवर्तित जो बड़े अनिश्चितताओं की ओर जाता है। इस संबंध में, मॉडल, रूढ़िवादी है, क्योंकि यह अन्य डाई मोड की तुलना में छोटी से छोटी सटीक करने के लिए नेतृत्व करेंगेरास। बहुत ही कम दूरी के लिए एक काफ़ी गलत स्थिति निर्धारण के लिए क्लासिक मॉडल नेतृत्व द्वारा किए गए मान्यताओं चाहिए। ठेठ smFRET मूल्यों के लिए, सही स्थिति हमेशा अपेक्षाकृत बड़े विश्वसनीय मात्रा में संलग्न है।
हालांकि, बाद में एक उच्च परिशुद्धता वांछनीय है, यह महत्वपूर्ण है को विकसित करने और वैकल्पिक डाई मॉडल है, जो परिशुद्धता में सुधार करने में मदद कर सकता है परीक्षण करने के लिए है। डाई अपने निहित प्रतिदीप्ति जीवनकाल की तुलना में ज्यादा तेजी से घूमता है, तो तथाकथित आईएसओ मॉडल लागू किया जा सकता है। इधर, उन्मुखीकरण कारक 2 κ (विशेषता isotropic फोर्स्टर त्रिज्या की गणना के लिए आवश्यक ) 2/3 के लिए निर्धारित है। नतीजतन, अभिकलन विश्वसनीय संस्करणों परिमाण छोटे के लगभग दो आदेशों क्लासिक मॉडल 32 में उन लोगों की तुलना में कर रहे हैं। मामला है कि fluorophore एक वातावरण में पाया जाता है कि न केवल तेजी से reori में सक्षम बनाता हैप्रलेखन, लेकिन इसके साथ ही तेज गति सभी अपने सुलभ मात्रा अधिक है, meanpos आईएसओ मॉडल का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस मॉडल में, डाई प्रभावी रूप से केवल एक ही मतलब स्थिति है, जहां स्थानिक औसतन एक बहुपद दूरी रूपांतरण 15 से हिसाब है रह रहे हैं। यह मॉडल लागू होता है अगर उदाहरण के लिए (आमतौर पर हाइड्रोफोबिक) डाई एक हाइड्रोफिलिक क्षेत्र, जैसे, डीएनए से जुड़ी है। Meanpos आईएसओ मॉडल के आवेदन लगभग दो का एक पहलू से विश्वसनीय वॉल्यूम के आकार में और कमी की ओर जाता है। हालांकि, एक डाई एक प्रोटीन से जुड़े अपने sterically सुलभ मात्रा (ए वी) में कई हाइड्रोफोबिक पैच के लिए reversibly बाँध सकता है। एक fluorophore कि तत्क्षण इन क्षेत्रों के बीच स्विच, लेकिन एक क्षेत्र के भीतर मुक्त रोटेशन से होकर गुजरती है और तेजी से स्थानीय गति सबसे अच्छा वर-meanpos आईएसओ मॉडल के आधार पर वर्णित है। एक ऐसी ही स्थिति में जो डाई वर-meanpos मॉडल लागू होता है बारी बारी से करने के लिए स्वतंत्र नहीं है। अधिक d इन मॉडलों के बारे में etails हमारे हाल ही में प्रकाशन के 32 में पाया जा सकता है।
इन मॉडलों को एक व्यापक प्रदर्शनों की सूची विशेष रूप से विभिन्न वातावरण एक डाई मुठभेड़ हो सकता है के लिए खाते हैं और उन्हें लागू करने के बुद्धिमानी से अपनी स्थानीयकरण परिशुद्धता का अनुकूलन कर सकते हैं। फास्ट एनपीएस में हर डाई एक विशिष्ट स्थिति से जुड़ी अणु एक व्यक्ति के मॉडल को सौंपा जा सकता है, जैसे कि झल्लाहट भागीदारों के अलग अलग मॉडल है की अनुमति है। इस असीम और बंद करने वाली प्रकृति मॉडलिंग सक्षम बनाता है। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि एक कठोर सांख्यिकीय परीक्षण करता है सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम अंतिम मॉडल संयोजन के द्वारा प्राप्त की प्रयोगात्मक डेटा के साथ समझौते में अब भी है। इन परीक्षणों फास्ट एनपीएस सॉफ्टवेयर में शामिल किए गए हैं।
आदेश में प्रयोगात्मक डेटा को तेजी से लागू करने के लिए एनपीएस में (केवल) तीन इनपुट पैरामीटर्स की माप की आवश्यकता है। सबसे पहले, डाई-जोड़ी विशिष्ट isotropic फोर्स्टर त्रिज्या (/54782/54782eq5.jpg "। इसलिए, दाता डाई की मात्रा उपज (QY) />) निर्धारित किया जाना है, दाता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रा मापा जा करने की जरूरत है। इन मापों में किया जा सकता है थोक, एक मानक स्पेक्ट्रोमीटर और एक मानक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर। प्रत्येक जोड़ी के लिए, आर 0 तब फ्रीवेयर PhotochemCAD उपयोग कर की गणना की जाती है और एनपीएस विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, (समय हल) डाई अणु के प्रतिदीप्ति anisotropies जरूरत एक ध्रुवीकरण (और समय) संवेदनशील प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर प्राप्त किया जाना है। हालांकि, तेजी से एनपीएस के लिए सबसे महत्वपूर्ण इनपुट पैरामीटर smFRET इस तरह के एक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TIRFM) के रूप में एक एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेटअप पर मापा क्षमता, कर रहे हैं ।
यहाँ, हम smFRET डेटा प्राप्त करने और तेजी से एनपीएस (चित्रा 1) को लागू करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
हम सेटअप और प्रयोगात्मक प्रक्रिया सही Biomacromolecules, यानी, न्यूक्लिक एसिड और / या प्रोटीन के लिए लचीला linkers के माध्यम से जुड़ा रंगों के बीच झल्लाहट क्षमता निर्धारित करने के लिए उपस्थित थे।
आदेश सटीक smFRET माप (धारा 3) यह सुनिश्चित करने के लिए, यह माप के दौरान किसी भी समय प्रवाह चैम्बर से हवा को बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, fluorophores के साथ प्रवाह कक्ष अधिभार नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें। fluorophores स्पष्ट रूप से सही विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए अलग किया जाना चाहिए। smFRET जोड़े, जो दाता के विरंजन नहीं दिखा विश्लेषण से बाहर रखा जाना है के रूप में, यकीन है कि देखने के क्षेत्र में अणुओं के> 80% फिल्म के अंत में प्रक्षालित कर रहे हैं। नमूना β-कारक और γ-फैक्टर में inhomogeneities के लिए खाते में करने के लिए, पार बात और रिश्तेदार दाता और स्वीकर्ता चैनल का पता लगाने के लिए क्षमता को सही करने, क्रमशः, प्रत्येक के लिए गणना कर रहे हैं झल्लाहट को व्यक्तिगत रूप से जोड़ी।
<p class= "Jove_content"> कैमरा सेटिंग्स (एकीकरण के समय, इलेक्ट्रॉन गुणक लाभ, पूर्व एम्पलीफायर लाभ और readout धारा 3.9 में वर्णित दर) शोर अनुपात, गतिशील रेंज और समय-संकल्प करने के लिए संकेत के बीच सबसे अच्छा तालमेल देने के मूल्यों को स्थापित किया जाना चाहिए। वे विभिन्न प्रयोगों के लिए या यदि विभिन्न हार्डवेयर प्रयोग किया जाता है फिर से समायोजित करने की जरूरत है। तख्ते की संख्या पर्याप्त उच्च सुनिश्चित करना है कि दाता के सबसे अवलोकन समय के भीतर ब्लीच अणुओं की जरूरत है।प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर (धारा 7 से 9) पर माप के लिए संकेत तीव्रता और दर्ज आंकड़ों के वर्णक्रम संकल्प के बीच एक अच्छा समझौता हो पाया है। यह अंत करने के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर की उत्तेजना और उत्सर्जन मार्ग में slits इस्तेमाल साधन और नमूना एकाग्रता पर निर्भर है अनुकूलित किया जाना है।
इसके अलावा, हम क्षणिक या गतिशील MACROM के संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए तेजी से एनपीएस विश्लेषण विधि प्रस्तुतolecular परिसरों। एनपीएस गैर टेम्पलेट डीएनए किनारा का पथ और अर्चेअल आरएनए पोलीमर्स खुले परिसर में प्रतिलेखन दीक्षा कारकों की स्थिति को प्रकट करने के लिए लागू किया गया है। 60 से अधिक विभिन्न दूरी माप के नेटवर्क का उपयोग, हम पता चला है कि फास्ट एनपीएस, एक हाल में लागू नमूना इंजन (Eilert, टी, Beckers, एम, Drechsler, एफ, और Michaelis, तैयारी में जे) के साथ सुसज्जित, समय मूल वैश्विक एनपीएस विधि 27 की तुलना में, परिमाण के ≈2 आदेश से इस जटिल smFRET नेटवर्क के विश्लेषण के लिए आवश्यक कम कर देता है। एल्गोरिथ्म की मजबूती के एक महानगर के भीतर गिब्स नमूना एक समानांतर तड़के योजना के साथ संयुक्त में निहित है। फास्ट एनपीएस नेटवर्क परिणामों की सही reproducibility पता चलता है और पहले 30 प्रकाशित परिणामों के साथ संगत है।
कई अलग अलग तरीकों smFRET माप 11 से संरचनात्मक जानकारी अनुमान करने के लिए लक्ष्य प्रकाशित किया गया है </sअप>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18। इन तरीकों के सभी केवल एक विशिष्ट डाई मॉडल प्रदान करते हैं। इस प्रकार, रंग, कि संबंधित मॉडल के आधार पर बनाया मान्यताओं को पूरा नहीं करते हैं, नहीं किया जा सकता है या गलत जानकारी संरचनात्मक पैदा होती हैं। फास्ट एनपीएस, इसके विपरीत, प्रत्येक डाई अणु एक अलग मॉडल के लिए चयन करने के लिए अनुमति देता है। यह दोनों के अलग-अलग गठनात्मक व्यवहार के लिए खाते में मदद करता है, डाई अणु ही है, साथ ही साथ अपने लगाव के लिए इस्तेमाल किया लिंकर। डाई अणु की स्थानीय आणविक परिवेश, साथ ही इसकी भौतिक गुणों का निर्धारण करेगा जो मॉडल सबसे उपयुक्त है।
अर्चेअल दीक्षा परिसर का विश्लेषण किया smFRET नेटवर्क के लिए, सभी डाई अणुओं के लिए एक isotropic धारणा भारी कमी की ओर जाता रहाn विश्वसनीय वॉल्यूम के आकार क्लासिक मॉडल की तुलना में। सभी डाई के लिए औसत एक गतिशील स्थिति के साथ संयोजन में सभी विश्वसनीय मात्रा आकार के मंझला अणुओं (95% से कम) कम से कम 0.5 एनएम 3 को कम कर देता है। हालांकि, इन डाई अणु कूल्हे का संकेत है कि मान्यताओं झूठी संरचनात्मक जानकारी के लिए नेतृत्व बनाया उनकी smFRET माप के साथ नहीं रह संगत कर रहे हैं। इसके विपरीत, क्लासिक मॉडल में निर्धारित कूल्हे चुना गया smFRET क्षमता के साथ संगत कर रहे हैं।
सभी रंगों के लिए औसत isotropic और / या गतिशील स्थिति की धारणा के रूप में विसंगतियों के लिए नेतृत्व, फास्ट-एनपीएस डाई अणु Priors जिसमें प्रत्येक डाई पांच मॉडलों में से एक सौंपा जा सकता है सक्षम बनाता है। प्रत्येक मॉडल ही सुलभ मात्रा का उपयोग करता है। डाई AVs की गणना के लिए एल्गोरिथ्म कई मान्यताओं बनाता है। सबसे पहले, fluorophore के स्थानिक आकार एक क्षेत्र द्वारा अनुमानित है। इस प्रकार, एक व्यास अकाउंट fluorophore के wid में लेवें, ऊंचाई और मोटाई (धारा 12) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, लिंकर का आकार एक लचीली छड़ी द्वारा अनुमानित है। धारा 12 में प्रस्तुत मूल्यों डाई एलेक्सा 647 एक 12-सी लिंकर के माध्यम से जुड़ा के लिए गणना कर रहे थे। तिथि करने के लिए, यह संभव नहीं सही एक प्राथमिकताओं जो मॉडल सबसे उपयुक्त है निर्धारित करने के लिए, यह देखते हुए एक प्रायोगिक ज्यामिति है, और इस तरह के सभी मॉडल का परीक्षण किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, एक, मॉडल है जो छोटी संभव पीछे आकार देता है का चयन करेंगे, जबकि अभी भी डेटा के साथ संगत किया जा रहा है। कि क्या मॉडलों में से एक विकल्प smFRET डेटा के साथ संगत है परीक्षण करने के लिए, हम दोनों पीछे और संभावना की गणना। संगति का मतलब है कि पीछे से एकत्र नमूनों की 90% से अधिक संभावना के 95% विश्वास अंतराल के भीतर हैं।
हालांकि यह सच है कम anisotropy, छोटी दूरी अनिश्चितता, एक smFRET नेटवर्क में डाई अणु के ज्यामितीय व्यवस्था को भी ध्यान में रखा जाना है। इस प्रकार, जबकि आरएक आईएसओ मॉडल के साथ एक कम प्रतिदीप्ति anisotropy साथ डाई अणु epresenting एक ठेठ पहली पसंद है, स्थिरता परीक्षण सही डाई मॉडल का चयन करने के लिए एक और अधिक प्रत्यक्ष साधन प्रदान करता है। डाई मॉडल के इष्टतम पसंद स्थानीयकरण परिशुद्धता में भारी वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और एक ही समय में अपनी झल्लाहट डेटा के साथ नेटवर्क की निरंतरता बनाए रखने के लिए।
संक्षेप में, तेजी से एनपीएस बड़े macromolecular परिसर के संरचनात्मक और गतिशील जानकारी हासिल करने के लिए अनुमति देता है। इस तरह के एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस अत्यधिक लचीला या क्षणिक परिसरों की निगरानी, इस प्रकार बहुत जटिल जैविक प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को यंत्रवत को चौड़ा करने के लिए अनुमति देता है के रूप में आम संरचनात्मक तरीकों के विपरीत।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.
Flowchamber preparation | |||
Customized metall sample holder | self-built | n/a | |
quartz-glass slides, 76 x 26 mm | Technical Glass Products | 26007 | |
coverslips, 60 x 24 mm | Marienfeld | 101242 | |
detergent, Hellmanex II | Hellma | 320.001 | |
ultra-pure water from Synergy UV | Millipore | 2512600 | |
Zepto plasma cleaner | Diener | n/a | |
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. | Sigma-Aldrich | A3648 | |
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | |
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | BIOTIN-PEG-SVA-5000 | |
Sodium biocarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 Sigma | |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S2127 Sigma-Aldrich | |
sealing film (Nescofilm) | Fisher Scientific | 12981805 | |
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD | Saint-Gobain Performance Plastics | 720958 | |
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) | Fisher Scientific | 12665497 | |
Neutravidin | Life Technologies | A2666 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Total internal reflection fluorescence microscope | |||
Nd:YAG Laser, 532 nm | Newport Spectra-Physics | EXLSR-532-100-CDRH | |
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso | Cobolt | 904010050 | |
diode laser 643 nm, iBeam smart | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | |
dichroic mirror, 532 RDC | Chroma | F33-540 | |
dichroic mirror, 476 RDC | Chroma | F33-476z | |
acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic | AOTFnC-VIS | |
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm | Thorlabs | LJ1703L1-A | |
plano-concave cylindrical, f = -300 mm | Thorlabs | ||
prism, PS 991 | Thorlabs | PS991 | |
focussing lens, f = 75 mm | Thorlabs | LA1608-B | |
syringe pump, PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2002 | |
2 stepper motors, Z812B | Thorlabs | Z812B | |
piezoelectric actuator, PE4 | Thorlabs | PE4 | |
IR diode laser | Edmund Optics | CPS808 | part of the autofocus system |
dichroic mirror, 775 DCXR | Chroma | 775 DCXR | |
position-sensing detector (PSD), PDP90A | Thorlabs | PDP90A | part of the autofocus system |
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 | Nikon | MRD07601 | |
dichroic mirror, 645 DCXR | Chroma | 645 DCXR | part of the emission pathway |
emission filter, 3RD550-510 | Omega Optical | 3RD550-510 | green channel in the emission pathway |
emission filter, 3RD660-760 | Omega Optical | 3RD660-760 | red channel in the emission pathway |
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV | Andor | AND-20-00032 | |
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV | Andor | AND-20-000141 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Miscellaneous | |||
Varian 50 | Cary | UV-VIS spectrometer | |
Fluorolog2 | SPEX | fluorescence spectrometer | |
Solis (V4.15) | Andor | control software for the EM-CCD camera | |
Apt user utility (V1.022) | Thorlabs | control software for the piezo-motors | |
Norland Optical Adhesive 68 | Thorlabs | adhesive | |
PC-AFN-0.8 Nile red | Kisker Biotech | avidin-coated fluorescent multispec beads | |
Matlab | Mathworks | technical computing language for custon written software | |
Origin (V9.0) | Originlab | scientific graphing and data analysis software | |
Hellma 105-202-15-40 | Hellma | 105-202-15-40 | absorption cuvette of 1 cm path length |
Hellma 105-251-15-40 | Hellma | 105-251-15-40 | fluorescence cuvette with 3 mm path length |