We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.
Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.
Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.
Bestemmelse av strukturen til et biomolekyl er en viktig forutsetning for å forstå dens funksjon. To godt etablerte metoder for strukturbestemmelse er kryo-elektronmikroskopi og røntgen-krystallografi 1, 2. I dag, begge metodene gir høy oppløsning strukturell informasjon med en oppløsning ned til Angstrom nivå. Disse to metoder er blitt brukt i stor utstrekning for å klargjøre konstruksjonen av store biomolekyler slik som proteinkomplekser. Selv om eksisterende metoder har stadig blitt forbedret gjennom de siste tiårene, kompleksiteten i biologiske strukturer utgjør fortsatt en stor utfordring for strukturbiologi, spesielt når store, dynamiske og forbigående komplekser er undersøkt tre.
For å studere dynamikken i makromolekylære komplekser og struktur-funksjon relasjonen spesielt enkelt-molekyl metoder har provided nyttig informasjon fire. Flere nye strategier ble utviklet som gir en rettvinklet tilnærming på å anskaffe strukturell og dynamisk informasjon. Eksempler er høy hastighet AFM 5, mekanisk manipulasjon 6, fluorescens lokalisering mikros 7, samt enkelt-molekyl Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) 8, 9. Siden ganske tidlig FRET er blitt betegnet som en molekylær linjal, på grunn av avstanden avhengighet av lengden omfanget av biomacromolecules 10.
En spesielt interessant anvendelse av smFRET er å bruke avstandsinformasjon oppnådd fra smFRET målinger for å utlede strukturinformasjon 11, 12, 13, 14, 15 </sup>, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. På grunn av den høye tidsoppløsning på smFRET, kan posisjonen av mobile deler av en proteinstruktur bli lokalisert. Imidlertid, for å trekke ut kvantitativ informasjon fra smFRET data viktige korreksjonsparametre om fargestoffmolekylene må bestemmes under målingen 24. Med disse korreksjonsfaktorer kan gnage effektivitet E FRET beregnes ved hjelp av formelen
,
der jeg A og jeg D </sub> er fluorescensstyrkene til donor og akseptor-molekyl, henholdsvis (se figur 2). Den β-faktor står for krysstale, lekkasje av donor utslipp til akseptor-kanal og er beregnet ved å
hvor jeg A og jeg vil er fluorescensstyrkene til donor og akseptor molekylet etter bilde bleking av akseptor molekylet.
Den γ-faktor korrigerer forskjellen i de relative deteksjonseffektivitet i de to kanaler, så vel som forskjeller i fluorescens kvanteutbytte av donor og akseptor fargestoff. Det beregnes ut fra hver enkelt gang spor etter
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" fo:text-align="center" style = "text-align: center;">Legg merke til at denne beskrivelsen forsømmer direkte eksitering av akseptor-molekyl, som noen ganger blir viktig, og vil måtte korrigeres for i tillegg. For bestemmelse av disse korreksjonsfaktorer er det nyttig å eksitere både donor og akseptor i et vekslende ordning 25 for å skille mellom foto fysiske endringer og strukturelle dynamikk.
For å ikke bare få kvantitative smFRET effektivitet, men også kvantitative strukturell informasjon, ble Nano-Positioning System (NPS) ble introdusert i 2008 26. Navnet ble valgt på bakgrunn av sine likheter med satellitt-baserte Global Positioning System (GPS). NPS er en hybrid teknikk som kombinerer smFRET og Røntgenkrystallografi-data for lokalisering av ukjente farve stillinger i biomacromolecular komplekser. den ckrystall-struktur fungerer som en referanserammen og smFRET resultatene brukes til å innhente informasjon om avstand mellom en ukjent fluorofor stilling (antenne) og en stilling som er kjent fra krystallstrukturen (satellitt). I etterfølgende eksperimenter avstandene mellom antennen og flere satellitter måles, og posisjonen av antennen bestemmes ved hjelp av en statistisk grundig analyse ordning basert på Bayesian parameterestimering. Som et resultat, er ikke bare den mest sannsynlige posisjon av antennen beregnet, men dens fullstendige 3D usikkerhets fordeling, den såkalte posterior, visualisert ved troverdige volumer. Videre NPS ble utvidet for å tillate analyse av komplette smFRET nettverk 27.
NPS har vært brukt til å løse en rekke viktige spørsmål i eukaryote transkripsjons, nemlig i løpet av oppstrøms DNA, ikke-templat-DNA, og den begynnende mRNA i RNA Polymerase II forlengelse complex 12, 28, som også viser virkningen av transkripsjonsinitiering faktorer 26 og den dynamiske arkitekturen til en åpen-promotor kompleks 29. Videre ble NPS brukt til å belyse strukturen av archaeal RNA Polymerase åpen kompleks 30 og spesielt posisjonen av transkripsjonsinitiering faktor TFE, som bindes kompetitivt til det samme området som transkripsjons elongeringsfaktor Spt4 / 5 31.
Siden den gang har en rekke smFRET basert strukturelle tilnærminger blitt publisert 15, 18, 21, 23. Når man sammenligner ulike smFRET baserte strukturelle metoder, blir det klart at den tilsynelatende presisjonen av fremgangsmåten er svært avhengig av det spesielle valg av fargestoff-modeller. Man bør merke seg atfargestoffer kan utvise forskjellig romlig og orienteringsatferd avhengig av sitt nærmiljø.
For å oppnå dette, ble Fast-NPS innført 32. Fast-NPS bruker en avansert prøvetaking algoritme redusere beregnings ganger drastisk. Videre gir Fast-NPS en for å utføre en strukturell analyse og for hver fargestoffmolekylet at brukeren kan velge mellom et sett av fem forskjellige modeller fargestoff som vil bli beskrevet etterpå. Den mest konservative modellen, kalt klassisk, forutsetter at fargestoffet opptar bare en, men ukjent, posisjon. På denne stilling kan fluoroforen rotere fritt innenfor en kjegle, hvis størrelse bestemmes ut fra sin respektive (tidsavhengig) fluorescens anisotropi. Orienteringen av kjeglen er ikke kjent, noe som fører til store usikkerheter ved konvertering, målt smFRET effektiviteten til avstander. I dette henseende, er modellen konservativ, da det vil føre til den minste presisjon i forhold til den andre modusen fargestoffls. Bare for svært korte avstander bør forutsetningene gjort av den klassiske modellen føre til et merkbart feil posisjonsbestemmelse. For typiske smFRET verdier, er riktig posisjon alltid vedlagt i den forholdsvis store troverdig volum.
Imidlertid, siden en høyere nøyaktighet er ønskelig, er det viktig å utvikle og teste alternative fargestoff modeller, som kan bidra til å forbedre presisjonen. Hvis fargestoffet roterer mye raskere enn dens iboende fluorescens levetid, kan den såkalte iso-modellen benyttes. Her, orienteringen faktor κ 2 (som er nødvendig for å beregne den karakteristiske isotropisk Förster radius ) Er satt til 2/3. Som et resultat av de beregnede troverdige volumene er nesten to størrelsesordener mindre, sammenlignet med de i den klassiske modell 32. I det tilfellet at fluoroforen er funnet i et miljø som muliggjør ikke bare en rask reorientering, men i tillegg rask bevegelse hele sin tilgjengelige volum, bør meanpos-iso-modellen brukes. I denne modellen fargestoffet opptar effektivt bare en midlere posisjon, hvor den romlige gjennomsnitts føres etter et polynom avstand konvertering 15. Denne modellen gjelder hvis for eksempel den (vanligvis hydrofobe) fargestoff er festet til en hydrofil region, for eksempel, DNA. Anvendelse av meanpos-iso-modell fører til en ytterligere reduksjon i størrelsen av de troverdige volum med en faktor på omtrent to. Imidlertid kan et fargestoff bundet til et protein som bindes reversibelt til flere hydrofobe flekker i sin sterisk tilgjengelige volum (AV). En fluorophore som øyeblikkelig bytter mellom disse regionene, men innenfor en region gjennomgår fri rotasjon og rask lokalisert bevegelse er best beskrevet av VAR-meanpos-iso modell. For en lignende situasjon der fargestoffet er ikke gratis å rotere VAR-meanpos modell gjelder. mer d etails om disse modellene finner du i vår siste utgivelse 32.
Disse modellene gir et omfattende repertoar å spesifikt redegjøre for de ulike miljøene et fargestoff kan støte på og bruke dem klokt optimaliserer sin lokalisering presisjon. I Fast-NPS hver fargestoff molekyl festet til en bestemt stilling kan tilordnes en enkelt modell, slik at FRET-partnere har lov til å ha forskjellige modeller. Dette muliggjør ubegrenset og nær-til-naturen modellering. Det er imidlertid viktig at man gjennomfører krevende statistiske tester for å sikre at det resultat som oppnås ved den endelige modell kombinasjonen er fortsatt i samsvar med de eksperimentelle data. Disse testene er inkludert i Fast-NPS programvare.
For å bruke Fast-NPS til eksperimentelle data er nødvendig for måling av (bare) tre input parametere. Først fargestoff-paret bestemt isotropisk Förster radier (/54782/54782eq5.jpg "/>) Er ikke bestemt. Derfor kvanteutbyttet (QY) av donor fargestoff, giver fluorescens-emisjonsspektra og akseptor-absorpsjonsspektra trenger å bli målt. Disse målingene kan utføres i bulk, ved hjelp av en standard spektrometer og en standard fluorescens-spektrometer. for hvert par, er R 0 deretter beregnet ved anvendelse av freeware PhotochemCAD og kan brukes i NPS-analyse. Dessuten er (tids-oppløst) fluorescens anisotropier av fargestoffmolekylene trenger som skal oppnås ved hjelp av en polarisering (og tid) følsom fluorescens spektrometer. Men de viktigste innsatsparametre for Fast-NPS er smFRET effektivitet målt på en enkelt-molekyl fluorescens mikroskopi oppsett, for eksempel en total intern refleksjon fluorescens mikroskop (TIRFM) .
Her presenterer vi en steg-for-steg-protokollen for å skaffe smFRET data og bruke Fast-NPS (figur 1).
Vi presenterer oppsettet og eksperimentell prosedyre for å fastslå nøyaktig FRET effektivitet mellom fargestoffer festet via fleksible forbindelsesledd til biomacromolecules, dvs. nukleinsyrer og / eller proteiner.
For å sikre nøyaktige målinger smFRET (avsnitt 3), er det viktig å utelukke luft fra strømningskammeret til enhver tid under målingen. Videre sørge for å ikke overbelaste strømmen kammer med fluorophores. Fluoroforene må være klart atskilt for å sikre korrekt analyse. Som smFRET par, som ikke viser bleking av donor må være ekskludert fra analysen, sørg for at> 80% av molekylene i synsfeltet er bleket på slutten av filmen. Å ta hensyn til inhomogeniteter i utvalget av β-faktor og γ-faktor, korrigere cross-talk og relative deteksjonseffektivitet av donor og akseptor kanal, henholdsvis beregnes for hver FRET pare individuelt.
<p class= "Jove_content"> Kamerainnstillingene (integrering tid, elektron multiplikator gain, pre-forsterker forsterknings- og avlesning rente beskrevet i punkt 3.9) bør settes til verdier som gir det beste kompromisset mellom signal til støyforhold, dynamisk område og tid-oppløsning. De trenger å bli re-justeres for ulike eksperimenter eller hvis forskjellig maskinvare brukes. Numrene på rammer må være høy nok til å sikre at det meste av donor molekylene blekemiddel innen observasjonstid.For målingene på fluorescens spektrometer (§§ 7 til 9) et godt kompromiss mellom signalintensitet og spektral oppløsning av de registrerte data må bli funnet. For dette formål er slissene i den eksitasjon og emisjon passasje i fluorescens spektrometer må tilpasses avhengig av det instrument som brukes og prøven konsentrasjon.
Videre presenterer vi Fast-NPS analysemetode for å oppnå strukturell informasjon fra forbigående eller dynamisk MACROMolecular komplekser. NPS har blitt anvendt for å vise banen for den ikke-templat DNA-tråd, og posisjonen av transkripsjonsinitieringsseter faktorer i archaeal RNA-polymerase åpen kompleks. Bruke nettverk av mer enn 60 forskjellige avstandsmålinger, vi viste at Fast-NPS, utstyrt med en nylig gjennomført prøvetaking motor (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. under forberedelse), reduserer den tiden som er nødvendig for analysen av dette komplekset smFRET nettverk av ≈2 størrelsesordener, sammenlignet med den opprinnelige globale NPS metode 27. Algoritmen robusthet er forankret i en Metropolis-i-Gibbs sampler kombinert med en parallell tempe ordningen. Fast-NPS viser eksakt reproduserbarhet av nettverk resultater og er konsistent med resultatene publisert tidligere 30.
Flere ulike metoder har blitt publisert som mål å antyde strukturell informasjon fra smFRET målinger 11 </sopp>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Alle disse fremgangsmåter gir bare en spesifikk modell fargestoff. Dermed fargestoffer, som ikke oppfyller forutsetningene gjort av den aktuelle modellen, kan ikke brukes eller føre til falsk strukturell informasjon. Rask-NPS tvert, innrømmer å hver velge fargestoff molekylet forskjellige modellen. Dette bidrar til å gjøre rede for ulike konformasjonelle oppførsel av begge deler, fargestoffmolekylet selv, samt linkeren anvendt for innfestingen. De lokale molekylære omgivelser i fargestoffmolekylet, så vel som dens fysiske egenskaper vil bestemme hvilken modell som er mest hensiktsmessig.
For den analyserte smFRET nettverk av archaeal initieringskomplekset, en isotrop antakelse for alle fargestoffer som fører til en drastisk reduksjon in størrelsen av troverdige volum i forhold til den klassiske modell. I kombinasjon med en dynamisk posisjon gjennomsnitt for alle fargestoffmolekyler medianverdien av alle troverdige volumstørrelser (ved 95%) reduseres til mindre enn 0,5 nm 3. Men disse fargestoff molekylet posteriors er ikke lenger i samsvar med deres smFRET målinger, noe som indikerer at de forutsetninger som fører til falsk strukturell informasjon. I kontrast til posteriors fastsatt i den klassiske modellen er konsistent med de fast smFRET effektivitet.
Som forutsetning av isotrop og / eller dynamisk stilling i snitt for alle fargestoffer føre til uoverensstemmelser, Fast-NPS gjør dye molekyl priors der hver farge kan tilordnes en av de fem modellene. Hver modell bruker samme tilgjengelig volum. Algoritmen for beregning av fargestoffet AVS gjør flere forutsetninger. Til å begynne med blir fluoroforen romlige form tilnærmes av en sfære. Således, en diameter tar hensyn til fluoroforen er width, høyde og tykkelse bør brukes (avsnitt 12). Videre er linkeren form tilnærmes ved hjelp av en fleksibel stang. Verdiene som presenteres i kapittel 12 ble beregnet for fargestoffet Alexa 647 festet via en 12-C linker. Til dags dato er det ikke mulig å nøyaktig bestemme a priori modell som er mest egnet, gitt en eksperimentell geometri, og således alle modeller bør testes. Generelt vil man velge den modell som gir den minst mulige størrelse bakre, mens den fortsatt er i samsvar med dataene. For å teste om et utvalg av modeller er i samsvar med smFRET data, beregner vi både bakre og sannsynligheten. Konsistens betyr at mer enn 90% av prøvene som er samlet fra den bakre er innenfor 95% konfidensintervall for sannsynligheten.
Mens det er sant at den nedre anisotropien, jo mindre er avstanden usikkerheten i et smFRET nettverk geometriske arrangementer av fargestoffmolekylene må også tas i betraktning. Således, mens representing fargestoffer med lav fluorescens anisotropi med en iso-modellen er en typisk førstevalget, gir konsistens test en mer direkte måte for å velge riktig farge modell. Det optimale valget av fargestoff-modeller kan føre til en drastisk økning i lokalisering nøyaktighet og samtidig beholde nettverkets konsistens med sine FRET-data.
For å oppsummere, gjør Fast-NPS å få strukturelle og dynamisk informasjon av store makromolekylære komplekser. I motsetning til vanlige konstruksjonsmetoder som røntgen krystallografi eller kryo elektronmikroskopi av dette gir mulighet for å overvåke meget fleksible eller forbigående komplekser, og dermed i stor grad utvider vår mekanistisk forståelse av komplekse biologiske prosesser.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.
Flowchamber preparation | |||
Customized metall sample holder | self-built | n/a | |
quartz-glass slides, 76 x 26 mm | Technical Glass Products | 26007 | |
coverslips, 60 x 24 mm | Marienfeld | 101242 | |
detergent, Hellmanex II | Hellma | 320.001 | |
ultra-pure water from Synergy UV | Millipore | 2512600 | |
Zepto plasma cleaner | Diener | n/a | |
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. | Sigma-Aldrich | A3648 | |
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | |
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | BIOTIN-PEG-SVA-5000 | |
Sodium biocarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 Sigma | |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S2127 Sigma-Aldrich | |
sealing film (Nescofilm) | Fisher Scientific | 12981805 | |
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD | Saint-Gobain Performance Plastics | 720958 | |
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) | Fisher Scientific | 12665497 | |
Neutravidin | Life Technologies | A2666 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Total internal reflection fluorescence microscope | |||
Nd:YAG Laser, 532 nm | Newport Spectra-Physics | EXLSR-532-100-CDRH | |
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso | Cobolt | 904010050 | |
diode laser 643 nm, iBeam smart | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | |
dichroic mirror, 532 RDC | Chroma | F33-540 | |
dichroic mirror, 476 RDC | Chroma | F33-476z | |
acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic | AOTFnC-VIS | |
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm | Thorlabs | LJ1703L1-A | |
plano-concave cylindrical, f = -300 mm | Thorlabs | ||
prism, PS 991 | Thorlabs | PS991 | |
focussing lens, f = 75 mm | Thorlabs | LA1608-B | |
syringe pump, PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2002 | |
2 stepper motors, Z812B | Thorlabs | Z812B | |
piezoelectric actuator, PE4 | Thorlabs | PE4 | |
IR diode laser | Edmund Optics | CPS808 | part of the autofocus system |
dichroic mirror, 775 DCXR | Chroma | 775 DCXR | |
position-sensing detector (PSD), PDP90A | Thorlabs | PDP90A | part of the autofocus system |
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 | Nikon | MRD07601 | |
dichroic mirror, 645 DCXR | Chroma | 645 DCXR | part of the emission pathway |
emission filter, 3RD550-510 | Omega Optical | 3RD550-510 | green channel in the emission pathway |
emission filter, 3RD660-760 | Omega Optical | 3RD660-760 | red channel in the emission pathway |
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV | Andor | AND-20-00032 | |
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV | Andor | AND-20-000141 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Miscellaneous | |||
Varian 50 | Cary | UV-VIS spectrometer | |
Fluorolog2 | SPEX | fluorescence spectrometer | |
Solis (V4.15) | Andor | control software for the EM-CCD camera | |
Apt user utility (V1.022) | Thorlabs | control software for the piezo-motors | |
Norland Optical Adhesive 68 | Thorlabs | adhesive | |
PC-AFN-0.8 Nile red | Kisker Biotech | avidin-coated fluorescent multispec beads | |
Matlab | Mathworks | technical computing language for custon written software | |
Origin (V9.0) | Originlab | scientific graphing and data analysis software | |
Hellma 105-202-15-40 | Hellma | 105-202-15-40 | absorption cuvette of 1 cm path length |
Hellma 105-251-15-40 | Hellma | 105-251-15-40 | fluorescence cuvette with 3 mm path length |