Introduction
Bestämma strukturen för en biomolekyl är en viktig förutsättning för att förstå dess funktion. Två väletablerade metoder för strukturbestämning är Cryo-elektronmikroskopi och röntgenkristallografi 1, 2. Idag, båda metoderna ger hög upplösning strukturinformation med en upplösning ner till Ångström nivå. Dessa två metoder har använts i stor utsträckning för att klarlägga strukturen av stora biomolekyler, såsom proteinkomplex. Även de befintliga metoderna har ständigt förbättrats under de senaste decennierna, utgör komplexiteten i biologiska strukturer fortfarande en stor utmaning för strukturbiologi, i synnerhet när stora, dynamiska och transienta komplex undersöks tre.
För att studera dynamiken i makromolekylära komplex och struktur-funktionsförhållandet i synnerhet enda molekyl metodologier har provIDed användbar information 4. Flera nya strategier utvecklades ger en ortogonal strategi för att förvärva strukturell och dynamisk information. Exempel är höghastighets AFM 5, mekanisk manipulering 6, fluorescenslokalisering mikroskopi 7, såväl som enda molekyl Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) 8, 9. Sedan ganska tidigt FRET har benämnts en molekylär linjal, på grund av avståndet beroende av längdskalan av biomakromolekyler 10.
En särskilt intressant tillämpning av smFRET är att använda avståndsinformationen som erhålls från smFRET mätningar för att härleda strukturell information 11, 12, 13, 14, 15 >, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Grund av den höga tidsupplösningen smFRET kan läget av mobila delar av en proteinstruktur vara lokaliserad. Men för att utvinna kvantitativ information från smFRET uppgifter viktiga korrigeringsparametrar om färgmolekyler måste bestämmas under mätningen 24. Med dessa korrigeringsfaktorer, kan FRET effektiviteten E FRET beräknas med hjälp av formeln
,
där jag A och jag D figur 2). Den β-faktorn står för överhörning, läckage av emissions donator in i acceptom kanalen och beräknas genom att
där jag A och jag skulle är fluorescensintensiteter av givaren och acceptormolekylen efter fotoblekning av acceptormolekylen.
Den γ-faktorn korrigerar skillnaden i de relativa effektivitet upptäckt i de två kanalerna samt skillnader i fluorescenskvantutbytet för givaren och acceptor-färgämne. Den beräknas från varje individ tidskurva efter
Notera, att denna beskrivning försummar direkt excitation av acceptormolekylen, som ibland blir viktigt och skulle behöva korrigeras för också. För att bestämma dessa korrektionsfaktorer är det lämpligt att excitera både givaren och acceptorn i en omväxlande ordning 25 för att skilja mellan foto fysiska förändringar och strukturdynamik.
För att inte bara få kvantitativa smFRET effektivitet men även kvantitativ strukturell information, var Nano-Positioning System (NPS) infördes 2008 26. Namnet valdes på grundval av sina likheter med det satellitbaserade Global Positioning System (GPS). NPS är en hybrid teknik som kombinerar smFRET och röntgenkristallografi data för lokalisering av okända färgämnes positioner i biomacromolecular komplex. crystal struktur tjänar som referensramen och de smFRET resultaten används för att erhålla avståndsinformation mellan en okänd fluorofor position (antenn) och ett läge känt från kristallstrukturen (satellit). I rad experiment avstånden mellan antennen och flera satelliter mäts och positionen för antennen bestäms med hjälp av en statistiskt noggrann analys system baserat på Bayesian parameteruppskattning. Som ett resultat, är inte bara den mest sann positionen av antennen beräknas, men dess fullständiga 3D osäkerhet fördelning, den så kallade bakre, visualiserades genom trovärdiga volymer. Dessutom var NPS utvidgas för att möjliggöra analys av kompletta smFRET nätverk 27.
NPS har använts för att lösa ett antal viktiga frågor i eukaryot transkription, nämligen loppet av den uppströms belägna DNA: t, den icke-mall-DNA och den begynnande mRNA inom töjning co RNA-polymeras IImplex 12, 28, även visar effekten av transkriptionsinitiering faktorer 26 och den dynamiska arkitektur av en öppen-promotor komplex 29. Dessutom var NPS används för att belysa strukturen hos archaeal RNA-polymeras öppen komplex 30 och i synnerhet läget för transkriptionsinitiering faktor TFE, som konkurrenskraftigt binder till samma plats som transkriptionsförlängningsfaktor Spt4 / 5 31.
Sedan dess har ett antal smFRET baserade strukturella metoder publicerats 15, 18, 21, 23. När man jämför olika smFRET baserade strukturella metoder, blir det tydligt att den uppenbara precisionen av metoden är mycket beroende av det särskilda valet av färgämnesmodeller. Man bör notera attfärgmolekyler kan uppvisa olika rumsliga och orienterings beteende beroende på deras närmiljö.
För detta ändamål var snabb-NPS infördes 32. Snabb NPS använder en avancerad provtagning algoritm minska beräkningstider drastiskt. Dessutom tillåter snabb-NPS en att utföra en strukturell analys och för varje färgämne molekyl kan användaren välja från en uppsättning av fem olika färgmodeller som kommer att beskrivas härnäst. Den mest konservativa modellen kallas klassisk, förutsätter att färgämnet endast upptar en, men okänd, läge. Vid denna position, kan fluoroforen rotera fritt inom en kon, vars storlek bestäms från dess respektive (tidsberoende) fluorescensanisotropi. Orienteringen av könen är inte känt, vilket leder till stora osäkerheter vid konvertering uppmätta smFRET effektivitet i avstånd. I detta avseende är konservativa modellen, eftersom det kommer att leda till den minsta precision jämfört med den andra färgämneslägels. Endast för mycket korta sträckor bör de antaganden som gjorts av den klassiska modellen leder till en märkbart felaktig positionsbestämningen. För typiska smFRET värden, är den korrekta positionen alltid inneslutna i den jämförelsevis stora trovärdig volym.
Eftersom en högre precision är önskvärd, är det viktigt att utveckla och testa alternativa färgmodeller, vilket kan bidra till att förbättra precisionen. Om färgämnet roterar mycket snabbare än dess inneboende fluorescenslivstid, kan den så kallade ISO-modellen tillämpas. Här, orienteringsfaktorn K 2 (som behövs för att beräkna den karakteristiska isotropiska Förster radie 
) Är inställd på 2/3. Som ett resultat, de beräknade trovärdiga volymerna är nästan två storleksordningar mindre jämfört med dem i den klassiska modellen 32. I det fall att fluoroforen förekommer i en miljö som gör det möjligt inte bara snabbt reorisentation, men dessutom fast motion hela dess tillgängliga volym bör meanpos-iso modell användas. I denna modell, färgämnet effektivt upptar bara en genomsnittlig läge, där den spatiala medelvärdes utgörs av ett polynom avstånd omvandling 15. Denna modell gäller om till exempel den (allmänt hydrofoba) färgämne är fäst vid ett hydrofilt område, t.ex., DNA: t. Tillämpning av meanpos-ISO-modellen leder till en ytterligare reduktion av storleken av de trovärdiga volymerna med en faktor av cirka två. Däremot kan ett färgämne kopplad till ett protein binder reversibelt till flera hydrofoba fläckar i dess steriskt tillgängliga volymen (AV). En fluorofor som omedelbart växlar mellan dessa områden, men inom en region genomgår fri rotation och snabb lokal rörelse beskrivs bäst av VAR-meanpos-ISO-modellen. För en liknande situation i vilken färgämnet är inte fri att rotera VAR-meanpos modell tillämpas. mer d etails om dessa modeller kan hittas i vår senaste publikation 32.
Dessa modeller ger en omfattande repertoar att specifikt redogöra för de olika miljöerna ett färgämne som kan uppstå och tillämpa dem på ett klokt sätt optimerar dess lokalisering precision. I Snabb-NPS varje färgämnesmolekyl fäst till en specifik position kan tilldelas en enskild modell, så att FRET-partner får ha olika modeller. Detta möjliggör obegränsad och nära till naturen modellering. Det är dock viktigt att man utför rigorösa statistiska tester för att säkerställa att det uppnådda resultatet av den slutliga modellen kombinationen är fortfarande i överensstämmelse med de experimentella data. Dessa tester ingår i Fast-NPS programvara.
För att tillämpa Snabb NPS till experimentella data krävs mätning av (endast) tre inparametrar. För det första färg par specifika isotropisk Förster radier (/54782/54782eq5.jpg "/>) Har inte fastställts. Därför kvantumutbytet (QY) för donator-färgämnet, donatorfluorescensemissionsspektra och acceptorn absorptionsspektra behöver mätas. Kan Dessa mätningar utföras i bulk, med användning av en standard-spektrometer och en standardfluorescensspektrometer. för varje par, är R 0 sedan beräknas med hjälp av freeware PhotochemCAD och kan användas i NPS-analys. Dessutom är de (tidsupplöst) fluorescens anisotropier av färgämnesmolekylerna behöver erhållas med hjälp av en polarisering (och tid) känslig fluorescensspektrometer. Men de viktigaste ingångsparametrar för snabb-NPS är smFRET effektivitet mäts på en enda molekyl fluorescensmikroskopi installation, såsom en total inre reflektion fluorescensmikroskop (TIRFM) .
Här presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för att erhålla smFRET uppgifter och tillämpa Snabb NPS (Figur 1).
Protocol
1. Förutsättningar och Lab Equipment
OBS: Monteringen av mätkammaren är avbildad i figur 3. Sandwich-konstruktion av mätkammaren består av tre huvudkomponenter: en kvartsglas (kvarts) glid, en tätningsfilm och en täck som tätar flödet kammaren. Mätkammaren är monterad på en anpassad provhållaren. Dimensionerna hos provkammaren och metallhållaren är inriktade för att passa till en standard mikroskopi kvartsglas (76 mm x 26 mm).
- Skuren kvartsglasskivor med hjälp av en diamantborr (0,75 mm) vid positioner som visas i figur 4. Utformningen av kvartsglas är asymmetrisk för att skilja mellan de två sidorna av varje bild.
OBS: Kvarts glider kan återanvändas efter mätningen tills ytan blir repad. - För att montera kamrarna, använda anpassade prov metall hållare som visas i figur 5 </ Strong>. provhållare De innehåller två trådar (M4) för att ansluta ett inlopp och ett utlopp slang för flödet kammaren. Vidare använder gängor (M3) för att montera provkammaren på metallhållaren samt gängor (M3) för att fixera prisma hållare på att den nedre halvan av metallhållaren.
- Utför smFRET mätningar på ett prisma typ total inre reflektion fluorescensmikroskop (TIRFM) (Figur 6).
OBS! TIRFM har tre lasrar: en grön (532 nm, Nd: YAG-laser) och en röd laser (643 nm, diodlaser) för excitering av givaren och acceptor färgmolekyler samt en blå laser (491 nm , diodpumpad fastatillståndslaser) för blekning av bakgrunden fluorescenta orenheter på provkammaren före smFRET mätningen. De tre laserstrålar är rumsligt kombinerad och kan väljas via en akustisk-optisk avstämbara filter (AOTF). Fluorescens ljus samlas in av en hög målsättning öppning, uppdelad i en donator och en accepteraeller kanal med hjälp av en dikroisk spegel och projiceras på två EM-CCD-kameror. Provkammaren är fäst till en mikrometersteget tillåter rörelse i x- och y-riktningen med två stegmotorer. En tredje piezo motor används tillsammans med en IR-laser och en positionskänslig detektor för att bygga en autofokus för att säkerställa optimal fokus genom hela experimentet.- Använd alternerande laser excitation (ALEX) när dynamiken i FRET tids banor observeras 25. Sådana dynamik kan orsakas av antingen konformationsförändringar inom molekylerna eller genom variationer i acceptor ljusstyrka och acceptor blinkande.
OBS: ALEX möjliggör diskriminering mellan dessa två möjliga orsaker och förhindrar feltolkningar av dynamiska FRET banor. Men för enkelhetens skull, är protokollet del begränsad till analys av filmer tagna utan ALEX.
Varning: Klass 3B laser används i enda molekyl fluorescens setup. Säkerställa att tillräcklig laser säkerhetsåtgärder, enligt lokala statliga regleringar, har tagits innan systemet används.
- Använd alternerande laser excitation (ALEX) när dynamiken i FRET tids banor observeras 25. Sådana dynamik kan orsakas av antingen konformationsförändringar inom molekylerna eller genom variationer i acceptor ljusstyrka och acceptor blinkande.
- Utför absorptionsmätning används för bestämning av kvantutbytet på en UV-VIS-spektrometer (se Material och Metoder).
- Utför mätningen av donatorfluorescensemissionsspektrum, acceptorn absorptionsspektrum och fluorescens anisotropi på en fluorescensspektrometer (se Material och Metoder).
- Bered provkammare enligt publicerade förfaranden 33. Alternativt det förfarande som beskrivs i [34] kan användas.
- Märka de undersökta proverna med ett donor-acceptor-färgämnesmolekyl par lämpade för smFRET och se till att det finns en biotindel för immobilisering på ytan av provkammaren.
OBS: För att lokalisera en okänd antenn färgämne läge med Fast-NPS programvara olika prov konstruktioner behövs. Varje konstrukt nEEDS att ha en etikett på det okända antennfärgläge och en etikett på en satellitposition känd från kristallstrukturen. Åtminstone tre olika konstruktioner med färgämnen bundna till antennens position och tre olika satellitpositioner krävs för korrekta resultat. Mätningar mellan antenner samt mellan satelliter är också användbara för att förbättra noggrannheten, kräver dock detta utbyte av färgämnesmolekyler som måste vara korrekt in i analysen.
2. Montering av Flow Chambers i en anpassad hållare
- Pull silikonrör (0,8 mm ID, 2,4 mm YD) in i flik ihåliga skruvar (M4) och kapa röret på båda ändar raka lämnar ett överhäng på 1 cm på båda sidor genom att använda ett vasst rakblad. Justera överhäng av slangen till ca 2 mm på en sida av fliken skruven.
- Montera flödeskammaren in i provhållaren på ett sätt som hålen i kvartsglas matchar gängorna i provhållaren. Spännainlopps- och utloppsskruvar försiktigt för att säkerställa att inloppet och utloppet hos provkammaren är fortfarande penetrerbart. Försiktigt åt de fyra skruvarna på akrylglashållaren för att fixera positionen av flödet kammaren.
- Klipp silikonslang (0,58 mm ID, 0,96 mm OD) i 20 cm långa bitar. Sätt en av bitarna till inlopp och utlopp skruv mätkammaren. Stänga slangen inloppet och utloppet genom att använda en klämma.
OBS: De hopsatta provkammare kan lagras vid rumstemperatur under upp till två veckor.
3. smFRET Mätning på TIRF mikroskop
- Använda en spruta för att tvätta provkammaren med 500 mikroliter PBS. Förhindra att luftbubblor kommer in i provkammaren vid alla tidpunkter genom att skapa en droppe i slutet av inloppsslangen före byte till en annan buffertlösning.
- Spola provkammaren med 100 mikroliter neutravidin (0,5 mg / ml i PBS) lösning och inkubera 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tvättaut neutravidin lösning med 500 mikroliter PBS.
- Skruva metallhållaren för prismat på provkammaren.
- Montera provkammaren till mikrometer skede av TIRF-mikroskop. Se till att montera provkammaren horisontellt så rakt som möjligt framför målet att undvika oskärpa under skanningen.
- Starta mjukvaran som styr de EM-CCD-kameror och mjukvaran för styrning av de piezo-motorer av scenen.
- Justera fokus mikroskop målet genom att titta på reflektioner av IR-laser.
- Placera prismat (PS991, n = 1,52) på toppen av metallprismahållaren. Justera den laterala positionen för prismat för att säkerställa att laserstrålarna träffade prismat sedan använda ett lim och inkubera med UV-ljus under 5 min.
OBS: Monterad prisma kan återanvändas genom rengöring. - I kamerakontroll programvara klicka på "Setup Acquisition" och definiera följande förvärvsparametrar: 100 ms INTEGRATion tid, 401 bilder / film (grön kamera), 400 ramar / film (röd kamera), elektron multiplikator vinna 225, pre-förstärkningen 5x och avläsningshastighet 3 MHz vid 14 bit.
- Skapa en mapp på den lokala hårddisken för mätningen. Välj önskat namn för mätfiler, t.ex. år-månad-dag. I programvaran inställningar gå till "Auto-Save" ryttare, aktivera "Auto spara" och välj filformat * .sif för film förvärv. Välj den mapp på hårddisken. Använd mappnamnet som filestem.
- Aktivera "AUTOINCREMENT" -funktionen (inställda startvärdet till 1). Aktivera fastsättning av en operatör till filnamnet. Använd "DON" och "ACC" för givaren och acceptorn kanalen, respektive. Välj "_" som separator.
- I programmet klickar kamerakontroll på "Video" för att starta den levande bilden av kameran och blekmedel bakgrundsfluorescens genom att skanna provkammaren med hjälp av maximal laserintensitet av alla tre lasrar (KOMkombinerade ≈3,000 W / cm2 under 10 s per synfält).
- Stäng av blå laser. Minska intensiteten av den gröna lasern till omkring 200 W / cm2 och till cirka 40 mW / cm 2 för röd laser om alternerande laser excitation (ALEX) används.
- Späd den biotinylerade fluorescerande provet till en koncentration av 50 till 100 pM. Belastning 100 mikroliter av lösningen. Provet är immobiliserad på kammarytan vid bindning.
OBS: Se till att inte överbelasta kammaren. Grann molekyler måste separeras från varandra. - Om så är nödvändigt, läsa in ytterligare 100 mikroliter av en 2x mer koncentrerad provet till kammaren.
- Täta slangen av mätkammaren med hjälp av klämmor efter lastningen är avslutad inlopp och utlopp.
- Släck lasrar och använda piezo-motorer för att flytta flödet kammaren två synfält ytterligare.
- I kamerakontroll programvara klicka på "Take signal" för att starta filminspelning och switchpå lasern samtidigt. Se till att mer än 80% av molekylerna är blekt av slutet av filmen genom att justera lasereffekten.
- Upprepa steg 3,17 och 3,18 för hela förblekt provkammarområdet.
4. Förvärv av Transformation Map ( "beadmap")
- Förbered en flödeskammare som beskrivs i avsnitten 1.1, 1.2 och 2.
- Använd avidinbelagda fluorescerande multispektrala pärlor som visar fluorescensemission hos givaren och acceptorn kanalen. Vortex beståndet under 1 minut, sedan späd 50 mikroliter av beståndet i 50 mikroliter DDH 2 O. Vortex igen under 1 minut, låt ligga 1-2 minuter, sedan virvel ytterligare 10 sekunder.
- Utför steg som beskrivs för smFRET mätningar (§ 3,5-3,10).
- Belastning 100 mikroliter (en kammarvolym) av 1: 2 utspädning fluorescerande pärlor i flödet kammaren. Vänta 10 min för de fluorescerande pärlor för att binda till ytan.
- Använd förvärvsparametrar 3,9 men change filmlängden till 26 (grön kamera) och 25 (röd kamera) och elektron multiplikator vinst till 10.
- Ställa in intensiteten av den gröna lasern till ett värde av 20 W / cm 2.
- Ta en film på ett synfält med ca 50-100 pärlor.
5. Bearbetning och analys av smFRET Data
- Använd anpassat program skrivna programvara SM FRET för analys av beadmap (se Material och Metoder) och de förvärvade filmer. Starta programmet viewPlot1.m.
- Klicka på Analys | Batch Analysis, avmarkera alternativet "Alex" om det inte har använts. För bästa prestanda välja tröskeln för topp fynd "hög". Tryck på "OK".
- Välj "NO" på frågan om en beadmap har redan analyserats. Bläddra den mapp som innehåller det förvärvade beadmap och välj * .sif fil (genom att dubbelklicka på den). I nästa dialogruta tryck på "OK".
OBS: Om en beadmap redan har analyserats i en tidigare åtgärdning, välj "YES" här och välj den sparade beadmap genom att bläddra till rätt mapp och dubbelklicka på beadmap * .map fil. Fortsätt med steg 5,8. - Välj två enkla pärlor placerade i motsatta hörn av synfältet. Intensitetpixel är färgkodade från mörkblå (låg intensitet) till mörkröd (hög intensitet).
- Klicka på mitten av den första strängen. Om mitten av molekylen kan lokaliseras tydligt av färgkodning, välj "JA" annars klicka på "NEJ" och välj en annan molekyl par.
- Placera hårkorset på pixel visar maximal intensitet och tryck på "KEEP". Upprepa processen med den andra kanalen.
- Klicka på molekylen i motsatt hörn och upprepa steg 5,5 och 5,6.
OBS: Den relativa pixel förskjutning av de två kanalerna visas i kommandofönstret och omvandlingen kartan sparas automatiskt som * .map fil i mappen som innehåller beadmap * .sif fil <./ Li> - För att ladda givaren och mottagaren filmer (* .sif) för "parti analys", bläddra till mappen, markera alla filmer som ska analyseras och klicka på "OK". I fönstret nästa dialog, tryck på "OK".
OBS! Parti analys är klar när den sista körfält visas i kommandofönstret börjar med "Färdig analysera ...". De detekterade molekylerna visas i ett nytt fönster, som också anger den relativa förskjutning av givare och acceptor kanalen bestäms av transformations kartan. - Att läsa de satsvis filmfiler klicka på Arkiv | Load. Avmarkera alternativet "Alex" om det inte har använts. Ställa in smoothwidth till 10 och klickar på "OK". Välj den mapp som innehåller de * .ttr filer och klicka på "Välj alla" och "OK" i nästa snabbmenyn.
- Om det visade spår har de karakteristiska smFRET faserna (Figur 2) Tryck på växlingsknappen "Ej vald" och förstvälja tidpunkt för början av FRET händelsen genom att flytta linje med muspekaren och klicka på vänster musknapp. Nästa välja tidspunkten för blekning av acceptormolekylen och slutligen tidspunkten för blekning av donatormolekylen.
- I nästa fönster FRET effektivitet är plottad i blått. För att välja spår genom att trycka på knappen "Ja" annars väljer du "Nej". För att åter få tillgång till en tidskurva klicka på "Föregående" -knappen.
- Upprepa proceduren tills den sista molekyl av filmen.
- Efter att ha analyserat den sista molekylen i en film spara den valda spår genom att klicka på "Arkiv | Spara". Spara valda spår i samma mapp som * .sif filer.
- Upprepa steg från 5,10 till 5,13 för samtliga förvärvade filmer.
- Kör programmet combine_fret_results.m. Välj den mapp som innehåller * RES-filer och alla * .FRETonly_trace filer. Spara molekyl-wise FRET och ram-wise FRET filer som MW.dat ochFRW.dat, respektive.
OBS! * DAT filerna sparas som ASCII-filer. Den FRW.dat filen innehåller sex kolumner och en rad för varje FRET-ram. Den sjätte kolumnen innehåller den korrigerade ram-wise FRET effektivitet. Den MW.dat filen innehåller 21 kolumner och en rad per valda FRET-molekyl. Den tredje kolumnen innehåller molekylen visa FRET effektivitet.
6. Visar smFRET data i histogram
OBS: För att extrahera den genomsnittliga smFRET effektiviteten av alla registrerade smFRET data frame-wise uppgifter eller molekylvisa data plottade i histogram och analyseras med hjälp av Gauss passar till (flera) toppar. I det följande använder protokollet en kommersiell dataanalys programvara (se Materials List). Däremot kan någon annan tillgänglig programvara användas i stället.
- Öppna en dataanalysmjukvara (se Materials List). Klicka på Arkiv | Importera | multipel ASCII. Välj den mapp som innehåller FRW.dat filen. Markera filen och tryck på "OK & #34 ;. Acceptera inmatningsalternativ med "OK" utan en förändring.
- Välj den tredje kolumnen C (Y) som innehåller de korrigerade FRET effektivitet, högerklicka på kolumnen och välj Plot | Statistik | histogram. I histogrammet fönstret dubbelklicka på kolumnerna och avmarkera "automatisk binning" och välj en önskad bin-format, till exempel, 0,05. Också välja start- och slutvärden, t.ex. -0,025 och 1,025.
- Välj kolumnerna i histogrammet genom att vänsterklicka på dem. Högerklicka och välj "gå till Bin Blad". Välj "Counts" -kolumnen genom att vänsterklicka på den och sedan högerklicka och välj Plot | Kolumn / Bar / Pie | Column.
- I kolumnen bar tomten gå till Analys | Montering | Nonlinear kurvpassning | dialogrutan Öppna. Välj "Gaussian" under funktion sedan gå till "Parameter" ryttare. Avmarkera auto parameter initiering. Fäst offsetvärde (y0) på 0. Klicka på "Fit".
OBS: passform funktion liksom montering desvansar visas nu i kolumnen tomt. Värdet "xc" ger mitten av passformen funktion, dvs medelvärdet FRET effektivitet som tjänar som ingångsparameter för NPS-programvaran.
7. Mätning av Quantum Yield
- Utföra kvant bestämning utbyte med den relativa metod som liknar den procedur som beskrivits av Würth et al. 35, med hjälp av Rhodamine 101 upplöst i etanol (QY = 91,5%) som en standard.
- Spela absorptionsspektra vid en UV-VIS-spektrometer med hjälp av en 80 mikroliter volym i en absorption kyvett på 1 cm väglängd. Absorbansen vid den våglängd, som kommer att användas för fluorescensexcitation måste ≤ 0,05.
- Spela emissionsspektra på en lampa kalibrerad spektrometer drivs i fotonräknande läge. Utför mätningarna med Glan-Thompson polarisatorer i excitation (0 °) och utsläpp (54,7 °) bana (magiska vinkelförhållanden) med en Spectr al bandbredd av ca 5 nm och 2,5 nm för excitation och emissionsmonokromatorn, respektive. Mät prover efter att överföra dem till en fluorescens kyvett med 3 mm banlängd noga med att räkna hastigheten inte överstiger 10 6 s -1.
- Beräkna kvantutbyte enligt
där n och n Std är brytningsindex för lösningsmedlet av provet och standard, respektive. f (λ) och f_Std (λ) är fluorescensintensiteterna av provet och av standard vid våglängden λ. A (λ ex) och A std (λ ex) är absorbansen för provet och referens vid exciteringsvåglängden och Φ std är kvantumutbytet av standarden.
le "> 8. Beräkning av den isotropiska Förster Radius- Beräkna den isotropa Förster radie (
) Från emissionsspektrumet för donatormolekylen, absorptionsspektrum för acceptormolekylen, kvantumutbytet av donatorn och brytningsindex för mediet. Använd freeware PhotochemCAD för beräkning av . Men någon annan tillgänglig programvara kan användas i stället 36.
) Från emissionsspektrumet för donatormolekylen, absorptionsspektrum för acceptormolekylen, kvantumutbytet av donatorn och brytningsindex för mediet. Använd freeware PhotochemCAD för beräkning av 9. Mätning av anisotropier
- Bestäm steady-state fluorescens anisotropies från inspelningar av fluorescensspektra med olika polariserings inställningar excitation / emissions (V / V, V / H, H / V, H / H) 36.
- Beräkna G-faktor, som korrigerar för polariserings artefakter av instrumentet för varje våglängd frånförhållande
och använda den för att beräkna anisotropivärde för varje våglängd:
där jag xy indikerar intensiteten för excitation polarisering x och emissions polarisering y.
- Genomsnitt värdena över utsläpp spektralområdet för att beräkna steady-state fluorescensanisotropi.
10. Installation Fast-NPS Software
- Hämta UCSF Chimera från http://www.cgl.ucsf.edu/chimera och följ installationsanvisningarna.
- Gå till webbplatsen för "Institute of biofysik"vid Ulm University: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Ladda ner den senaste versionen av Snabb NPS och extrahera den till en mapp val. Öppna underkatalogen "Vidaredistribuerbar" och installera Visual C ++ Redis som är lämpligt för systemet.
11. Centre PBF fil
- Öppna PBF fil (er) av intresse i Chimera. Välj alla atomer i makromolekylära komplex och beräkna koordinaterna för tyngd (Verktyg | Strukturanalys | Yxor / Planes / centroids | Definiera tyngd ... | Ok).
- Öppna svar Log (Favoriter | Svara logg) och Transformation Tool (Verktyg | Movement | Trans koordinater). Ange koordinaterna för tyngd visas i svaret Logga in på textrutan "Shift" av Trans koordinater fönstret och ändra tecken för varje koordinat. Tryck på "Apply" och spara filen med "Save PDB" (Arkiv | Spara PBF).
12. Inställningbefattningen Priors
OBS: Alla värden räknas i Ångström.
- Starta tekniska beräkningar språk och ändra den aktuella mappen till den lokala Snabb NPS mapp. Ange i kommandofönstret: FastNPS.
- Skapa en ny jobfile i Projektledare (Project | Ny).
- Ställ in läget före (Verktyg | Model färgämne före).
- I panelen "tidigare basics" definiera den rumsliga upplösningen av läget innan genom att ange dess värde (2 rekommenderas).
- Uteslut det inre av makromolekyl med kryssrutan aktivera och klicka på "last PDB" -knappen. Välj och ladda centrerade PBF fil som beskrivs i avsnitt 11.
- Ange den ungefärliga diametern (13a rekommenderas, se diskussion) av färgämnet genom att ange dess värde.
- Ange ett skeletonization avstånd, dvs avståndet färgämnesmolekylen kan tränga in i makromolekylen (två Å rekommenderas).
- ipanel "maximal tidigare storlek" anger de minimala och maximala koordinaterna för positionen före (rekommenderas: x i [-150.150] yi [-150.150] och zi [-150.150]).
- När man definierar en satellit, aktivera kryssrutan "attachment via flexibel linker" i panelen "tidigare basics" och anger i panelen "linker" koordinaterna för atom (i det centrerade PDB fil) vid vilken färgämnesmolekylen är fäst. Vidare ange längden och diametern av linkern genom att ange deras värden (13 Å och 4,5 Å rekommenderas, se diskussion). I händelse av en antenn hoppa över denna punkt.
- Tryck på knappen "beräkna tillgänglig volym".
- Spara läget före och eventuellt exportera den för visualisering ändamål med hjälp av programvara som Chimera.
13. Definiera nätverks geometri
- Öppna Definiera mätfönstret (Mode | Edit geometri).
- Skapa en ny färgämnesmolekyl genom att trycka på buttpå "Ny" i panelen "Färgämnen".
- Sätta sin fluorescensanisotropi (§ 9) genom att ange ett värde och välj en färgmodell inom rullgardinsmenyn "Dye modell".
- Tryck på knappen "Load", välj motsvarande position före och kontrollera Aktivera kryssrutan för färg. Upprepa denna procedur för alla färgämnen, det vill säga för alla antenner samt för alla satelliter.
- När du har skapat alla färgämnen, definiera mätningarna. Skapa en ny mätning genom att klicka på "Ny" i panelen "Mått".
- Välj sina FRET partner i rullgardinsmenyerna "Dye1" och "Dye2" nedan.
- Ange smFRET effektivitet med fel och isotropiska Förster radie denna färg par.
- Slutligen, kontrollera Aktivera kryssrutan för mätningen. Upprepa denna procedur för alla mätningar.
OBS: Ofta nätverket blir allt mer komplexa, så att användaren kan bli förvirrad. I syfte att Prevent misstag, kontrollera nätverks visuellt genom att trycka på "Check Network" -knappen. Figuren visar de aktiverade färgämnen och visar mätningar via ledningar förbinder FRET färgämnen.
14. Beräkning
- Öppna Beräknings Window (Mode | Beräkning).
- Om varje färgämne i nätverket har en specifik modell tilldelad, välj "Användardefinierad" och starta beräkningen genom att trycka på "Beräkning". Att ha alla färgämnen i samma modell, välj en av de fem modeller (klassisk, iso, meanpos-iso, Var-meanpos-iso och Var-meanpos) och fortsätter.
OBS: Fönstret kommandot anger utvecklingen av beräkningen. Snabb NPS kommer att göra det med en pop-up-meddelande, när beräkningen har avslutats.
15. Visualisering av resultat
- För att exportera trovärdiga volymer färgämnena, öppna vyn resultatfönstret (Modell | Visa resultat).
- Export färgämnes densiteter:
- Exporterafärgämnen var för sig eller alla samtidigt. För att exportera en enda färg väljer du den i panelen "Visade Färgämnen" och tryck på "Export densitet". Ange en upplösning (två rekommenderas) och välj en filtyp för export. På höger densiteten förhandsvisas och några av dess matematiska egenskaper är visade.
- För att exportera alla färgämnen tryck samtidigt "Batch Export".
- Öppna täthet filer i Chimera.
16. Konsekvens Kontroll av valda modellen Kombination
- Öppna Visa resultat Window (Modell | Visa resultat). Om i panelen "Beräkning Info" textrutan "Konsekvens" visar ett värde lägre än 90% den nuvarande modellen inte representerar de uppmätta smFRET effektivitet tillräckligt och är därför inkonsekvent.
- Vid inkonsekvens tryck på knappen "Detaljerad Konsekvens". Sök efter de mätningar som har ett värde under 90%. Om en eller flera färgs är övervägande involverade i dessa mätningar, deras modeller kommer sannolikt att orsaka inkonsekvens. Överväga olika färgmodeller för dessa färgämnen och kör Fast-NPS beräkning.
Representative Results
Transkription är det första steget i genexpression i alla organismer. I Archaea, är transkription utförs av en enda RNA-polymeras (RNAP). Jämfört med eukaryoter bär archaeal RNAP en slående strukturell likhet med de eukaryota motsvarigheter samtidigt ha en enklare transkriptionsmaskineriet. Således kan Archaea användas som ett modellsystem för att studera eukaryot transkriptionsinitiering genom RNA-polymeras II (Pol II). Nyligen har den fullständiga strukturen för archaeal RNA-polymeras öppen komplex har bestämts från enkel-molekyl FRET och NPS. Data från NPS analys användes för att bygga en modell av hela archaeal öppna promotor komplex, vilket ger användbara insikter i mekanismen för transkriptionsinitiering.
För att klargöra denna struktur var smFRET effektivitet mäts mellan okända antennfärgmolekyler belägna inom den öppna promotor comPlex och flera kända satellit färgmolekyler som införlivats i fem referenspunkter i RNAP, vars positioner är kända från kristallografiska strukturer (PDB-ID: 2WAQ) 37. Antenn färgämnen fästes till endera av olika positioner på icke-mall-DNA, TFB, TBP eller TFE. Den kompletta nätverk som används i denna studie bestod av mer än 60 uppmätta avstånd.
Figur 7 visar en modell av hela archaeal öppna promotor byggt från NPS analys. Det består av dubbelsträngad promotor DNA (ljus och mörkblått), RNA-polymeras (grå) och transkriptionsstartfaktorer TBP (lila), TFB (grön) och TFE (gul). Modellen lagras med resultaten från NPS analys, trovärdiga volymer, som beräknades med hjälp av den klassiska modellen (A), ISO-modellen (B), den meanpos-ISO-modellen (C), VAR-meanpos-ISO-modellen (D) och VAR-meanpos modell (E).
Figur 1: Workflow av förvärv och bearbetning av de parametrar som behövs för Fast-NPS beräkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på fluorescensintensitet tidskurva för en smFRET händelse. Fluorescensintensiteterna hos givaren (grön) och acceptormolekylen (röd) som visar de tre karakteristiska faser, nämligen I: smFRET, II: donator fluorescens efter acceptor fotoblekning, III: bakgrundsfluorescens efter donatorfotoblekning.g2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk illustration av flödeskammare för smFRET experiment. Flödet kammaren är monterad på en anpassad metallhållare med akrylglashållare. Sandwich-konstruktion av flödeskammaren innefattar ett kvartsglas (kvarts) glider med två hål för att fästa in- och utloppsslangen, en tätningsfilm och ett täckglas som stänger flödet kammaren. Prismat för TIRF belysning är monterad på den nedre halvan av flödeskammaren. fliken ihåliga skruvar ge inloppet och utloppen för flödet kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Framställning av kvartsglasplatta och tätningsfilmen. Mekanisk ritning av kvartsglas som anger positionerna för hålen (i millimeter). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Mekanisk ritning av flödet kammaren. Åtgärderna för aluminiumprismahållaren, akrylglashållare och aluminium monteringsram ges i millimeter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
igure 6 "src =" / filer / ftp_upload / 54.782 / 54782fig6.jpg "/>
Figur 6: Schematisk illustration av prisma typ TIRF inställning används för smFRET experiment. Förkortningar för optiska komponenter: A, bländare; DM, dikroisk spegel; F, emissionsfilter; L, lins; M, spegel; O, objektiv; P, prisma; PSD, lägeskänsliga fotodiod; S, prov; PS, positioneringssteget; T, teleskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Simuleringsresultat för de olika modellantaganden. Alla bilder visar archaeal RNA-polymeras (PDB-ID: 2WAQ, ovanifrån) tillsammans med modellen för promotor-DNA (tDNA och ntDNA i blått och cyan, respektive), TBP (lila), TFB (grön) och TFE (gul)i archaeal öppna komplexa 30. De trovärdiga volymer lagras för NPS simuleringsresultat av (A) den klassiska modellen, (B) ISO-modellen, (C) den meanpos-ISO-modellen, (D) VAR-meanpos-ISO-modellen och (E) det var -meanpos modell. Alla volymer visas vid 68% trovärdighet. Den klassiska och VAR-meanpos nätverk är förenliga med de smFRET data. I motsats nätverk där alla färgämnen iso, meanpos-iso eller VAR-meanpos-iso modell väljs är oförenliga med mätdata. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi presenterar installationen och experimentell procedur för att exakt bestämma FRET effektivitet mellan färgämnen fästa via flexibla linkers till biomakromolekyler, det vill säga, nukleinsyror och / eller proteiner.
För att säkerställa exakta smFRET mätningar (avsnitt 3), är det viktigt att utesluta luft från flödet kammaren när som helst under mätningen. Dessutom, se till att inte överbelasta flödet kammaren med fluoroforer. Fluoroforema måste vara klart åtskilda för att säkerställa korrekt analys. Som smFRET par, som inte uppvisar blekning av givaren måste uteslutas från analysen, se till att> 80% av molekylerna i synfältet bleks i slutet av filmen. Att ta hänsyn till inhomogeniteter i provet den β-faktorn och γ-faktorn, korrigera de överhörn och relativa detektions effektiviteter av givaren och acceptorn kanal, respektive, beräknas för varje FRET para ihop individuellt.
För mätningarna på fluorescensspektrometer (§§ 7 till 9) en bra kompromiss mellan signalstyrkan och den spektrala upplösning av de registrerade uppgifterna måste hittas. För detta ändamål de slitsar i excitations- och emissionsvägen för den fluorescensspektrometer måste anpassas beroende av det instrument som används och provkoncentrationen.
Dessutom presenterar vi Fast-NPS analysmetod för att erhålla strukturell information övergående eller dynamisk MACROMolecular komplex. NPS har tillämpats för att avslöja banan för den icke-templat-DNA-strängen och positionen för transkriptions initieringsfaktorer i archaeal RNA-polymeras öppen komplex. Använda nätverk av mer än 60 olika avståndsmätningar, visade vi att Snabb NPS, utrustad med en nyligen genomfört provtagning motor (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. under utarbetande), minskar den tid som behövs för analys av denna komplexa smFRET nätverk genom ≈2 tiopotenser, jämfört med den ursprungliga globala NPS metod 27. Algoritmen robusthet har sina rötter i en sampler Metropolis-i-Gibbs kombination med en parallell anlöp system. Snabb NPS visar exakt reproducerbarhet av nätverksresultat och är i linje med resultat publicerade tidigare 30.
Flera olika metoder har publicerats i syfte att härleda strukturell information från smFRET mätningar 11 upp>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Alla dessa metoder ger endast en viss färg modell. Således, färgämnen, som inte uppfyller de antaganden som gjorts av respektive modell kan inte användas eller leda till felaktiga strukturell information. Snabb NPS, tvärtom, gör det möjligt att välja för varje färgämne molekyl en annan modell. Detta bidrar till att redogöra för olika konformationsbeteende av båda, färgämnesmolekylen i sig, liksom den linker som används vid fastsättningen. De lokala molekylära omgivningarna färgämnesmolekylen, liksom dess fysikaliska egenskaper kommer att avgöra vilken modell som är mest lämpligt.
För det analyserade smFRET nätverk av archaeal inledande komplexa, en isotrop antagande för alla färgmolekyler leder till en drastisk minskning in storleken på de trovärdiga volymer jämfört med den klassiska modellen. I kombination med en dynamisk ställning i genomsnitt för alla färgmolekyler medianen av alla trovärdiga volymstorlekar (95%) minskar till mindre än 0,5 nm 3. Emellertid dessa färgämnesmolekyl posteriors inte längre överensstämmer med deras smFRET mätningar, vilket indikerar att de antaganden görs leda till falska strukturell information. I motsats därtill posteriors bestämda i den klassiska modellen är i överensstämmelse med de bestämda smFRET effektiviteter.
Eftersom antagandet av isotropiska och / eller dynamisk ställning i genomsnitt för alla färgämnen leda till inkonsekvenser, Snabb NPS kan färgämnesmolekylen priors där varje färgämne kan tilldelas en av de fem modeller. Varje modell använder samma tillgängliga volymen. Algoritmen för beräkning av de färgämnes AVs görs flera antaganden. Först är fluoroforen rumsliga form approximeras med en sfär. Således, en diameter med hänsyn tagen till fluoroforen s width, höjd och tjocklek ska användas (12 §). Vidare är linkern s formen approximeras med en böjlig stav. De värden som presenteras i avsnitt 12 beräknades för färgämnet Alexa 647 fäst via en 12-C-länk. Hittills är det inte möjligt att noggrant bestämma a priori vilken modell som är mest lämpad, med tanke på en experimentell geometri, och därmed alla modeller bör testas. I allmänhet kommer man välja den modell som ger minsta möjliga bakre storlek, medan det fortfarande är i överensstämmelse med data. För att testa om ett urval av modeller är förenlig med smFRET uppgifter beräknar vi både den bakre och sannolikheten. Konsekvens innebär att mer än 90% av de prover som tagits från den bakre ligger inom 95% konfidensintervall av sannolikhet.
Även om det är sant att ju lägre anisotropi, desto mindre avstånd osäkerheten i en smFRET nätverk geometriska arrangemang av färgmolekyler måste också beaktas. Således, medan representing färgmolekyler med låg fluorescens anisotropi med en ISO-modellen är en typisk första val, ger konsekvens testet en mer direkt sätt för att välja rätt färgmodellen. Det optimala valet av färgämnes modeller kan leda till en drastisk ökning av lokaliserings precision och samtidigt behålla nätverkets samstämmighet med FRET data.
Sammanfattningsvis möjliggör snabb-NPS att få strukturell och dynamisk information av stora makromolekylära komplex. I motsats till gemensamma strukturella metoder såsom röntgenkristallografi eller cryo elektronmikroskopi detta medger övervakning mycket flexibla eller transienta komplex, vilket avsevärt bredda vår mekanistisk förståelse av komplexa biologiska processer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowchamber preparation | |||
| Customized metall sample holder | self-built | n/a | |
| quartz-glass slides, 76 mm x 26 mm | Technical Glass Products | 26007 | |
| coverslips, 60 mm x 24 mm | Marienfeld | 101242 | |
| detergent, Hellmanex II | Hellma | 320.001 | |
| ultra-pure water from Synergy UV | Millipore | 2512600 | |
| Zepto plasma cleaner | Diener | n/a | |
| (3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | |
| biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | BIOTIN-PEG-SVA-5000 | |
| Sodium biocarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 Sigma | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S2127 Sigma-Aldrich | |
| sealing film (Nescofilm) | Fisher Scientific | 12981805 | |
| Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD | Saint-Gobain Performance Plastics | 720958 | |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) | Fisher Scientific | 12665497 | |
| Neutravidin | Life Technologies | A2666 | |
| Total internal reflection fluorescence microscope | |||
| Nd:YAG Laser, 532 nm | Newport Spectra-Physics | EXLSR-532-100-CDRH | |
| diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso | Cobolt | 904010050 | |
| diode laser 643 nm, iBeam smart | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | |
| dichroic mirror, 532 RDC | Chroma | F33-540 | |
| dichroic mirror, 476 RDC | Chroma | F33-476z | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic | AOTFnC-VIS | |
| plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm | Thorlabs | LJ1703L1-A | |
| plano-concave cylindrical, f = -300 mm | Thorlabs | ||
| prism, PS 991 | Thorlabs | PS991 | |
| focusing lens, f = 75 mm | Thorlabs | LA1608-B | |
| syringe pump, PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2002 | |
| 2 stepper motors, Z812B | Thorlabs | Z812B | |
| piezoelectric actuator, PE4 | Thorlabs | PE4 | |
| IR diode laser | Edmund Optics | CPS808 | part of the autofocus system |
| dichroic mirror, 775 DCXR | Chroma | 775 DCXR | |
| position-sensing detector (PSD), PDP90A | Thorlabs | PDP90A | part of the autofocus system |
| water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 | Nikon | MRD07601 | |
| dichroic mirror, 645 DCXR | Chroma | 645 DCXR | part of the emission pathway |
| emission filter, 3RD550-510 | Omega Optical | 3RD550-510 | green channel in the emission pathway |
| emission filter, 3RD660-760 | Omega Optical | 3RD660-760 | red channel in the emission pathway |
| EMCCD camera, iXon+ DU897EBV | Andor | AND-20-00032 | |
| EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV | Andor | AND-20-000141 | |
| Miscellaneous | |||
| Varian 50 | Cary | UV-VIS spectrometer | |
| Fluorolog2 | SPEX | fluorescence spectrometer | |
| Solis (V4.15) | Andor | control software for the EM-CCD camera | |
| Apt user utility (V1.022) | Thorlabs | control software for the piezo-motors | |
| Norland Optical Adhesive 68 | Thorlabs | adhesive | |
| PC-AFN-0.8 Nile red | Kisker Biotech | avidin-coated fluorescent multispec beads | |
| Matlab | Mathworks | technical computing language for custon written software | |
| Origin (V9.0) | Originlab | scientific graphing and data analysis software | |
| Hellma 105-202-15-40 | Hellma | 105-202-15-40 | absorption cuvette of 1 cm path length |
| Hellma 105-251-15-40 | Hellma | 105-251-15-40 | fluorescence cuvette with 3 mm path length |
References
- Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
- Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
- Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
- Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
- Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
- Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
- Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
- Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).
- Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).
- Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).
- Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).
- Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).
- Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).
- Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).
- Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
- Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).
- McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).
- Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
- Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer. J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).
- Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
- Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).
- Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).
- Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
- Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
- Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
- Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).
- Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
- Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).
- Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
- Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).
- Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
- Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. Boston, MA. (2006).
- Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7 (5), (2009).
