A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.
Många viktiga biomedicinska tillämpningar, såsom cell imaging och fjärr manipulation, kan åstadkommas genom märkning av celler med superparamagnetiska järnoxidnanopartiklar (SPIONs). Att uppnå tillräcklig cellulärt upptag av SPIONs är en utmaning som traditionellt har mötts genom att exponera celler för förhöjda koncentrationer av SPIONs eller genom att förlänga exponeringstider (upp till 72 timmar). Emellertid dessa strategier kommer sannolikt att mediera toxicitet. Här presenterar vi syntesen av den proteinbaserade Spion magnetoferritin samt en enkel yta funktion protokoll som möjliggör snabb cell magnetisering använder låga koncentrationer exponering. Den Spion kärna magnetoferritin består av kobolt-dopade järnoxid med en medelpartikeldiameter av 8,2 nm mineraliserad inuti kaviteten av häst mjälte apo-ferritin. Kemisk katjonisering av magnetoferritin producerat en roman, starkt membran aktiv Spion som magnetiserade mänskliga mesenkymala stamceller (hMSCs) med hjälp av inkubationstider somkort som en minut och järnkoncentrationer som dalar som 0,2 mm.
Yta bindning eller internalisering av superpara järnoxid nanopartiklar (SPIONs) har möjliggjort magnetisering av en mängd olika celltyper för tillämpningar som avbildning och fjärr manipulation. 1 Att uppnå tillräcklig cellulär magnetisering kan vara en utmaning, i synnerhet när interaktionen mellan Spion och cellytan är svag. 2 Under de senaste, långvarig exponering eller hög Spion koncentrationer har använts som strategier för att övervinna denna utmaning. 3,4 Trots dessa strategier är problematiska eftersom de ökar toxicitet 5,6 och har mycket begränsad framgång i celltyper med låg interna priser, såsom lymfocyter. 7 För att öka cellulärt upptag av SPIONs har flera ytfunktionalisering metoder undersökts. Exempelvis har antikroppar använts för att främja receptormedierad endocytos, 8 medan icke-specifikt upptag kan uppnås med användning transfektion ettgents 9,10 eller cellpenetrerande arter, såsom HIV tat-peptid. 11,12 emellertid antikropp och peptid funktionalise metoder begränsas av dyra reagens och komplexa syntetiska preparat, medan transfektion medel kan framkalla nanopartiklar nederbörd och påverka cellernas funktion. 13,14
Vi rapporterade nyligen syntesen av kemiskt katjoniserad magnetoferritin, en roman Spion som var mycket effektiva i magnetiserande humana mesenkyma stamceller (hMSCs) med användning av inkubationstider så korta som en minut. 15 Magnetoferritin syntetiseras genom att späda ut ett Spion inuti de-mineraliserade kavitet av järnlagringsprotein ferritin. 16 Denna proteinbaserad Spion kombinerar många egenskaper som gör den väl lämpad för cell magnetisering, såsom kontroll över de magnetiska egenskaperna hos den magnetiska kärnan, 17-19 och biokompatibilitet och vattenlöslighet är knutna till ett proteinskal. Ytterligaremer, är ytfunktionalisering lätt uppnås på grund av adresserbara aminosyror som kan vara kemiskt 20-22 eller genetiskt modifierade. 23-25 Vi har visat att kemisk katjonisering av de sura aminosyraresterna i proteinhöljet alstrar en stabil nanopartikel som lätt interagerade med anjoniska domäner på cellytan vilket leder till en snabb och ihållande cell magnetisering. Detta förfarande eliminerar behovet av mödosam funktionalisering och långa inkubationstider protokoll, och på grund av den icke-specifik mekanism märkning denna snabba magnetisering strategi bör finna utbredd tillämpning i andra celltyper. Här presenterar vi en djupgående rapport av den ultrasnabba cellmärkningsmetod, inklusive detaljerade protokoll för syntes, rening och yta funktionalisering av katjoniserad magnetoferritin.
TEM av magnetoferritin prover som färgats med aurotioglukos avslöjade framgångsrik mineralisering av nanopartiklar inne i proteinet bur. Elektrondiffraktion och Raman-analys av nanopartikelkärnan angav närvaron av en kobolt ferrit, vilket indikerar framgångsrik dopning av nanopartikelkärnan med kobolt. Detta visar att blandade oxidnanopartiklar framgångsrikt kan vara mineralis inom apo-ferritin hålighet. Vidare har vi visat tidigare att kobolt dopning kan varieras genom att förändra mängden av kobolt prekursor sättas till reaktionsblandningen, som möjliggör inställning av de magnetiska egenskaperna. 18
Magnetoferritin syntes kan utföras i en mängd olika fartyg, så länge som de är tätt förslutbar och har åtkomstöppningar, genom vilka reaktanter kan införas (t.ex. en tre-halsad rundbottnad kolv). Reaktionstemperaturen bör hållas vid 65 ° C antingen genom att placera kärlet ien vatten / oljebad eller med hjälp av en dubbel-mantlat kärl. Här har vi använt en dubbel-mantlad elektrokemisk cell setup för att utföra syntesen. För att garantera lyckad syntes, upprätthålla rätt pH och undvika förorening syre i vattenlösningar är avgörande. Metallsaltlösningar ska alltid beredas före användning snarare än i förväg. Dessutom kan kommersiella apoferritin lösningar varierar i kvalitet och påverka syntes resultatet (eg., Storleken av nanopartiklar kärna mineraliserad). Det kan hjälpa att dialysera den apoferritin lösningen i 50 mM HEPES-buffert (pH 8,6) före syntes för att avlägsna eventuellt kvarvarande reduktionsmedel som används av tillverkaren. Det är lämpligt att göra en del av batchnummer apo-ferritin lösning som används för syntes, så det kan vara specifikt begäras från tillverkaren skall ytterligare material måste köpas. Dessutom bör proteinkoncentrationen av kommersiellt tillgängliga apo-ferritin anges på flaskan, som kananvändas för att beräkna volymen av apo-ferritin lösning behövs för syntes. Om så inte är fallet, kontakta leverantören för denna information.
Fördelen med gradvis tillsats av metallsalter och väteperoxid – som presenteras här och i tidigare rapporter – är att mineralisering av den nanopartikelkärnan kan styras så att olika belastningsfaktorer (dvs nanopartiklar storlekar) kan uppnås. 33 Vidare är det möjligt att rena magnetoferritin ytterligare med användning av en magnetisk separationskolonn, t.ex. en kolonn packad med rostfritt pulverstål fäst inuti en elektromagnet. 34 Sålunda kan mycket monodispersa nanopartiklar kärnor isoleras från bulk magnetoferritin provet. Men för magnetisk cellmärkning som presenteras här detta är inte nödvändigt. En begränsning med magnetoferritin syntes är den relativt låga syntesutbyte av ca 10%, och den relativt höga kostnaden för kommersiellt apo-ferritin lösningar. Emellertid kan apo-ferritin också framställas från billigt tillgängliga häst mjälte ferritin genom att följa etablerade de-mineraliseringsprotokoll. 16
Katjonisering av magnetoferritin uppnåddes genom att tillsätta ett molförhållande av 250 molekyler av DMPA och 50 molekyler av EDC per negativt laddad rest (beräkningar baserade på aminosyrasekvensen av häst mjälte ferritin). Detta överskott av reagens över protein resulterade i höga katjonisering effektivitet, jämförbar också att tidigare rapporterade resultat för katjonisering av ferritin. 35 För MALDI-TOF-analys, apoferritin och katjoniserad apoferritin användes på grund av det alltför stora molekylvikt av magnetoferritin kärnan. För att ge höga katjonisering effektivitet, är optimalt pH också avgörande. EDC-medierad tvärbindning är mest effektiv under milt sura betingelser, och vi fann att pH 5 gav optimala katjonisering resultat för magnetoferritin. Men för andra proteiner cationization pH kan behöva optimeras. Katjonisering vid eller nära den isoelektriska punkten av proteinet bör undvikas, eftersom detta kan leda till allvarlig utfällning.
Stamcells magnetisering med katjoniserad magnetoferritin var effektiv och kan uppnås med hjälp av inkubationstider väl under 30 minuter. Även en minut inkubation resulterade i ett cellulärt järnhalt av 3,6 pg, som ligger inom det rapporterade intervallet som krävs för att påverka T2 och T2 * kontrast för MRI. 36,37 Det är också anmärkningsvärt att denna effektiva märkning uppnås med låga extracellulära järnkoncentrationer. Till exempel, tidigare studier med anjoniska nanopartiklar rapporterar järnnivåer 10 pg per cell efter 30 minuters inkubationstid med 5 mM järn. 38 I jämförelse, inkubation med en katjoniserad magnetoferritin lösning innehållande 0,5 | iM protein motsvarar inkubation med cirka 0,2 mM järn och även ger cirka 10 pg av järn per cell efter 30 minuter. Vi kunde inte klart identifiera endocytotisk vesiklar med hjälp av TEM. Men tidigare studier med katjoniserad ferritin fann att internalisering inträffade inom de första tio minuterna av exponering. 39,40 katjoniserade ferritin kunde lokaliseras i belagda vesikler, vilket indikerar clathrin- eller caveolin beroende endocytos. Samma studier rapporterade också att efter 30 minuters inkubation, katjoniserad ferritin var fortfarande närvarande på cellytan, liksom i multivesikulära organ, liknar lysosomer.
Ytterligare tillämpningar kan omfatta katjonisering av apo-ferritin burar laddade med andra nanopartiklar och / eller funktionella molekyler, såsom läkemedel mot cancer 41 eller kvantprickar 42. Katjonisering av dessa ferritin konstruktioner kan resultera i snabbare och mer effektiv leverans av sin last till celler.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL |
ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 mL/min |
automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration |
penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL |
phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells |