Abstract
そのような細胞イメージング及び遠隔操作などの多くの重要な生物医学的用途は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPIONs）で細胞を標識することによって達成することができます。 SPIONsの十分な細胞取り込みを達成することは、伝統的にSPIONsの濃度上昇に細胞を曝露することによって、または（72時間まで）露光時間を延長することによって満たされている課題です。しかしながら、これらの戦略は、毒性を媒介する可能性があります。ここでは、タンパク質ベースのSPIONのmagnetoferritinの合成と同様に低い暴露濃度を使用して、迅速な細胞磁化を可能にする容易な表面機能化プロトコルを提示します。 magnetoferritinのSPIONコアは馬の脾臓アポフェリチンの空洞内の8.2 nmの鉱化の平均粒径を持つコバルトがドープされた酸化鉄で構成されています。 magnetoferritinの化学的なカチオンは、インキュベーション時間などを用いて、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）の磁化新規な、高度に膜活性SPIONを生成しました0.2 mmの安値として1分と鉄濃度と短いです。
Introduction
結合または超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPIONs）の内部表面は、イメージングや遠隔操作などのアプリケーションのための種々の細胞型の磁化を可能にしました。 1ただし、十分な細胞の磁化を達成するSPIONと細胞表面との間の相互作用が弱い場合は特に、挑戦することができます。過去に2は 、長時間の曝露または高SPION濃度は、この課題を克服するための戦略として採用されてきました。彼らは毒性5,6を高め、リンパ球などの低内在化率、との細胞型において非常に限られた成功を持っているので、3,4はそれにもかかわらず、これらの戦略は問題があります。 7 SPIONsの細胞取り込みを強化するために、いくつかの表面機能化のアプローチが検討されています。非特異的な取り込みは、トランスフェクションaを使用して達成することができるが、例えば、抗体は、受容体媒介性エンドサイトーシス、8を促進するために使用されています紳士9,10または例えば、HIVのTATペプチドなどの細胞侵入種。トランスフェクション剤は、ナノ粒子の沈殿を誘導し、不利に細胞機能に影響を与えることができるながら11,12しかしながら 、抗体とペプチド官能化アプローチは、高価な試薬と複合合成調製物によって制限されます。 13,14
我々は最近、化学的にカチオンmagnetoferritinの合成、1分という短いインキュベーション時間を用いて磁化のヒト間葉系幹細胞（hMSC）に非常に有効であった新規SPIONを報告しました。 15 Magnetoferritin鉄貯蔵タンパク質フェリチンの脱イオンキャビティ内SPIONを再構成することにより合成されます。 16このタンパク質ベースのSPIONは、磁気コアの磁気特性を制御、17-19と生体適合性とタンパク質の殻によって付与される水への溶解度などの細胞磁化のため、それが十分に適したものにする多くの特性を、兼ね備えています。さらにより、表面機能化を容易に起因化学20-22または遺伝的に改変することができるアドレス可能なアミノ酸に達成されます。 23-25我々は、タンパク質殻の酸性アミノ酸残基の化学的なカチオンは、容易に迅速かつ持続的な細胞磁化に導く細胞表面上のアニオン性ドメインと相互作用し、安定なナノ粒子を生成することが示されています。この手順は、面倒で官能化および長いインキュベーションプロトコルの必要性を排除し、そして非特異的ラベル付け機構によってこの急速な磁化戦略は、他の細胞型における広範囲の用途を見出すべきです。ここでは、カチオン化magnetoferritinの合成、精製および表面官能化の詳細なプロトコルを含む超高速細胞標識法の深さでレポートを提示します。
Protocol
ヒト間葉系幹細胞（hMSCの）はブリストルSouthmead病院の研究倫理委員会のガイドライン（基準＃078/01）に完全に従うと、患者の同意を得た後に、人工股関節全置換術を受けて変形性関節症患者の近位大腿骨の骨髄から採取しました。
1. Magnetoferritin合成および精製
- 総説
- 金属前駆体の酸化を抑制するために窒素雰囲気下で65℃で密閉可能な、二重ジャケット反応容器中magnetoferritin合成を行います。シリンジポンプを用いて反応容器に蓋内のアクセスポートを介して金属塩溶液及び過酸化水素を注入します。
- 合成をmagnetoferritinした後、陰イオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製タンパク質単量体を分離するために（セクション1.5を参照）サイズ排除クロマトグラフィーに続いてタンパク質の空洞に囲まれていないナノ粒子を除去するために、（1.4節を参照）。デブラッドフォードアッセイを用いてtermineタンパク質濃度（1.6節を参照）。
- 合成前の準備
- 、水中の窒素ガスボンベに接続されたチューブを配置ラップフィルムで容器を密封し、約60分間窒素ガスをバブリングすることによって脱イオン水500mlを脱酸素。
- 65°Cに二重ジャケット付き反応容器に接続された水浴を加熱します。約20分間の緩衝液に窒素ガスをバブリングして、反応容器中に50 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液（pH 8.6）75 mlを加え、容器を密閉し、酸素を除去します。同時に、マグネチックスターラーを用いて緩衝液をかき混ぜます。
- HEPES緩衝液を脱酸素した後、バッファからの窒素ガスの供給管を除去し、窒素雰囲気を維持する容器中に懸濁させておきます。 3ミリグラム/ Mの最終濃度を達成するために、アポフェリチンを追加リットル。磁気攪拌を継続したが、発泡が発生した場合、撹拌速度を低下させます。
- 脱酸素した脱イオン水50mlに0.19グラムを溶解することにより、硫酸コバルト七水和物の25 mMストック溶液を調製します。
- 脱酸素脱イオン水100ml 0.98 gで溶解させてアンモニウム硫酸鉄六水和物溶液の25mMの溶液を調製します。
- アンモニウム硫酸鉄六水和物溶液を2.5ミリリットルを削除し、硫酸コバルト七水和物の2.5ミリリットルと交換してください。
- 最初の脱酸素脱イオン水9 mlの過酸化水素溶液（30％w / w）のの965μLを添加し、次いで99 mlにこのサブストックを1ml添加することにより脱酸素脱イオン水中の過酸化水素の8.33ミリモルの溶液を調製します脱酸素した脱イオン水。
- Magnetoferritin合成
- sの磁気（アポフェリチン溶液中に同時に鉄コバルト前駆体と過酸化水素の両方の10.1ミリリットルを注入しtirred）は、2つのシリンジポンプ（注入された総体積用いて0.15 ml /分の流速：20.2ミリリットル）。
- 注入期間中に、脱イオン水をさらに500ミリリットル脱酸素。
注：反応容器の内容物を徐々に反応が進行するにつれて、暗褐色の色を採用しています。 - 間もなく最初の注射が完了する前に、鉄 - コバルト前駆物質と新たに脱酸素脱イオン水を使用して、過酸化水素溶液の別の100mlと準備します。
- 鉄コバルトと過酸化水素の新たに調製された溶液を用いて、1.3.1で説明した射出工程を繰り返します。
- 噴射期間中に、脱イオン水の別の500ミリリットルを脱酸素化し、1.3.3と1.3.4で説明したように進みます。
- 3回目の注射の後、撹拌下で15分間成熟するソリューションを残します。
- 溶液中の遊離金属イオンをキレート化するために、反応容器に1 Mクエン酸ナトリウム溶液1.5mlを加えます。
- 反応からの溶液を除去50ミリリットルの遠心分離管、4350×gで30分間遠心分離し、0.22μmのシリンジフィルターを通して上清を渡すに容器。この段階で、濾過した上清を精製まで4℃で保存することができます。
- イオン交換クロマトグラフィー
- 10ml /分の流量で、蠕動ポンプを使用して、カチオン性マトリックスを含有するカラム（長さ20cm直径2.5cm）にサンプルをロードします。
- 10ml /分の流速で勾配ポンプを用いて緩衝液（50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液、pH 8.0）を実行して約100mlでカラムを洗浄します。
- 150、500から1,000 mMの最終NaCl濃度、各濃度を150ml：タンパク質を溶出し、トリス緩衝液中の塩化ナトリウム（NaCl）の濃度を増加させて10ml /分でカラムを洗浄します。
- タンパク質は、500mMのNaCl濃度で溶出するように、自動化されたフラクションコレクターを使用して、50ミリリットルの画分でそれを集めます。
注：についてイオン交換クロマトグラフィーの詳細なプロトコールは、以前に公開されたプロトコルを参照してください。 26
- サイズ排除クロマトグラフィー
- 4ml容量部でを15 mlの遠心フィルターユニットを用いて約2 mlの容量にmagnetoferritin 150mlのを濃縮します。この手順の詳細なプロトコルのための（材料のリストを参照）遠心分離フィルターユニットの製造元の説明書を参照してください。
- 注入ループを用いたゲルろ過カラムに濃縮サンプルをロードします。
- 1.3 ml /分の流速で（150mMのNaClを含む50mM Tris緩衝液、pH8.0）でランニングバッファーでカラムを洗浄します。
- 自動化されたフラクションコレクターを使用して6ミリリットルの画分を収集します。タンパク質単量体は、最後の溶出します。この時点で、精製magnetoferritinはカチオン化まで4℃で保存することができます。
NOTE：ゲルろ過カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーの詳細なプロトコルは、相談のためpreviouslyプロトコルを発表しました。 27
- タンパク質濃度を決定します
- 市販のウマ脾臓フェリチンを用いて、50mMのトリス緩衝液中で0.06、0.125、0.25、0.5及び1 mg / mlでのフェリチン基準を準備します。
注：市販のフェリチンのタンパク質濃度は、ボトルに記載されています。ない場合は、この情報をサプライヤーにお問い合わせください。 - 溶液の色は、約0.5 mg / mlで標準の色と一致するまで、50mMのトリス緩衝液中の未知の濃度のmagnetoferritinサンプルを希釈します。希釈係数をメモします。
- 96ウェルプレートのウェルに三連の各標準とmagnetoferritin10μlのサンプルを追加します。
- （ブラッドフォードアッセイ試薬の詳細については、材料リストを参照）を各ウェルに既製のBradford試薬200μlのを追加します。
- 8分間室温でインキュベートします。
- 使用してλ= 595 nmの吸光度を測定しますマイクロプレートリーダー。
- タンパク質濃度の関数としてのフェリチン標準の吸光度を意味し、magnetoferritin試料の濃度を計算するために線形フィットの傾き及び切片を使用してプロットします。
注：アカウントに標準曲線にmagnetoferritinサンプルを調整するために使用された希釈倍率を取ります。
- 市販のウマ脾臓フェリチンを用いて、50mMのトリス緩衝液中で0.06、0.125、0.25、0.5及び1 mg / mlでのフェリチン基準を準備します。
2. Magnetoferritinカチオン化
- 総説
注： - （3-ジメチルアミノプロピル） - N 'エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）magnetoferritinのカチオンは、N、Nをジメチル-1,3-プロパンジアミン（DMPA）は、Nを用いてMF表面にアスパラギン酸およびグルタミン酸残基に結合させました。- 攪拌下、室温で反応を行います。下記のプロトコルを5ml（タンパク質濃度を2mg / ml） を全量magnetoferritinを10mgのカチオン化のためのものです。しかし、アップまたはスケールダウンDMPA：EDC比一貫性、ならびに緩衝液およびmagnetoferritin液の容量の蛋白質を保つことによって。
- カチオン化反応に先立って、50mMのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH 7）にmagnetoferritinサンプルを透析します。これは、トリス溶出緩衝液を除去し、トリスアミンおよびEDC活性化カルボン酸の残基間の望ましくない反応を避けることが重要です。透析後のタンパク質濃度を決定し、カチオン化する前に4mg / mlに調整してください。
- カチオン化プロトコル
- DMPAの374ミリグラムを秤量し、200mMの2-（Nのモルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液の2.5ミリリットルに溶解します。
- 濃縮して、（6 M）塩酸（HCl）を用いて、溶液のpHを約7に調整します。
注意：DMPAに酸を添加すると、有毒ガスを放出するように、ドラフト内で、この手順を実行します！ - 4 mg / mlででmagnetoferritin溶液を2.5ミリリットルを追加します（最終concenMESのtrationは、magnetoferritinの最終濃度が2 mg / mlであり、タンパク質の合計量）は10 mgで100 mmです。
- 平衡化するために2時間磁気撹拌機や撹拌を加えます。
- 1 M HClを用いてpHを5.0に解決策を慎重に調整します。
- DMPA / magnetoferritin溶液にEDC粉末の141ミリグラムを追加します。
- 3.5時間攪拌し続けます。
- 任意の沈殿物を除去するために0.22μmのシリンジフィルターを通して溶液をフィルタリングします。
- 透析緩衝液を交換し、12-14 kDaの分子量カットオフを有する透析チューブに溶液を添加し、4℃で2日間、50mMのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH 7）の4リットルに対して透析少なくとも三つその期間中回。
注：この時点で、カチオンmagnetoferritinはさらなる使用まで4℃で保存することができます。
カチオン化Magnetoferritin 3.ヒト間葉系幹細胞標識
- 総説
- 4日間-すべての3補充した175cm 2のフラスコおよび培養培地20mlを用いて単層として培養細胞。培養培地は、1000 mg / Lのグルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のウシ胎児血清、1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン溶液、1％（v / v）のLから成っ-alanyl -L-グルタミン溶液、および5 ngの/新たに補充mlのヒト線維芽細胞増殖因子。
- カチオン化magnetoferritinでのhMSCの磁気標識
- シード15万25cm 2のフラスコへのhMSC、37℃で一晩付着したままにします。
- フィルタは、0.22μmのシリンジフィルターを通してカチオン化magnetoferritinを殺菌し、タンパク質濃度を決定します。
- カチオン化magnetoferriの0.5μM溶液を調製、無菌状態を維持リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の錫。使用するまで無菌培養フードに蓋をしてください。
- 室温PBSの2mlで播種した細胞を洗浄。
- 播種した細胞に滅菌したカチオン化magnetoferritin溶液1mlを加え、所望の時間（1分〜1時間）インキュベートします。
- トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を0.5mlを添加し、5分間37℃でインキュベートすることにより、PBSで細胞を、その後収穫細胞を洗浄します。
- トリプシン/ EDTAを不活性化する524×gで5分間、15mlの遠心チューブと遠心分離機に溶液を転送するために、培養培地1mlを加えます。
- 上清を捨て、ウシ胎児血清およびPBS中の2mMのEDTA（w / v）の0.5％からなる、0.5ミリリットルで細胞ペレット磁気分離バッファを再懸濁。
- 磁気細胞分離
- マルチスタンドに磁石を取り付け、磁石に磁気分離カラムを追加します。目の前の分離フィルタを配置E列。
- プレ分離フィルタで磁気分離バッファの0.5ミリリットルを置き、フィルタおよび洗浄し、それらを濡らす列の両方を介して実行してみましょう。
- 列の下に15ミリリットルの遠心分離管を配置します。
- 磁気分離カラムのフィルター容器内の細胞懸濁液を0.5mlを加えます。
- リザーバが空になると、磁気分離バッファの0.5ミリリットルを追加します。
- リザーバが空になると、磁気分離緩衝液のさらなる0.5ミリリットルを追加します。
- （洗浄に用いた磁気分離緩衝液の全量を1.5ミリリットルでなければならない）もう一回繰り返します。この洗浄工程は、カラム（非磁化細胞画分）からすべての非磁性細胞を溶出します。
- 磁石から列を削除し、新鮮な15ミリリットルの遠心管に入れてください。カラムリザーバーからフィルターを取り外します。
- リザーバーに磁気分離緩衝液1mlを加え、直ちに製造により供給されたプランジャーを使用してカラムを押し通しますrを。これは、遠心分離管（磁化細胞画分）にカラムから磁化細胞を溶出します。
- 524×gで5分間遠心チューブの両方。
- 上清を捨て、0.3ミリリットルのPBSで細胞ペレットを再懸濁。
- 血球計数器を使用して、各画分中の細胞数の数をカウントします。
- 磁化された細胞の割合を決定し、M（％）は、以下の式を用いて。
ここで、n（M）は、磁化の画分中の細胞の数およびn（M + NM）は、磁化および非磁化画分中の細胞の数の和です。
- 誘導結合プラズマ発光分光法（ICP-OES）を用いて、鉄定量のためにカチオン化magnetoferritinで標識したhMSCの調製
注：プロトコルは、他のICP-OESの楽器のために適合させる必要があるかもしれません。再と相談することをお勧めしますsponsible技術者。- 遠心分離機524×gで5分間、細胞の既知の数。
- PBSの上清を除去し、50％（v / v）の硝酸の0.25ミリリットルを追加します。
- 渦は、酸性化細胞懸濁液を混ぜます。
- 室温で一晩インキュベートします。
- 各サンプルと渦ミックスに蒸留水4.75ミリリットルを追加します。
- ICP-OESで分析します。 28
- 細胞の鉄含有量の値を決定するために細胞数を測定した鉄含有量を正規化します。
Representative Results
TEMは、アポフェリチン空洞内のナノ粒子の石灰化を確認し、平均コアサイズ（ 図1Aおよび1B）を決定するために使用しました。未染色magnetoferritinサンプルの画像解析は、8.2±0.7 nmの平均コア直径を与え、アウロチオグルコース染色は、タンパク質ケージ内のナノ粒子の存在を確認しました。画像はさらに均一なナノ粒子コアを分離するために磁気分離を用いて精製したmagnetoferritinサンプルを示すことに注意してください。磁気的に精製しなかったMagnetoferritinサンプルはわずかに広いコアサイズ分布を有します。 29選択されたエリアの電子回折を用いmagnetoferritinコアの構造の解析マグネタイトに基づいて逆スピネル構造の存在の可能性を示した鉄（Fe 3 O 4）および/またはマグヘマイト（γ-Fe 2 O 3）、並びにスピネル構造のCo 3に起因します4。また、ラマンスペクトルは、Fe 3 O 4、小さなγ- の Fe 2 O 3の量、及びコバルトフェライト（ 図1C）に起因するピークを明らかにしました。 magnetoferritinのICP-OES分析はmagnetoferritinのミリグラムあたりのコバルトの鉄の102μgの0.9μgの平均を示しました。
概略的には、その後のカチオン化工程（ 図2 A）を示す、含まれています。動的光散乱によって決定されるようmagnetoferritinとカチオン化magnetoferritinの流体力学的直径は、それぞれ11.8±1.1 nmおよび12.5±1.4nmでした。 magnetoferritinへの共有DMPA結合のカチオン効率はゼータ電位差及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析法を用いて評価しました。ゼータ電位は確認し、カチオン化magnetoferritinための+ 8.3 mVのにMFのために-10.5 mVのから変更しました負から正への表面電位の変化（ 表1）。質量分析実験は、カチオン化アポフェリチン（ 図2 B）のネイティブアポフェリチンと21.1 kDaのための20.1キロダルトンのサブユニット分子量を見つけました。この質量増加は、約12結合DMPAタンパク質サブユニットあたりの分子、および全体の24サブユニットタンパク質の288残基のカチオンに対応します。
磁気飽和および感受性はSQUID磁気測定を用いて測定し、横方向および縦緩和は、磁気共鳴イメージングを用いて測定しました。磁気特性は、カチオンが封入SPION（ 表1）の磁気特性にほとんど影響を与えたことを示す、magnetoferritinとカチオン化magnetoferritinについて同様でした。さらに、これらの特性は、他の酸化鉄系ナノ粒子、マグネのカチオン19,30実証に似ていますtoferritinは、イメージングのコントラストを高めることで、従来のSPIONベースのMRI造影剤と同様に適しているであろう。
30分間曝露した後、細胞表面に密カチオンmagnetoferritin（ 図3A）で覆った。しかし、1週間後に、何のナノ粒子は、細胞表面（ 図3 B）上で見つかりませんでした。カチオン化magnetoferritinは、磁気標識のhMSCで著しく効果的でした。注目すべきことに、1分間カチオンmagnetoferritinに細胞を曝露する細胞集団の92％の磁化と細胞あたりの鉄の3.6 PGの送達をもたらしました。 15分のインキュベーション時間を増加させると、全体の細胞集団（ 図3 C）の磁化をもたらしました。
図1：magnetof のキャラクタリゼーション erritinコアを、5％のコバルトをドープしました。オーロチオグルコース（A）および非染色（B）で染色magnetoferritinのTEM像。挿入図は、マグネタイトインデックスと対応する電子線回折を示しています。スケールバー：20 nmの。 magnetoferritin用（C）ラマンスペクトル。矢印は、コバルトフェライト（Tの2グラム ）、マグネタイト、マグヘマイト（1グラムの両方）のための主要なラマン振動モードを示しています。 31,32用いるレーザー波長は532 nmでした。 （奥田ら18から適応イメージ）。このmagnetoferritinサンプルがさらに均一にロードされたmagnetoferritin粒子を単離した磁気分離を用いて精製されていたことに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：magnetoferritin のカチオン化。 A）タンパク質表面上の酸性（赤色の分布）および塩基（黄色）のアミノ酸残基を示す溶媒アクセス可能表面積表現。 Magnetoferritin（1）〜（3）タンパク質表面上の酸性アミノ酸残基にDMPAのカルボジイミド媒介架橋によりカチオンmagnetoferritin（2）に変更します。アポフェリチンのB）質量分析とアポフェリチンサブユニットをカチオン化。アポフェリチンの質量対電荷（m / z）スペクトル（ApoF）およびMALDI-TOFによって生成されたカチオンアポフェリチン（CAT-ApoF）。 21.1キロダルトンの20.1キロダルトンの質量の増加は、カチオン化後に観察されます。 （画像はコレイアCarreira ら 15から適応） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 磁気標識およびカチオン化magnetoferritinとインキュベートしたhMSCの細胞分離。カチオン化magnetoferritinで30分間のインキュベーション後のhMSCのA）TEM像。矢印は、密に細胞表面上に充填しmagnetoferritinコアの存在を示します。スケールバー：200nmで。標識後のhMSC 1週間のB）TEM像。細胞表面は、カチオン化magnetoferritinのは明らかです。磁気標識の迅速性を調査C）：細胞集団の92％はmagnetoferritinをカチオン化0.5μMで1分間の曝露後に着磁し、全体の細胞集団は、15分以内に磁化されました。細胞当たりの鉄含有量は、ICP-OESを用いて測定しました。 3つの生物学的複製物の平均値と標準偏差を示します。コレイアCarreira らから適応（画像15） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| MF | 猫-MF | |
| 流体力学的直径[nm]で | 11.8±1.1 | 12.5±1.4 |
| ゼータ電位[MV] | （ - ）10.4±0.2 | 8.3±0.7 |
| 磁気飽和モーメント[アム2キロ -1] | 54.9±1.6 | 55.3±1.4 |
| [10 4メートル 3キロのx -1]質量磁化率 | 1.75±0.08 | 1.75±0.07 |
| 縦緩和さ[mm -1秒-1] | 2.6±0.1 | 2.3±0.1 |
| 横緩和度[mMの-1秒-1] | 44.6±1.0 | 52.8±0.8 |
表1：magnetoferritin の物理化学的特性評価（MF）とカチオン化magnetoferritin（猫-MF）。 （表はコレイアCarreira ら15から適応しました）
Discussion
オーロチオグルコースで染色magnetoferritinサンプルのTEMは、タンパク質ケージの中にナノ粒子の成功石灰化を明らかにしました。電子線回折及びナノ粒子コアのラマン分析は、コバルトとナノ粒子コアの成功ドーピングを示し、コバルトフェライトの存在を示しました。これは、混合酸化物ナノ粒子が正常アポフェリチン空洞内に石灰化することができることを示しています。さらに、我々は、磁気特性の調整を可能にする、反応混合物に加え、コバルトドープコバルト前駆体の量を変えることによって変えることができることが以前に示されています。 18
Magnetoferritin合成は、それらがしっかりとシール可能であり、反応物質を導入することができるようなアクセスポート（ 例えば 、三首丸底フラスコ）を有するように、血管の様々な行うことができます。反応温度は、65℃のいずれかで容器を配置することによって維持されるべきです二重ジャケット付き容器を用いて水/油浴または。ここでは、合成を実行するために二重ジャケット電気化学セルのセットアップを使用していました。合成の成功を保証するために、適切なpHを維持し、水溶液の酸素汚染を回避することが重要です。金属塩溶液は、常に事前にではなく、使用する前に新たに準備する必要があります。また、商業アポフェリチン溶液の品質が変化し、合成結果に影響を与えることができる（ 例えば 、ナノ粒子コアの鉱化のサイズ）。それはメーカーによって使用される任意の残留還元剤を除去するために、合成の前に50mMのHEPES緩衝液（pH 8.6）にアポフェリチン溶液を透析することができます。追加の材料を購入する必要があるべき合成に使用されるアポフェリチン溶液のバッチ番号をメモしておくことが有用であるので、それは、具体的には、メーカーから要求することができます。また、市販のアポフェリチンのタンパク質濃度は、缶、ボトルに記載すべき合成に必要なアポフェリチン溶液の体積を計算するために使用されます。そうでない場合は、この情報をサプライヤーにお問い合わせください。
金属塩および過酸化水素を徐々に添加することの利点-ここに提示され、以前の報告のように-は、ナノ粒子コアの石灰化は、異なる負荷率（ すなわち、ナノ粒子のサイズ）を実現することができるように制御することができることです。 図33はまた、さらに、磁気分離カラム、 例えば、電磁石の内部に固定されたステンレス鋼粉末を充填したカラムを用いてmagnetoferritin精製することが可能です。 図34はこのように、高度に単分散ナノ粒子コアは、バルクmagnetoferritinサンプルから単離することができます。ここで提示されるようしかしながら、磁気細胞標識のためにこれは必要ありません。 magnetoferritin合成の限界は10％程度の比較的低い合成収率、および市販のアポFE比較的高コストでありますrritinソリューション。しかしながら、アポフェリチンはまた、確立された脱石灰化プロトコルに従うことによりフェリチン安価に入手できるウマ脾臓から調製することができます。 16
magnetoferritinのカチオンは、DMPAの250分子およびEDCあたり負に荷電した残基（ウマ脾臓フェリチンのアミノ酸配列に基づいて計算）の50分子のモル比を加えることによって達成しました。タンパク質を超える試薬のこの過剰は、以前、フェリチンのカチオン化のために結果を報告するためにも匹敵する、高カチオン化効率が得られました。 MALDI-TOF分析、アポフェリチンとカチオンアポフェリチン35が原因magnetoferritinコアの過度の分子量を用いました。高カチオン化効率を得るために、最適なpHも重要です。 EDC媒介架橋は、穏やかな酸性条件下で最も効果的であり、我々は、pH 5はmagnetoferritinに最適なカチオンの結果が得られたことがわかりました。しかしながら、他のタンパク質CのationizationのpHが最適化される必要があるかもしれません。これは深刻な降水量につながる可能性があるためで、カチオンまたはタンパク質の等電点に近いが、避けるべきです。
カチオン化magnetoferritinで幹細胞の磁化は非常に効率的であり、インキュベーション時間井戸下30分を使用して達成することができます。 1分間のインキュベーションは、MRIのためにT2及びT2 *コントラストに影響を与えるために必要な報告範囲内である3.6 PGの細胞の鉄含有量をもたらしました。 36,37なお、この効率的な標識化は、低細胞外の鉄濃度で達成されていることも注目すべきです。例えば、陰イオン性ナノ粒子を用いた以前の研究は、5 mMの鉄と30分間のインキュベーション期間後、細胞あたり10のPGの鉄レベルを報告します。 38と比較して、0.5μMタンパク質を含むカチオン化magnetoferritin溶液とのインキュベーションは、約0.2mMの鉄とのインキュベーションに対応し、また、セルあたりの鉄の約10 PGを生じます30分後リットル。私たちは、明らかに、TEMを用いて、任意のエンドサイトーシス小胞を識別することができませんでした。しかし、カチオン化フェリチンを用いた以前の研究は、内在は、露光の最初の10分以内に発生したことがわかりました。 39,40カチオン化フェリチンは、クラスリンまたはカベオリン依存性エンドサイトーシスを示す、被覆小胞に局在することができました。同様の研究はまた、インキュベーションの30分後、フェリチンをカチオン化することが報告リソソームに似ている、まだ細胞表面上、ならびに多胞体中に存在しました。
さらなる用途は、抗がん剤41または量子ドット42のような他のナノ粒子および/または機能性分子、を装填アポフェリチンケージのカチオンを含むことができます。これらのフェリチンの構築物のカチオンは、細胞への貨物のより速く、より効率的な配信につながる可能性があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
| apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
| cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
| Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
| Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml |
| ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
| HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
| ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
| sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 ml/min |
| automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
| Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
| Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
| N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
| dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration |
| penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
| trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
| MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
| MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
| Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
| Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
| Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
| JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
| InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
| Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
| Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
| ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
| Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
| Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
| Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
| 710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells | |
References
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