Abstract
이러한 세포 이미징 및 원격 조작 등의 많은 중요한 생물 의학 응용 프로그램은, 초상 자성 산화철 나노 입자 (SPIONs)으로 세포를 라벨링함으로써 달성 될 수있다. SPIONs 충분한 세포 흡수를 달성하는 것은 전통적 SPIONs의 상승 된 농도에 세포를 노출시킴으로써 또는 (72 시간까지) 노출 시간을 연장 충족 된 도전이다. 그러나, 이러한 전략은 독성을 매개하는 것으로 보인다. 여기서는 단백질 기반의 SPION magnetoferritin의 합성뿐만 아니라, 낮은 노출 농도를 이용하여 빠른 셀 자화를 가능하게하는 용이 한 표면 기능화 프로토콜을 제시한다. magnetoferritin의 SPION 코어 말 비장 아포 페리틴의 캐비티 내측 8.2 나노 광물의 평균 입자 직경을 갖는 코발트 - 도핑 된 산화철로 구성된다. magnetoferritin 화학 양이온 화 같이 배양 시간을 사용하는 신규 한 인간 중간 엽 줄기 세포를 자화 막은 높은 활성 SPION (중배엽 줄기 세포)를 제조0.2 mM 이상 기온으로 일분 철 농도 짧게.
Introduction
바인딩 표면 또는 초상 자성 산화철 나노 입자 (SPIONs)의 내재화는 이미징 및 원격 조작 등의 응용 프로그램에 대한 세포 유형의 다양한 자화를 사용할 수있다. (1) 그러나, 충분한 세포 자화를 달성하면 SPION 및 세포 표면 사이의 상호 작용이 약한 경우, 특히, 도전 일 수있다. 과거 장기간 노출 또는 높은 SPION 농도 2는 이러한 문제를 극복하기위한 전략으로 사용되어왔다. 그들은 독성 5,6 증가 및 림프구의 낮은 국제화 속도와 세포 유형에서 매우 제한적인 성공이 있기 때문에 3,4 그럼에도 불구하고, 이러한 전략은 문제가있다. 7 SPIONs의 세포 흡수를 강화하기 위해, 여러 가지 표면 기능화 방식이 모색되고있다. 비특이적 섭취는 형질 A를 사용하여 달성 될 수 있지만 예를 들어, 항체는 수용체 - 매개 엔도 시토 시스 8을 촉진하는데 사용되어왔다신사 9, 10 또는 HIV의 문신 펩타이드로 세포 관통 종. 형질 전환 에이전트가 나노 입자의 침전을 유도 악영향 세포의 기능에 영향을 미칠 수있는 반면 (11, 12)은 그러나, 항체와 펩타이드의 작용 방식은 고가의 시약 및 복잡한 합성 준비에 의해 제한됩니다. 13, 14
최근 화학 양이온 magnetoferritin의 합성 1 분만큼 짧은 배양 시간을 이용하여 자화 인간 중간 엽 줄기 세포에 매우 효과적 신규 SPION (중배엽 줄기 세포)를보고 하였다. 15 Magnetoferritin는 철 저장 단백질 페리틴의 미네날 캐비티 내부 SPION를 재구성하여 합성된다. 16이 단백질 기반 SPION는 단백질 껍질에 의해 부여 된 자기 코어, 17 ~ 19과 생체 적합성 및 수용성의 자기 특성 제어와 같은 세포 자화하기에 매우 적합하게 많은 속성을 결합합니다. 더욱이이상, 표면 기능화 용이 의한 화학적 20-22 또는 유 전적으로 변형 될 수있는 어드레스 가능한 아미노산으로 이루어진다. 23-25 우리 단백질 쉘의 산성 아미노산 잔기의 화학적 양이온 화 용이 빠르고 지속적인 세포 자화 이어지는 세포 표면의 음이온 성 도메인과 상호 작용 안정한 나노 입자를 생성하는 것으로 나타났다. 이 과정은 힘들고 작용하고 긴 배양 프로토콜의 필요성을 제거하고, 비특이적 라벨링기구 인해 빠른 자화 전략은 다른 세포 유형에 대폭적인 응용을 발견한다. 여기, 우리는 양이온 magnetoferritin의 합성, 정제 및 표면 기능화의 상세한 프로토콜을 포함하는 초고속 셀 라벨 방법의 깊이 보고서를 제시한다.
Protocol
인간 중간 엽 줄기 세포 (hMSC)는 브리스톨 Southmead 병원 연구 윤리위원회의 지침에 가득 따라 (참조 # 078 / 01) 및 환자의 동의를 얻은 후에서 고관절 교체 수술을받은 골관절염 환자의 근위 대퇴골 골수에서 수확했다.
1. Magnetoferritin 합성 및 정제
- 총론
- 금속 전구체의 산화를 제한하는 질소 분위기 하에서 65 ℃에서 밀봉 가능한 이중 자켓 반응기에 magnetoferritin 합성을 수행한다. 주사기 펌프를 이용하여 반응 용기에 뚜껑 액세스 포트를 통해 금속 염 용액과 과산화수소를 주입한다.
- magnetoferritin 합성 한 후, 음이온 교환 크로마토 그래피에 의한 단백질 정제 크기 - 배제 크로마토 그래피, 단백질 캐비티 묶지 않은 나노 입자를 제거하는 (섹션 1.4 참조) 단백질 단량체를 분리 (섹션 1.5 참조). 드브래드 분석을 사용하여 termine 단백질 농도 (1.6 절 참조).
- 준비 이전에 합성
- 물에 질소 가스 실린더에 접속 된 튜브를 배치 집착 막을 용기를 밀봉하고 약 60 분간 질소 가스를 버블 링하여 탈 이온수 500 ㎖의 탈산 소화.
- 65 ° C에 이중 자켓 반응기에 연결된 수조 가열한다. 약 20 분 동안 버퍼 용액을 통해 질소 가스를 버블 링시켜 용기 및 탈산 소화를 밀봉 반응 용기로의 50 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충액 (pH 8.6) 75 mL를 추가. 동시에, 자기 교반기를 사용하여 버퍼 용액을 교반한다.
- HEPES 완충 용액을 탈산 소화 후, 버퍼로부터의 질소 가스를 공급하는 튜브를 제거하고, 질소 분위기를 유지하는 용기에 현탁하고 유지한다. 3 밀리그램 / m의 최종 농도를 달성하기 아포 페리틴 추가엘. 자기 교반을 계속하지만, 거품이 발생하는 경우 교반 속도를 줄일 수 있습니다.
- 탈산 소화를 탈 이온수 50 ml 중에 0.19 g을 용해시켜 황산 코발트 수화물의 25 mM의 스톡 용액을 제조 하였다.
- 탈산 소화를 탈 이온수 100 ml 중에 0.98 g을 용해시켜 황산 암모늄 철 수화물 용액을 25 mM의 용액을 제조 하였다.
- 암모늄, 황산 철 수화물 용액 2.5 mL를 제거하고, 황산 코발트 수화물 2.5 ㎖로 교체한다.
- 제 탈산 소화 된 탈 이온수 9 ml의 (/ w 30 W %) 과산화수소 용액 965 μl를 첨가 한 다음 99 ml의 세부 스톡 1 ㎖를 첨가하여 탈산 소화 탈 이온수 과산화수소 8.33 mM의 용액을 조제 탈 산소 탈 이온수.
- Magnetoferritin 합성
- S 자화 (동시에 아포 페리틴 용액에 철 - 코발트 전구체 및 과산화수소 양의 10.1 ml에 주입tirred) 개의 주사기 펌프를 사용 / 분 0.15 mL의 유속 (총 주입량 : 20.2 mL)을 첨가 하였다.
- 주사 기간 동안, 탈 이온수 500 ml에 다른 탈산 소화.
비고 : 반응 용기의 내용물을 서서히 반응이 진행됨에 따라 짙은 갈색을 채택한다. - 곧 제의 주입이 완료되기 전에, 철 - 코발트 전구체 및 갓 탈 산소 탈 이온수를 사용하여 과산화수소 용액의 또 다른 100 ㎖를 준비한다.
- 철 - 코발트 및 과산화수소의 새로 제조 한 용액을 사용하여 1.3.1에 기재된 사출 공정을 반복한다.
- 주사 기간 동안, 탈 이온수의 또 다른 500 mL의 탈산 소화, 및 1.3.3 및 1.3.4에 기술 된 바와 같이 진행.
- 세 번째 주사 후, 교반 하에서 15 분간 숙성 용액을 떠난다.
- 용액에서 자유 금속 이온을 킬레이트 화하는 반응 용기에 1 M 시트르산 나트륨 용액 1.5 ml를 추가.
- 반응에서 솔루션을 제거50 ㎖ 원심 분리기 튜브, 4,350 XG에 30 분 동안 원심 분리기와 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 뜨는을 통과로 용기. 이 단계에서, 상청액을 여과 정제 할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- 이온 교환 크로마토 그래피
- 10 ㎖ / 분의 유속으로 연동 펌프를 사용하여 양이온 성 매트릭스를 함유하는 컬럼 (20cm 길이 2.5 cm 직경)에 시료를 적재.
- 10 ㎖ / 분의 유속 구배 펌프를 사용하여 버퍼 (50 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스) 완충액의 pH 8.0)을 실행 약 100㎖로 컬럼을 세척 하였다.
- 150, 500, 1000 mM의 NaCl을 최종 농도 각 농도 150 ㎖ : 단백질을 용출, 트리스 완충액에 염화나트륨의 농도가 증가하여 10 ㎖ / 분으로 컬럼을 세척 하였다.
- 단백질은 500 mM의 염화나트륨의 농도에서 용출 된 바와 같이, 자동 분획 수집기를 이용하여 50 mL의 분획을 수집한다.
참고 :를 들어이온 교환 크로마토 그래피의 자세한 프로토콜은 이전에 게시 된 프로토콜을 참조하십시오. (26)
- 크기 배제 크로마토 그래피
- 4 ml의 부피 단위 다음 15 mL의 원심 분리 필터 장치를 이용하여 약 2 ㎖의 부피로 magnetoferritin의 150 mL로 농축시켰다. 이 절차에 대한 자세한 프로토콜에 대한 원심 필터 유닛의 제조 업체의 지침 (자재 목록 참조)을 참조하십시오.
- 사출 루프를 사용하여 겔 여과 칼럼 상에 농축 시료를 적재.
- 1.3 ㎖ / 분의 유속 (150 mM의 NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 완충액의 pH 8.0) 완충액을 실행하여 컬럼을 세척 하였다.
- 자동화 된 부분 Collector를 사용하여 6 ml의 분수를 수집합니다. 단백질 단량체는 지난 용출. 이 시점에서, 정제 magnetoferritin은 양이온 화까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.
주 : 겔 여과 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토 그래피에 대한 상세한 프로토콜은 참조 previously 프로토콜을 발표했다. (27)
- 단백질 농도를 측정
- 시판 말 비장 페리틴을 사용하여 50 mM 트리스 버퍼에 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 ㎎ / ㎖의 페리틴 표준을 준비합니다.
참고 : 시판 페리틴 단백질의 농도는 병에 명시되어있다. 되지 않은 경우,이 정보는 공급 업체에 문의하십시오. - 용액의 색은 약 0.5 ㎎ / ㎖의 표준 색과 일치 할 때까지 50 mM 트리스 완충액에 미지 농도 magnetoferritin 샘플을 희석한다. 희석 인자를 기록해 둡니다.
- 96 웰 플레이트의 우물에 세중의 각 표준 및 magnetoferritin 샘플의 10 μl를 추가합니다.
- (브래드 포드 분석 시약 자세한 내용은 재료 목록 참조) 각 웰에 기성품 브래드 포드 시약 200 μl를 추가합니다.
- 실온에서 8 분간 인큐베이션.
- 사용하여 λ = 595 nm에서 흡광도를 측정마이크로 플레이트 리더.
- 단백질 농도의 함수로서 페리틴 기준의 평균 흡광도를 플롯하고 magnetoferritin 샘플의 농도를 계산하기 위해 선형 피팅의 기울기와 절편을 사용한다.
참고 : 계정에 표준 곡선에 magnetoferritin 샘플을 조정하는 데 사용 된 희석 배수를 가져 가라.
- 시판 말 비장 페리틴을 사용하여 50 mM 트리스 버퍼에 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 ㎎ / ㎖의 페리틴 표준을 준비합니다.
2. Magnetoferritin 양이온 화
- 총론
주 : magnetoferritin의 양이온 화를 들어, N, N의 디메틸 -1,3- 프로판 디아민 (DMPA)이 N을 이용하여 MF 표면 아스파라긴산 및 글루탐산 잔기에 결합 된 - (3- 디메틸 아미노 프로필) - N '다이이 미드 하이드로 클로라이드 (EDC).- 실온에서 교반하에 반응을 수행. 아래의 프로토콜을 5 ㎖ (단백질 농도 2 ㎎ / ㎖) 총 부피 magnetoferritin 10 ㎎의 양이온 화에 대한 것이다. 그러나, 위 또는 아래로 확장DMPA : EDC 비 일관성뿐만 아니라 버퍼 magnetoferritin 용액의 부피 단백질 유지함으로써.
- 양이온 화 반응 이전에, 50 mM의 NaCl을 함유하는 50mM의 인산 완충액 (pH 7)로 magnetoferritin 샘플을 투석. 이것은 트리스 용출 완충액을 제거하고, 트리스 아민 및 EDC 활성화 된 카르 복실 산 잔기 사이의 원치 않는 반응을 방지하는 것이 중요하다. 투석 후 단백질 농도를 결정하고 / ㎖ 이전 양이온 화 4 밀리그램으로 조정합니다.
- 양이온 화 프로토콜
- DMPA의 374 밀리그램을 달아 200 mM의 2- (N의 -morpholino) 에탄 설 폰산 (MES) 버퍼의 2.5 ㎖에 용해.
- 농축 (6 M), 염산 (HCL)을 사용하여 용액의 pH를 약 7을 조정한다.
주의 : 흄 후드에서이 단계를 수행은 DMPA에 산의 첨가로는 유독 가스를 방출! - 4 ㎎ / ㎖에서 magnetoferritin 솔루션의 2.5 ML을 추가 (최종 concenMES의 tration 100㎜로는 magnetoferritin의 최종 농도 / ㎖, 단백질의 총량이 10 mg)을 2 mg을 임.
- 자석 교반기를 추가하고 2 시간이 평형 동안 교반한다.
- 조심스럽게 1 M 염산을 사용하여 pH를 5.0 솔루션을 조정합니다.
- DMPA / magnetoferritin 용액에 EDC 분말 141 mg을 추가합니다.
- 3.5 시간 동안 교반을 계속합니다.
- 모든 침전물을 제거하기 위하여 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 용액을 필터.
- 투석 버퍼를 대체하는 12-14 kDa의 분자량 컷오프 투석 튜브의 용액을 첨가하고 4 ℃에서 2 일 동안 50 mM의 NaCl을 함유하는 50mM의 인산 완충액 (pH 7)의 4 L에 대해 투석 적어도 세 이 기간 동안 번.
참고 :이 시점에서, 양이온 magnetoferritin를 더 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
양이온 Magnetoferritin 3. 인간 중간 엽 줄기 세포 라벨링
- 총론
- 4 일 - 단층이 175cm 2 플라스크 모든 3 보충 된 배양 배지, 20 ㎖를 사용하는 등 문화 세포. 배양액을 1,000 ㎎ / ℓ의 글루코오스, 10 % (v / v)의 소 태아 혈청, 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액, 1 %를 함유하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)로 구성 (V / V) L -alanyl-L 글루타민 용액 5 NG / ㎖로 보충 된 신선한 인간 섬유 아세포 성장 인자.
- 양이온 magnetoferritin와 hMSC의 자기 라벨
- 종자 15 만 25cm 2 플라스크에 중배엽 줄기 세포와 하룻밤에 37 ° C를 준수 둡니다.
- 필터는 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 양이온 magnetoferritin 소독 및 단백질 농도를 결정한다.
- 무균 조건 유지, 양이온 magnetoferri의 0.5 μM 용액을 제조인산 주석 식염수 (PBS)를 버퍼. 사용할 때까지 멸균 문화 후드에 덮인 유지합니다.
- 실온 PBS 2 ㎖로 도금 된 세포를 씻으십시오.
- 도금 셀에 살균 양이온 magnetoferritin 용액 1ml를 추가하고 원하는 시간 (1 분에 1 시간) 동안 품어.
- 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 0.5 mL를 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 배양하여 PBS로 세포를 수확하고 세포를 세척한다.
- 트립신 / EDTA를 비활성화 524 x g에서 5 분 동안 15 mL의 원심 분리 튜브에서 원심 분리하여 용액을 전송하는 배지 1 ㎖를 추가한다.
- 뜨는을 취소하고 소 태아 혈청과 PBS에서 2 mM의 EDTA (/ V 승) 0.5 %로 구성, 0.5 ml의에서 세포 펠렛 자기 분리 버퍼를 다시 일시 중지합니다.
- 자기 세포 분리
- 멀티 스탠드에 자석을 부착하고 자석에 자기 분리 컬럼을 추가 할 수 있습니다. 번째의 사전 분리 필터를 놓고전자 열입니다.
- 사전 분리 필터에 자기 분리 완충액 0.5ml를 배치하고, 필터 및 세척하고 젖은 열 모두를 통해 실행할 수 있습니다.
- 열에서 15 ML의 원심 분리기 튜브를 놓습니다.
- 자기 분리 컬럼의 필터 저장조에 세포 현탁액 0.5ml를 추가.
- 저수지가 비어있는 경우, 자기 분리 버퍼의 0.5 ml에 추가 할 수 있습니다.
- 저수지가 비어있는 경우, 자기 분리 버퍼의 추가 0.5 ml에 추가 할 수 있습니다.
- 한 번 더 (1.5 ml를해야 세척에 사용되는 자기 분리 버퍼의 총 부피)를 반복합니다. 이러한 세척 단계는 컬럼 (비자 성 세포 분획)의 모든 비 - 자성 세포를 용출.
- 자석에서 열을 제거하고 신선한 15 ML의 원심 관에 넣습니다. 열 저수지에서 필터를 제거합니다.
- 리저버에 자기 분리 완충액 1 ㎖를 첨가하고 제조가 제공 플런저를 사용하여 칼럼을 통해 밀어 즉시아르 자형. 이는 원심 분리 튜브 (자화 세포 분획)로 자화 칼럼으로부터 용출 세포.
- 원심 분리기 524 X g에서 5 분 모두 튜브.
- 뜨는을 취소하고 0.3 ml의 PBS의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 혈구를 사용하여 각 분획물의 세포 수의 수를 계산.
- 자화 된 세포의 비율을 결정 M (%)은 다음의 방정식을 사용하여 :
N (M)의 자화 분획 및 N의 셀의 수이다 (M + NM)의 자화와 비자 성 분획의 셀의 개수의 합이다.
- 유도 결합 플라즈마 광 방출 분광법을 사용하여 철 정량 양이온 magnetoferritin으로 표시 중배엽 줄기 세포를 준비 (ICP-OES)
주 : 프로토콜은 다른 ICP-OES 악기에 적응해야 할 수도 있습니다. 다시와 상담하는 것이 좋습니다책임있는 기술자.- g X 524에서 5 분간 세포를 공지 된 수를 원심 분리기.
- PBS를 상층 액을 제거하고 50 % (v / v)의 질산 0.25 ml를 추가합니다.
- 소용돌이는 산성화 세포 현탁액을 섞는다.
- 실온에서 밤새 인큐베이션.
- 각각의 샘플 및 와류 믹스에 증류수 4.75 ML을 추가합니다.
- ICP-OES로 분석합니다. (28)
- 셀룰러 철 함량에 대한 값을 결정하기 위해 셀의 개수에 대한 측정 된 철 함량 정규화.
Representative Results
TEM은 apoferritin 캐비티 내부 나노 광물을 확인하고 평균 코어 크기 (도 1A 및 1B)를 결정하는 데 사용되었다. 흠 magnetoferritin 샘플 이미지 분석은 8.2 ± 0.7 nm의 평균 코어 직경을주고, aurothioglucose 얼룩 단백질 케이지 내의 나노 입자의 존재를 확인했다. 이미지가 더 균일 한 나노 입자 코어를 분리, 자기 분리를 이용하여 정제 하였다 magnetoferritin 시료를 표시합니다. 자기 정제되지 않은 샘플 Magnetoferritin 약간 넓은 코어 크기 분포를 갖는다. 선택 영역 전자 회절을 사용 magnetoferritin 코어의 구조 (29) 분석이 가능 마그네타이트에 기초하여 상기 역 스피넬 구조의 존재 FE (3 O 4) 및 / 또는 마그 헤 마이트 (γ-FE 2 O 3)뿐만 아니라, 등을 지시 스피넬 구조 CO 3로 인한 4. 또한, 라만 스펙트럼의 Fe 3 O 4, 작은 γ-철 2 O 3의 양, 및 코발트 페라이트 (그림 1 C)에 의한 피크를 한 것으로 밝혀졌습니다. magnetoferritin의 ICP-OES 분석 magnetoferritin 밀리그램 당 코발트 철 102 μg의 0.9 μg의 평균을 나타내었다.
도식은 다음 양이온 화 단계 (그림 2 A)을 보여주는 포함되어 있습니다. 동적 광 산란에 의해 측정 magnetoferritin 및 양이온 magnetoferritin의 수력 학적 지름은 각각 11.8 ± 1.1 내지 12.5 ± 1.4 나노 미터이었다. magnetoferritin에 공유 결합 DMPA의 양이온 화 효율 제타 전위차 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 형 (MALDI-TOF) 질량 스펙트럼을 사용하여 평가 하였다. 제타 전위는 확인, 양이온 magnetoferritin에 대한 + 8.3 MV에 MF에 대한 -10.5 MV 변경양의 (표 1)에 음의 표면 전위의 변화. 질량 분석 실험은 기본 아포 페리틴 및 양이온 아포 페리틴 (그림 2 B)에 대한 21.1 kDa의 20.1 kDa의의 서브 유닛 분자량을 발견했다. 이 질량 증가는 약 12 DMPA 결합 단백질 서브 유니트 당 분자 전체 24 서브 유닛 단백질의 288 잔기의 양이온 화에 해당한다.
자기 포화 및 감수성은 SQUID magnetometry를 사용하여 측정하고, 횡 방향 및 종 이완성은 자기 공명 영상을 이용하여 측정 하였다. 자기 특성 양이온 화는 동봉 된 SPION (표 1)의 자기 특성에 무시할 영향을 미치고 있음을 나타냅니다 magnetoferritin 및 양이온 magnetoferritin 비슷 하였다. 또한, 이러한 특성은 MAGNE을 양이온 19,30 시연 다른 철 산화물 기반 나노 입자와 유사toferritin는 영상의 명암을 향상에서 기존의 SPION 기반 MRI 조영제로 적합 할 것입니다.
30 분의 노출 후에 세포 표면은 밀집 양이온 magnetoferritin (도 3 A)으로 덮여 있었다. 그러나 일주일 후, 더 나노 입자는 세포 표면 (그림 3 B)에서 찾을 수 없습니다. 양이온 magnetoferritin는 자기 라벨 중배엽 줄기 세포에서 매우 효과적이었다. 특히 1 분간 양이온 magnetoferritin에 세포를 노출시키는 단계 세포 집단의 92 %의 자화 및 셀 당 철 3.6 PG의 전달 결과. 전체 세포 집단 (도 3 C)의 자화 결과 15 분 배양 시간을 증가시킨다.
그림 1 : magnetof의 특성 erritin 코어는 5 %, 코발트가 도핑. aurothioglucose (A) 및 염색 (B)로 염색 magnetoferritin의 TEM 화상. 삽입은 자철광 인덱스와 해당 전자 회절을 보여줍니다. 스케일 바 : 20 nm의. magnetoferritin에 대한 (C) 라만 스펙트럼. 화살표는 코발트 페라이트 (T의 2G), 마그네타이트와 마그 헤 마이트 (A 1g 모두)의 주요 라만 진동 모드를 나타낸다. 31,32 사용되는 레이저 파장은 532 nm였다. (오쿠다 등. (18)에서 적응 이미지). 이 magnetoferritin 샘플이 더 균일하게로드 magnetoferritin 입자를 격리 자기 분리를 사용하여 정제되었다고합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : magnetoferritin의 양이온 화. A) 단백질 표면에 산성 (적색 배포) 기본적인 (노란색) 아미노산 잔기를 나타내는 용매 접근 가능한 표면 영역 표현. (1) Magnetoferritin 단백질 표면 (3)의 산성 아미노산 잔기의 카르 보디이 미드 DMPA 매개 가교시켜 양이온 magnetoferritin (2)로 변경된다. 아포 페리틴 및 양이온 아포 페리틴 서브 유닛의 B) 질량 분광 분석. MALDI-TOF에 의해 생성 된 대량으로 충전 (m / z) apoferritin의 스펙트럼 (ApoF) 및 양이온 apoferritin (고양이 ApoF). 21.1 kDa의 20.1 kDa 내지 질량 증가는 양이온 화 이후에 관찰된다. (코레 Carreira 등의 알에서 적응 이미지. 15) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 자기 라벨 및 양이온 magnetoferritin 배양 중배엽 줄기 세포의 세포 분리. 양이온 magnetoferritin와 30 분 배양 후 중배엽 줄기 세포의 A) TEM 이미지입니다. 화살표는 밀집 세포 표면 포장 magnetoferritin 코어의 존재를 나타낸다. 스케일 바 : 200 nm의. 라벨 후 hMSC 일주일 B) TEM 이미지입니다. 세포 표면의 양이온 magnetoferritin 분명하다. 자성 표지의 신속성 조사 C) 세포 집단의 92 %가 magnetoferritin 양이온을 0.5 μM로 1 분 노출 후 착자하고, 전체 세포 집단은 15 분 이내에 자화시켰다. 셀당 철 함량은 ICP-OES를 사용하여 측정 하였다. 세 생물 복제의 평균과 표준 편차가 표시됩니다. 코레 Carreira 등의 알에서 적응 (이미지. 15) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| MF | 고양이 MF | |
| 유체 역학적 직경 [나노] | 11.8 ± 1.1 | 12.5 ± 1.4 |
| 제타 전위 [MV] | (-) 10.4 ± 0.2 | 8.3 ± 0.7 |
| 자기 포화 모멘트 [암 2kg -1] | 54.9 ± 1.6 | 55.3 ± 1.4 |
| 질량 감수성 [이 × 10 4m 3kg -1] | 1.75 ± 0.08 | 1.75 ± 0.07 |
| 세로 이완성 [mM의 -1 초 -1] | 2.6 ± 0.1 | 2.3 ± 0.1 |
| 가로 이완성 [mM의 -1 초 -1] | 44.6 ± 1.0 | 52.8 ± 0.8 |
표 1 : magnetoferritin의 물리 화학적 특성 (MF) 및 양이온 magnetoferritin (고양이-MF). (표 코레 Carreira 등의 알에서 적응. 15)
Discussion
aurothioglucose로 염색 magnetoferritin 샘플의 TEM은 단백질 케이지 안에 나노 입자의 성공적인 광물을 밝혔다. 전자 회절 및 나노 입자 코어의 라만 분석 코발트 나노 입자 코어의 성공적인 도핑을 나타내는 코발트 페라이트의 존재를 나타내었다. 이는 혼합 산화물 나노 입자가 성공적 아포 페리틴 공동 내에 광화 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 더욱이, 우리는 코발트 도핑 자기 특성의 조정을 가능하게하는 반응 혼합물에 첨가 코발트 전구체의 양을 변화시킴으로써 변화 될 수 있음을 미리 보여 주었다. (18)
Magnetoferritin 합성은 그들이 단단히 밀봉하고 반응물 (예를 들면, 3 구 둥근 바닥 플라스크)를 도입 할 수있는 액세스 포트를 가지고, 용기의 다양한 수행 될 수있다. 반응 온도에서 선박을 배치하여 하나 65 ° C로 유지되어야더블 재킷 용기를 사용하여 물 / 오일 목욕이나. 여기서는 합성을 수행하는 이중 쟈켓 전기 화학 셀 셋업을 사용 하였다. 정확한 pH를 유지하고, 수성 용액의 산소 오염을 방지 성공적인 합성을 보장하는 것이 중요하다. 금속 염 용액은 항상 사전에보다는 사용하기 갓 전에 준비를해야합니다. 또한, 상업 apoferritin 솔루션은 품질 변화 및 합성 결과에 영향을 미칠 수있다 (예., 나노 입자 코어 광물의 크기). 그것은 제조자에 의해 사용되는 임의의 잔류 환원제를 제거하기 전에 합성의 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.6)로 apoferritin 용액을 투석 것을 도울 수있다. 합성에 사용 된 아포 페리틴 솔루션의 배치 번호를 기록하는 데 유용합니다, 그래서 특별히 추가 자료 요구가 구입하는한다 제조 업체에서 요구 될 수있다. 또한, 시판 아포 페리틴 단백질 농도는 수 있고, 병 명시해야합성에 필요한 아포 페리틴 용액의 부피를 계산하는 데 이용 될 수있다. 그렇지 않은 경우,이 정보 공급자에게 문의.
여기서 이전 보고서에서 제시된 - - 금속 염 및 과산화수소적인 첨가의 장점은 나노 입자 코어 광물 상이한 로딩 인자 (즉, 나노 크기)이 달성 될 수 있도록 제어 될 수 있다는 것이다. (33) 또한, 상기 예는 자기 분리 컬럼, 전자석 내부에 고정 스테인레스 스틸 분말을 충전 한 컬럼을 사용 magnetoferritin 정제 할 수있다. (34) 따라서, 고도로 단 분산 나노 입자 코어는 벌크 magnetoferritin 샘플로부터 분리 될 수있다. 그러나, 자기 셀 라벨에 관해서는 여기에 제시된이 필요하지 않습니다. magnetoferritin 합성의 한계는 약 10 %의 상대적으로 낮은 합성 수율 및 상업 APO-FE의 비교적 높은 비용rritin 솔루션을 제공합니다. 그러나, 아포 페리틴은 확립 탈 광화 프로토콜에 따라 페리틴 싸게 가능한 말의 비장으로부터 제조 될 수있다. (16)
magnetoferritin의 양이온 화는 DMPA 250 분자 및 음으로 하전 된 잔기 당 EDC 50 분자의 몰비를 추가함으로써 달성되었다 (계산 말 비장의 페리틴의 아미노산 서열에 기초하여). 단백질을 통해 시약이 초과 또한 이전에 페리틴의 양이온 화에 대한 결과를보고하는 비교 높은 양이온 화 효율성, 결과. MALDI-TOF 분석 apoferritin 및 양이온 apoferritin 35 때문에 magnetoferritin 코어의 과도한 분자량으로 하였다. 높은 양이온 화 효율을 수득하기 위해, 최적 pH는 또한 중요하다. EDC 매개 가교는 약간 산성 조건 하에서 가장 효과적이며, 우리는 pH가 5 magnetoferritin을위한 최적의 양이온 화 결과를 산출 한 것으로 나타났습니다. 그러나, 다른 단백질의 C에 대한ationization의 pH를 최적화 할 필요가있다. 이 심한 침전으로 이어질 수 있기 때문에 양이온 화 또는 단백질의 등전점 부근은 피해야한다.
양이온 magnetoferritin 줄기 세포 자화 고효율이고 배양 시간도 30 분 이하 사용하여 달성 될 수있다. 심지어 1 분 인큐베이션 MRI 용 T2 및 T2 * 콘트라스트에 영향을 요구보고 범위 인 3.6 PG의 셀룰러 철 함량 결과. 36, 37은이 효율 라벨링 낮은 세포 외 철 농도가 달성되는 것이 현저하다. 예를 들어, 음이온 나노 입자를 사용하여 기존의 연구는 5 mM의 철과 30 분 잠복기 후 세포 당 10 페이지의 철 수준을보고합니다. 비교 (38)는 0.5 μM 단백질을 함유하는 양이온 용액 magnetoferritin 배양은 약 0.2 밀리미터 철 인큐베이션에 대응하고, 또한 철 CEL 당 약 10 페이지를 얻을30 분 후 리터. 우리는 분명히 TEM을 사용하는 endocytotic 소포를 식별 할 수 없습니다. 그러나, 양이온 페리틴을 사용하여 기존의 연구는 국제화 노출의 처음 10 분 이내에 발생한 것으로 나타났습니다. 39, 40 양이온 페리틴은 clathrin- 또는 카베 올린 따라 세포 내 이입을 나타내는 코팅 된 소포, 지역화 될 수있다. 동일한 연구에서도 30 분간 인큐베이션 한 후, 양이온 페리틴이 리소좀 닮은, 세포 표면에 존재뿐만 아니라 multivesicular 체 여전히 것을보고했다.
또한 응용 프로그램은 항암 약물 (41) 또는 양자점 (42)와 같은 다른 나노 입자 및 / 또는 기능 분자,로드 아포 페리틴 케이지의 양이온 화를 포함 할 수있다. 이러한 페리틴 구조의 양이온 화는 세포에 자신의화물을보다 빠르고 효율적으로 전달 될 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
| apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
| cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
| Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
| Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml |
| ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
| HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
| ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
| sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 ml/min |
| automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
| Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
| Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
| N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
| dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration |
| penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
| trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
| MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
| MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
| Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
| Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
| Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
| JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
| InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
| Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
| Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
| ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
| Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
| Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
| Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
| 710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells | |
References
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
- Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
- Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
- Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
- Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
- Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
- Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
- Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
- Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
- Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
- Correia Carreira,, S,, et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
- Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
- Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
- Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
- Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
- Danon, D., Skutelsk E, M. arikovsY., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
- Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
- Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
- Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
- Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
- Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
- Williams, A., Frasca, V., et al. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hagel, L., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , John Wiley & Sons, Ltd. 1 (2000).
- Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
- Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
- Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
- Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
- Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
- Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601 (2012).
- Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
- Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
- Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
- Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
- MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
- Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
- Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
- Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).
