A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.
Mange vigtige biomedicinske applikationer, såsom cell imaging og remote manipulation, der kan opnås ved mærkning af celler med superparamagnetiske jernoxid nanopartikler (SPIONs). At opnå tilstrækkelig cellulær optagelse af SPIONs er en udfordring, der traditionelt har været opfyldt ved at udsætte celler for forhøjede koncentrationer af SPIONs eller ved at forlænge eksponeringstider (op til 72 timer). Men disse strategier sandsynligvis til at mediere toksicitet. Her præsenteres syntesen af protein-baserede Spion magnetoferritin samt en let overfladefunktionalisering protokol, der muliggør hurtig celle magnetisering anvendelse af koncentrationer lave eksponeringsniveauer. Den Spion kerne af magnetoferritin består af cobalt-dopet jernoxid med en gennemsnitlig partikeldiameter på 8,2 nm mineraliseret inden i hulrummet af hestemilt apo-ferritin. Kemisk kationisering af magnetoferritin produceret en hidtil ukendt, stærkt membran-aktive Spion der magnetiseres humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) under anvendelse af inkubationstider somkort som et minut og jern koncentrationer som nedture som 0,2 mM.
Surface binding eller internalisering af superparamagnetiske jernoxid nanopartikler (SPIONs) har gjort det muligt magnetisering af en række celletyper til applikationer såsom billedbehandling og remote manipulation. 1 imidlertid at opnå tilstrækkelig cellulær magnetisering kan være en udfordring, især når interaktionen mellem Spion og celleoverfladen er svag. 2 I koncentrationerne sidste, langvarig eksponering eller høj Spion er blevet ansat som strategier til at overvinde denne udfordring. 3,4 desto mindre er disse strategier er problematisk, fordi de øger toksicitet 5,6 og har meget begrænset succes i celletyper med lave internalisering priser, såsom lymfocytter. 7. For at øge cellulære optagelse af SPIONs, har flere overfladefunktionalisering tilgange blevet udforsket. For eksempel er antistoffer blevet anvendt til at fremme receptormedieret endocytose, 8 mens ikke-specifik optagelse kan opnås under anvendelse transfektion agents 9,10 eller celle-penetrerende arter, såsom HIV tat-peptid. 11,12 imidlertid antistof- og peptid funktionalisering tilgange begrænset af dyre reagenser og komplekse syntetisk præparat, mens transfektionsmidler, kan inducere nanopartikel udfældning og påvirke cellefunktion. 13,14
Vi har for nylig rapporteret syntesen af kemisk kationiseret magnetoferritin, en hidtil ukendt Spion som var meget effektivt til magnetisering humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) under anvendelse af inkubationstider så korte som et minut. 15 Magnetoferritin syntetiseres ved rekonstituering af en Spion inde i demineraliseret hulrum i jern opbevaring protein ferritin. 16 Dette protein-baserede Spion kombinerer mange egenskaber, der gør det velegnet til celle magnetisering, såsom kontrol over de magnetiske egenskaber af den magnetiske kerne, 17-19 og biokompatibilitet og vandig opløselighed knyttet til protein shell. Længeremere, er overfladefunktionalisering let opnås på grund af adresserbare aminosyrer, der kan være kemisk 20-22 eller genetisk modificeret. 23-25 Vi har vist, at kemisk kationisering af de sure aminosyrerester i proteinet skallen genererer en stabil nanopartikel, som let interageret med anioniske domæner på celleoverfladen fører til en hurtig og vedvarende celle magnetisering. Denne procedure eliminerer behovet for besværlige funktionalisering og langvarige inkubation protokoller, og på grund af ikke-specifik mekanisme mærkning denne hurtige magnetisering strategi bør finde udbredt anvendelse i andre celletyper. Her præsenteres en grundig rapport af den ultra-hurtig metode mærkning celle, herunder detaljerede protokoller til syntese, oprensning og overfladefunktionalisering af kationiseret magnetoferritin.
TEM af magnetoferritin prøver farvet med aurothioglucose afslørede den vellykkede mineralisering af nanopartikler inde i proteinet bur. Elektron diffraktion og Raman analyse af nanopartikel kerne indikerede tilstedeværelsen af en cobalt-ferrit, hvilket indikerer vellykket doping af nanopartikel kerne med cobalt. Dette viser, at blandede oxid nanopartikler succes kan være mineraliseret i apo-ferritin hulrum. Endvidere har vi vist tidligere, at kobolt doping kan varieres ved at ændre mængden af cobalt precursor tilsættes til reaktionsblandingen, som muliggør indstilling af de magnetiske egenskaber. 18
Magnetoferritin syntese kan udføres i en række af skibe, så længe de er stramt forseglelig og har adgang porte hvorigennem reaktanter kan indføres (f.eks, en tre-halset rundbundet kolbe). Reaktionstemperaturen bør holdes på 65 ° C, enten ved at anbringe beholderen ien vand / olie bad eller ved anvendelse af en dobbelt-beholder med kappe. Her brugte vi en dobbelt-dobbeltvægget elektrokemisk celle setup til at udføre syntesen. For at garantere vellykket syntese og fastholde den korrekte pH og undgå forurening oxygen af de vandige opløsninger er afgørende. Metalsaltopløsninger bør altid fremstilles umiddelbart før brug snarere end på forhånd. Endvidere kan kommercielle apoferritin løsninger varierer i kvalitet og påvirke syntese udfald (f.eks., Størrelse nanopartikel kerne mineraliseret). Det kan hjælpe til at dialysere apoferritin opløsningen i 50 mM HEPES puffer (pH 8,6) før syntese at fjerne eventuel overskydende reduktionsmiddel anvendes af fabrikanten. Det er nyttigt at gøre et notat af batchnummer apo-ferritin opløsning, der anvendes til syntese, så det kan være specifikt anmodet producenten skal yderligere materiale skal købes. Desuden bør det protein koncentrationen af kommercielt tilgængelige apo-ferritin angives på flasken, hvilket kananvendes til at beregne mængden af apo-ferritin opløsning nødvendig til syntese. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du kontakte leverandøren for denne information.
Fordelen ved gradvis tilsætning af metalsalte og hydrogenperoxid – som vist her og i tidligere rapporter – er, at der kan styres således, at forskellige belastningstilstande faktorer (dvs. nanopartikler størrelser) kan opnås mineralisering af nanopartikel kerne. 33 Endvidere er det muligt at oprense magnetoferritin yderligere anvendelse af en magnetisk separation kolonne, fx en søjle pakket med rustfrit stål pulver fastgjort inde i en elektromagnet. 34 Således kan stærkt monodisperse nanopartikler kerner isoleres fra størstedelen magnetoferritin prøven. Men for magnetisk cellemærkning som præsenteres her dette er ikke påkrævet. En begrænsning ved magnetoferritin syntese er den relativt lave syntese udbytte på ca. 10%, og den relativt høje pris på kommerciel apo-ferritin løsninger. Imidlertid kan apo-ferritin også fremstilles ud fra billigt tilgængelig hest milt ferritin ved at følge etablerede de-mineralisering protokoller. 16
Kationisering af magnetoferritin blev opnået ved at tilsætte et molforhold på 250 molekyler af DMPA og 50 molekyler af EDC pr negativt ladet rest (beregningerne baseret på aminosyresekvensen af hestemilt-ferritin). Dette overskud af reagens forhold protein resulterede i høje kationisering effektivitet, sammenlignes også tidligere rapporterede resultater for kationiseringen af ferritin. 35 For MALDI-TOF analyse, apoferritin og kationiseret apoferritin blev brugt på grund af den overdrevne molekylmasse af magnetoferritin kerne. For at give høje kationisering effektivitet, optimal pH er også afgørende. EDC-medieret tværbinding er mest effektiv under mildt sure betingelser, og vi fandt, at pH 5 gav optimale kationisering resultater for magnetoferritin. Men for andre proteiner cationization pH kan skal optimeres. Kationisering i eller tæt på det isoelektriske punkt for proteinet, bør undgås, da dette kan føre til alvorlig udfældning.
Stamceller magnetisering med kationiseret magnetoferritin var meget effektiv og kunne opnås ved hjælp af inkubationstider godt under 30 minutter. Selv et minuts inkubation resulterede i et cellulært jernindhold på 3,6 pg, hvilket ligger inden for rapporterede område, der kræves for at påvirke T2 og T2 * kontrast til MRI. 36,37 Det er også bemærkelsesværdigt, at denne effektive mærkning opnås med lave ekstracellulære jern koncentrationer. For eksempel tidligere undersøgelser under anvendelse af anioniske nanopartikler rapporterer jern niveauer på 10 pg per celle efter en 30 minutters inkubationsperiode med 5 mM jern. 38 Til sammenligning inkubation med et kationiseret magnetoferritin opløsning indeholdende 0,5 pM protein svarer til inkubation med ca. 0,2 mM jern- og også giver ca. 10 pg jern pr cell efter 30 minutter. Vi var ikke i stand til klart at identificere eventuelle endocytotiske vesikler hjælp TEM. Men tidligere undersøgelser ved hjælp af kationiseret ferritin fandt, at internalisering forekom inden for de første ti minutter af eksponering. 39,40 Kationiseret ferritin kunne være lokaliseret i coatede vesikler, hvilket indikerer clathrin- eller caveolin-afhængig endocytose. De samme undersøgelser rapporterede endvidere, at efter 30 minutters inkubation, stadig kationiseret ferritin var til stede på celleoverfladen, samt i multivesikulære organer, der ligner lysosomer.
Yderligere anvendelser kunne omfatte kationisering af Apo-ferritin bure lastet med andre nanopartikler og / eller funktionelle molekyler, såsom anticancerlægemidler 41 eller quantum dots 42. Kationisering af disse ferritin konstruktioner kan resultere i hurtigere og mere effektiv levering af deres last til celler.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL |
ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 mL/min |
automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration |
penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL |
phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells |