A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.
Viele wichtige biomedizinische Anwendungen, wie Zell Bildgebung und Fernmanipulation können durch Markierung Zellen mit superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel (SPIONs) erreicht werden. ausreichende zelluläre Aufnahme von SPIONs zu erreichen, ist eine Herausforderung, die durch Aussetzen Zellen zu erhöhten Konzentrationen von SPIONs oder durch Verlängerung Belichtungszeiten (bis zu 72 Stunden) traditionell erfüllt hat. Allerdings sind diese Strategien wahrscheinlich Toxizität zu vermitteln. Hier präsentieren wir die Synthese des Proteinbasis SPION magnetoferritin sowie eine leichte Oberflächenfunktionalisierung-Protokoll, das die Magnetisierung mit niedrigen Expositionskonzentrationen schnelle Zelle ermöglicht. Der SPION Kern magnetoferritin besteht aus Kobalt-dotiertes Eisenoxid mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 8,2 nm mineralisierten innerhalb des Hohlraums des Pferds Milz apo-Ferritin. Chemische Kationisierung von magnetoferritin erzeugt eine neuartige, hochmembranaktive SPION, die humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) magnetisiert unter Verwendung von Inkubationszeiten alskurz als einer Minute und Eisenkonzentrationen als Tiefs als 0,2 mm.
Oberflächenbindung oder Internalisierung von superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel (SPIONs) hat Magnetisierung einer Vielzahl von Zelltypen für Anwendungen wie Bildverarbeitung und Fernmanipulation aktiviert. 1 kann jedoch eine ausreichende zelluläre Magnetisierung zu erreichen sein , eine Herausforderung, vor allem , wenn die Wechselwirkung zwischen der SPION und der Zelloberfläche schwach ist. 2 In der Vergangenheit längerer Exposition oder hoher SPION Konzentrationen wurden als Strategien verwendet , um diese Herausforderung zu überwinden. Trotzdem 3,4 sind diese Strategie sehr problematisch , weil sie Toxizität 5,6 und haben sehr begrenzten Erfolg in Zelltypen mit geringer Internalisierung Raten, wie Lymphozyten erhöhen. 7 Zur Verbesserung haben die zelluläre Aufnahme von SPIONs, mehrere Oberflächenfunktionalisierung Ansätze wurden untersucht. Beispielsweise wurden Antikörper verwendet rezeptorvermittelte Endozytose, 8 zu fördern , während nicht-spezifische Aufnahme Transfektion a erreicht werden kann unter Verwendung vonHAU 9,10 oder zellpenetrierenden Arten, wie HIV tat-Peptid. Jedoch 11,12, Antikörper und Peptid Funktionalisierung Ansätze werden durch teure Reagenzien und komplexe synthetische Herstellung beschränkt, während Transfektionsagentien Nanopartikel Fällung induzieren können und sich negativ auf die Zellfunktion beeinflussen. 13,14
Vor kurzem berichteten wir über die Synthese von chemisch kationisierte magnetoferritin, eine neuartige SPION die in Magnetisierungs humanen mesenchymalen Stammzellen hoch wirksam war (hMSCs) Inkubationszeiten so kurz wie 1 Minute verwendet wird. 15 Magnetoferritin wird durch Rekonstitution eines SPION im Inneren des demineralisiertem Hohlraum des Eisenspeicherprotein Ferritin synthetisiert. 16 Diese Proteinbasis SPION kombiniert viele Eigenschaften , die es gut geeignet für die Zell Magnetisierung wie die Kontrolle über die magnetischen Eigenschaften des Magnetkerns, 17-19 und Biokompatibilität und Wasserlöslichkeit durch die Proteinhülle übertragen werden. Des Weiterenmehr wird Oberflächenfunktionalisierung leicht aufgrund adressierbaren Aminosäuren erreicht , die chemisch 20-22 oder genetisch modifiziert sein kann. 23-25 Wir haben gezeigt , dass die chemische Kationisierung der sauren Aminosäurereste des Proteinhülle eine stabile Nanopartikel erzeugt , die leicht mit anionischen Bereichen auf der Zelloberfläche in Wechselwirkung führt zu einer schnellen und anhaltende Zell Magnetisierung. Dieses Verfahren beseitigt die Notwendigkeit mühsamer Funktionalisierung und langwierige Inkubationsprotokolle und aufgrund der nicht-spezifischen Kennzeichnung Mechanismus dieser schnelle Magnetisierung Strategie sollte weitverbreitete Anwendung in anderen Zelltypen zu finden. Hier präsentieren wir eine eingehende Bericht der ultraschnelle Zellmarkierungsverfahren, einschließlich detaillierter Protokolle der Synthese, Reinigung und Oberflächenfunktionalisierung von kationisierten magnetoferritin.
TEM von magnetoferritin Proben gefärbt mit Aurothioglucose zeigte die erfolgreiche Mineralisierung von Nanopartikeln innerhalb des Proteinkäfig. Elektronenbeugung und Raman-Analyse der Nanopartikel-Kern zeigte die Anwesenheit eines Kobaltferrit, was anzeigt erfolgreichen Dotierungs des Nanopartikels Kern mit Kobalt. Dies zeigt, dass Mischoxid-Nanopartikel erfolgreich mineralisierte innerhalb der apo-Ferritin Hohlraum sein kann. Darüber hinaus haben wir gezeigt, daß die zuvor Kobaltdotierung durch Veränderung der Menge an Kobalt Vorstufe zu dem Reaktionsgemisch zugegeben variiert werden kann, die Abstimmung der magnetischen Eigenschaften ermöglicht. 18
Magnetoferritin Synthese kann in einer Vielzahl von Gefäßen durchgeführt werden, solange sie dicht verschließbaren sind und Zugangsöffnungen , durch die Reaktanden eingeführt werden können (beispielsweise in einem Dreihalsrundkolben). Die Reaktionstemperatur sollte, indem das Gefäß auf 65 ° C gehalten werden, entweder inein Wasser / Ölbad oder ein Doppelmantelgefäß mit. Hier verwendeten wir einen Doppelmantelaufbau elektrochemischen Zelle, um die Synthese durchzuführen. Zu gewährleisten erfolgreiche Synthese, den richtigen pH aufrechtzuerhalten und Sauerstoffkontamination der wässrigen Lösungen zu vermeiden, ist von entscheidender Bedeutung. Metallsalzlösungen sollten immer frisch vor vorbereitet werden und nicht zu verwenden, als im Voraus. Darüber hinaus können kommerzielle Apoferritin – Lösungen in Qualität variieren und Synthese Ergebnis beeinflussen (z. B. Größe der Nanopartikel – Kern mineralisierten). Es kann helfen, die Apoferritin-Lösung in 50 mM HEPES-Puffer (pH 8,6) vor der Synthese zu dialysieren restliche Reduktionsmittel vom Hersteller verwendet zu entfernen. Es ist nützlich, notieren Sie die Chargennummer des apo-Ferritin-Lösung für die Synthese verwendet zu machen, so kann es speziell vom Hersteller sollten zusätzliches Material notwendig gekauft werden angefordert werden. Darüber hinaus sollte die Proteinkonzentration von im Handel erhältlichen apo-Ferritin auf der Flasche angegeben werden, woverwendet werden, um das Volumen von apo-Ferritin-Lösung zur Synthese erforderlich zu berechnen. Ist dies nicht der Fall ist, sich an den Lieferanten für diese Informationen.
Der Vorteil der schrittweisen Zugabe von Metallsalzen und Wasserstoffperoxid – wie hier und in früheren Berichten dargestellt – ist , dass die Mineralisierung des Nanopartikels Kern so gesteuert werden kann , dass unterschiedliche Belastungsfaktoren (dh Nanopartikels Größen) erreicht werden kann. Darüber 33 ist es möglich , zu reinigen magnetoferritin ferner eine Säule magnetische Trennung unter Verwendung von , beispielsweise eine Säule , die mit rostfreiem Stahlpulver innerhalb eines Elektromagneten befestigt ist . Daher 34, hochmonodispersen Nanopartikelkerne können aus der Masse magnetoferritin Probe isoliert werden. Jedoch für die magnetische Zellmarkierung wie hier dargestellt ist dies nicht erforderlich. Eine Einschränkung magnetoferritin Synthese ist die relativ geringe Syntheseausbeute von etwa 10%, und die relativ hohen Kosten der kommerziellen apo-ferritin Lösungen. Es können jedoch auch apo-Ferritin von billig verfügbar Pferd Milz durch folgenden etablierten de-Mineralisierung Protokolle Ferritin hergestellt werden. 16
Kationisierung von magnetoferritin durch Zugabe eines molaren Verhältnis von 250 Molekülen DMPA und 50 Molekülen pro EDC negativ geladenen Rest (Berechnungen auf der Basis der Aminosäuresequenz von Pferde Milz-Ferritin) erzielt wurde. Dieser Überschuss an Reagenz über Protein führte zu hohen Kationisierung Effizienz, vergleichbar auch für die Kationisierung von Ferritin zuvor berichteten Ergebnisse. 35 für die MALDI-TOF – Analyse, Apoferritin und kationisierte Apoferritin wurden wegen der übermäßigen Molekularmasse des magnetoferritin Kern verwendet. Um ergeben hohe Kationisierung Effizienz, optimaler pH-Wert ist auch von entscheidender Bedeutung. EDC-vermittelte Vernetzung ist am effektivsten, unter leicht sauren Bedingungen, und wir fanden, dass pH 5 optimal Kationisierung Ergebnisse für magnetoferritin ergab. Jedoch für andere Proteine cationization pH kann optimiert werden müssen. Kationisierung an oder nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins sollte vermieden werden, da dies zu schweren Ausfällen führen kann.
Die Stammzell Magnetisierung mit kationisierten magnetoferritin war sehr effizient und erreicht werden konnte Inkubationszeiten deutlich unter 30 Minuten unter Verwendung. Selbst eine einminütigen Inkubation führte zu einer zellulären Eisengehalt von 3,6 pg, die innerhalb der gemeldeten Bereich ist erforderlich, um T2 und T2 beeinflussen * Kontrast für MRI. 36,37 Es ist auch bemerkenswert , dass diese effiziente Markierung mit niedrigen extrazellulären Eisenkonzentrationen erreicht wird. Zum Beispiel mit früheren Studien anionische Nanopartikel berichten Eisengehalt von 10 pg pro Zelle nach einer 30-minütigen Inkubationszeit mit 5 mM Eisen. 38 Im Vergleich dazu Inkubation mit einem kationisierten magnetoferritin Lösung , die 0,5 & mgr; M – Protein mit etwa 0,2 mM Eisen entspricht Inkubation enthält und auch etwa 10 pg Eisen pro cel ergibtl nach 30 Minuten. Wir waren eindeutig nicht in der Lage, um alle endozytotische Vesikel identifizieren TEM. Jedoch fand früheren Studien kationisierte Ferritin mit, dass die Internalisierung innerhalb der ersten zehn Minuten der Exposition aufgetreten. 39,40 kationisierte Ferritin konnte in beschichteten Vesikeln lokalisiert werden, was darauf hinweist clathrin- oder Caveolin-abhängige Endozytose. Dieselben Studien berichteten auch, dass nach 30 Minuten Inkubation kationisierte Ferritin noch auf der Zelloberfläche war, sowie in multivesikulären Körpern, ähnlich Lysosomen.
Weitere Anwendungen könnten Kationisierung von apo-Ferritin Käfige beladen mit anderen Nanoteilchen und / oder funktionelle Moleküle, wie Antikrebsmittel 41 oder Quantenpunkte 42 umfassen. Die Kationisierung dieser Ferritin-Konstrukte könnten schneller und effizienter Lieferung ihrer Ladung zu Zellen führen.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL |
ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 mL/min |
automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration |
penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL |
phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells |