Summary
Протокол для извлечения пигментов из наноструктурированных гранул в кальмара Doryteuthis pealeii хроматофоров представлена.
Introduction
Головоногие , такие как кальмары, каракатицы и осьминоги имеют возможность динамически изменять их внешний вид для маскировке и сигнализации. 1-6 Эта возможность поддерживается частично за счет селективного расширения ареала пигментных органов , известных как хроматофоров. 4,7-9 Хроматофоры являются мягкие приводы , которые содержат сеть наноструктурированных гранул пигмента заключены внутри cytoelastic саккулюса, которая закрепляется в радиальном направлении от мышечных волокон. 1,3 Как они приводятся в действие, хроматофоры расширить на 500% площади поверхности , представленной распределяя гранулы по всему органу. 3,7 , 10,11 Когда это действие согласованные в течение ряда хроматофорами, общая окраска животного изменяется. Хотя известно, что гранулы пигмента способствуют этому изменению цвета, их состав остается неизвестным. Опишем процедуру для выделения и очистки хроматофора пигменты, которые могут быть адаптированы для будущих композиционными исследований.
3,12 хроматофора содержащий ткани собирают путем тщательного экстирпации из головоногих. Процесс переваривания и гомогенизация затем используется для диссоциировать окружающие ткани и отделяют хроматофора клетки. Наноструктурные гранулы затем выделяют и очищают из оставшихся хроматофорами повторными ультразвуковую обработку и центрифугирование. После очистки, пигменты извлекаются из гранул в процессе , который приспособлен от добычи видимого цвета с крыльями бабочки с использованием кислых растворов метанола. 13 с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) и спектрофотометрии используются для подтверждения того, что хроматофора пигменты успешно извлечены с помощью этот процесс.
Этот метод описывает выделение хроматофора гранул, который используется для изучения молекулярных вклад в Coloration в головоногих. 12 Небольшие молекулы Выписки из всех животных часто может быть долгим и трудоемким процессом. Целью здесь является информирование будущих исследователей эффективного и легкому протокола для приобретения пигментов из наноструктурированных гранул в головоногих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования, проведенные на животных Беспозвоночные в настоящем документе, не регулируется в Соединенных Штатах; Поэтому по уходу и использованию животных комитет Institutional не имеет полномочий для рассмотрения таких протоколов. Вместо них, не подпадающих под юрисдикцию регулирования в Соединенных Штатах, авторы настоящим заявляю, что эти исследования были проведены с искренние усилия к этическому использованию, уходу и лечению этих животных, число людей, было сведено к минимуму, и эти усилия согласуются с положениями Базельской декларации и Международного совета по науке лабораторных животных (ICLAS) руководящих принципов этики.
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Вскрытие
- Покупка обезглавлены кальмар D. pealeii из Департамента морских ресурсов в Морской биологической лаборатории в Вудс - Хоул, штат Массачусетс или из любого свежего рыбного рынка. Не следует использовать образцы, которые были скругленные или ранее изменены, чтобы применить эту процедуру. В частности, цветностьtophore слой должен оставаться нетронутым на образце.
- Если животные не используются сразу, хранить их при температуре -20 ° С до использования. Для размораживания образцов, поместите их в воде комнатной температуры в течение 1 ч перед вскрытием.
- Использование нержавеющей стали прямые тонкой точкой рассечение ножницами, разрезать вдоль задней части животного. Начало у основания вентральной мантии, и заканчивается в области плавника.
- Удалить все внутренние органы (желудок, жабры, чернила железы, половых органов, системные сердца, и плечевая сердца), поднимая их с рассекает щипцов и разъединяя их соединительной ткани с помощью рассечение ножницами. Откажитесь органы в образце мешок.
- Используйте рассекает T-булавки, чтобы прикрепить мантию (плавник стороной вверх) в стандартном 11-1 / 2 "х 7-1 / 2" х 1-1 / 2 "алюминиевая рассечение ванночку, содержащую гибкую рассечение площадку. Погрузите ткань в 250 мл морской воды, которая была отфильтрована через систему вакуумной фильтрации одноразовые из полистироласодержащий размеры пор 0,2 мкм.
- Осторожно снимите слой эпидермиса кожи (непрозрачный цвет) с рассекающих пинцетом, держа хроматофора содержащий слой кожи нетронутыми. После того, как эпидермальный слой удаляется, отбросить его в образце мешок.
- Рассеките небольшие (1 см х 1 см) участки хроматофора слоя с пинцетом и рассечение ножницами. Сбор образцов в 1,5 мл микро-центрифужные пробирки (заполнить одну половину каждой пустой трубы с рассеченной ткани).
- Добавьте 500 мкл отфильтрованной морской воды в ткани, содержащей трубки. Образцы могут храниться в течение ночи при температуре 4 ° С.
2. Разделительный хроматофора пигментные гранулы
- Ткань Переваривание
- Получение папаин / коллагеназы
- Взвешивают 30 мг коллагеназы и 5 мг папаин с использованием 4 "х 4" азот низкого вес бумаги. Передача их в полипропиленовую центрифужную пробирку емкостью 50 мл с завинчивающейся крышкой.
- Мера 10 мл deionizе изд воды с помощью градуированной пипетки. Добавить непосредственно в пробирку, содержащую папаин / коллагеназы. Vortex на максимальных настройках, пока раствор не станет прозрачным.
- Удаление внеклеточного Ткань
- Центрифуга собранной хроматофора ткани от стадии 1.7 в течение 5 мин при 14000 х г. Выбросить верхний слой морской воды в ведро пластиковых отходов.
- Добавьте 500 мкл раствора папаина / коллагеназы на ткань с использованием P1000 переменного объема одноканальный микропипетки. Vortex каждый образец в течение 1-2 мин на максимальных настройках.
- Разрушать ультразвуком образцов в течение 5 мин при частоте 40 кГц, чтобы диссоциировать клетки от окружающей ткани.
- Центрифуга в течение 5 мин при 14000 х г. Удалите супернатант в ведро пластиковых отходов.
- Центрифуга собранной хроматофора ткани в течение 5 мин при 14000 х г. Выбросить верхний слой морской воды в ведро пластиковых отходов. Повторите еще раз.
- Вручную удалите оставшуюся большую тканевую секции, которые не переваривают в этом процессе с щипцами, прежде чем перейти к следующему шагу.
- Получение папаин / коллагеназы
- Выделяя пигментные гранулы
- Подготовка буфера усреднении
- Взвешивают 2,38 г (4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота) (HEPES, 100 мМ), 0,095 г хлорида магния (10 мМ), 0,856 г калия-аспартата (50 мМ), и 0,015 г дитиотреитола (1 мМ). Перенести в полистироловые контейнер емкостью 150 мл с завинчивающейся крышкой. Добавьте один ингибитор коммерческий мини-таблетка протеазы.
- Мера 100 мл деионизированной воды с помощью градуированного цилиндра. Добавить непосредственно в контейнер, содержащий соли гомогенизацией. Vortex до решения ясна.
- Усреднение пигментные гранулы
- Центрифуга каждого образца, начиная с шага 2.1 при 14000 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант в ведро пластиковых отходов. Этот образец должен быть лишенной внеклеточного ткани.
- Добавить 500 &# 181; л буфера для гомогенизации в каждую пробирку и вихря в течение 1-2 минут каждый, чтобы тщательно перемешать образцы. Разрушать ультразвуком образцов в течение 30 мин (~ 40 кГц), а затем с 5 мин центрифугирования при 14000 х г.
- Удалите супернатант в ведро пластиковых отходов, и повторите предыдущий шаг 2-3 раза, чтобы обеспечить полное переваривание в хроматофор саккулюс и белка фалов. Оставшийся раствор должен содержать светло-желтый супернатант и красного цвета осадок, содержащий отдельные гранулы пигмента.
- Подготовка буфера усреднении
3. Пигмент Extraction
- Получение кислым метанолом (HCl-MeOH)
- Осторожно добавьте 25 мкл концентрированной (36.5-38% (вес / вес)) хлористо-водородной кислоты (HCl) в 5 мл метанола (MeOH). Хранить раствор HCl-MeOH в стеклянном флаконе с завинчивающейся крышкой образца. Вихревой осторожно, чтобы равномерно перемешать раствор.
Примечание: Чем более кислый раствор, тем больше пигмент будет извлекаться в течение фипервый экстракции.
- Осторожно добавьте 25 мкл концентрированной (36.5-38% (вес / вес)) хлористо-водородной кислоты (HCl) в 5 мл метанола (MeOH). Хранить раствор HCl-MeOH в стеклянном флаконе с завинчивающейся крышкой образца. Вихревой осторожно, чтобы равномерно перемешать раствор.
- Добыча Пигмент
- Центрифуга суспензия пигмента гранул (от 2.2.2) в течение 5 мин при 14000 х г и отбросить супернатант в ведро пластиковых отходов.
- Добавьте 500 мкл раствора HCl в MeOH и вихревые каждый образец на ~ 3-4 мин. Разрушать ультразвуком образцов в течение 10 мин (~ 40 кГц), а затем центрифугировать в течение 5 мин при 14000 х г.
- С помощью пипетки передачи, сбора супернатанта в завинчивающейся крышкой стеклянную пробирку 1 драмовом. Супернатант должен быть темно-красного цвета.
- Повторите стадию экстракции 3.2.2 до тех пор, не далее цвет не извлекается (~ 4-5 промывок).
Примечание: Каждая экстракция даст ~ 1,5 мл пигмента. Оставшийся осадок бесцветный пигмент, извлеченный гранулы. Примечание: бесцветные гранулы и экстрагированные пигменты могут храниться в воде при температуре 4 ° С до дальнейшего использования.
4. Характеристика на протяжении процесса экстракции
- Сканирование Эльectron Микроскопия
- Изображение гранулы (не вступившие в реакцию со стадии 2.2.1 и пигмент-извлеченного из стадии 3.2.3) с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), чтобы проверить чистоту процесса экстракции.
- Для подготовки образцов гранула для обработки изображений, первый центрифуге обоих непрореагировавших гранул и пигментных извлеченный гранул в течение 5 мин при 14000 х г, и отбросить супернатант в ведро пластиковых отходов. Повторное приостановить их в 1 мл этанола, и хранилищами 2-3 капли суспензии гранул на алюминиевую SEM пней с использованием передачи пипетки.
- После сушки образцов в течение ночи, разбрызгивание пальто с золотым покрытием из платины в течение 3 мин, чтобы достигнуть 15-нм покрытие.
- Изображение с помощью сканирующего электронного микроскопа с Шоттки излучатель и детектор вторичных электронов. Используйте напряжение пучка 5-7 кВ и рабочее расстояние между 8 и 9 мм до изображения этих материалов.
- Видимой области ультрафиолетового (UV-VIS) спектрофотометрических измерений
- Контроль за абсорбцию профайлы для всех 3-х условий (непрореагировавший гранула из 2.2.2, экстрагируют пигмент из 3.2.3, и пигмент экстрагируют гранулы из 3.2.4) с использованием двойной спектрофотометр пучка от 200-800 нм.
- Сбор пустой измерение с помощью деионизованной воды в 1 мл кювету для непрореагировавших гранул и пигментных извлеченный гранул. Собирают спектры поглощения UV-VIS для обоих образцов.
- Сбор пустой измерение с помощью кислотного раствора метанола в 1 мл кювету для извлеченного пигмента. Собирают UV-VIS спектр поглощения для образца.
- Определить максимальную длину волны каждого образца путем определения длины волны, при которой оптическая плотность пик достигает максимального значения относительной высоты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хроматофоры отсекают от D. pealeii спинные мантии (рис 1А, 1В). После того, как они будут удалены, хроматофоры лизируют и очищают с помощью центрифугирования и циклов стирки , чтобы выделить из пигментные гранулы (Фигуры 2А, 2В). Кислотные растворы метанола (HCl-MeOH) используются для извлечения пигмента из гранул (рис 2С), что дает растворимый экстракт пигмента и нерастворимые, бесцветный пигмент экстрагируют гранулы.
Процесс экстракции уменьшает средний диаметр гранул. Это наблюдается с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Перед тем как гранулы подвергаются HCl-MeOH, они имеют средний диаметр (527,3 ± 91,8) нм (N = 100, погрешность стандартное отклонение; фигура 3А). Когда пигмент извлекается из гранул, уменьшение размерас до (202,6 ± 32,2) нм (N = 100, ошибка стандартное отклонение; Рисунок 3B). Это уменьшение размера гипотетически быть связано с извлечением пигмента из гранул при обработке HCl-MeOH.
Чтобы проверить эту гипотезу, различия в видимом цвете до и после экстракции контролируются с помощью световой микроскопии и спектрофотометрии. После добавления HCl-MeOH, цвет , связанный с непрореагировавшим гранул заметно уменьшает (фиг.4А). Это дополнительно характеризуется использованием UV-VIS спектрофотометрии (рис 4б), где наблюдается широкий профиль оптической плотности (~ 280-800 нм) для предварительно извлеченный гранул и пост-извлеченный гранул, хотя и в гораздо меньшей интенсивностью; в то время как, растворимый экстракт пигмент обладает лямбда-макс с центром при ~ 500 нм с плечом при ~ 380 нм. Итак, эти данные указывают на то метод успешно извлекать видимый цвет из гранул.
Рисунок 1: Хроматофоры из кальмаров D. pealeii. (A) Squid D. pealeii спинные мантии. (B) Светлое поле изображение красного, желтого и коричневых хроматофоров. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Иллюстрация процесса экстракции (A) Хроматофоры расчленены. (B) пигментные гранулы удаляются из гомогенизированных хроматофора ткани и очищают с помощью серии центрифугирования и определения циклов стирки. (С) Пигмент может быть ех выведенного из гранул с использованием HCl-МеОН с получением растворимого пигмента верхний слой , который отделяют от бесцветного пигмента извлеченных гранул. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: HCl-MeOH экстракции Кастраты диаметры наноструктурированных гранул на сканирующем электронном микроскопе (А) предварительно кислым метанолом извлеченный пигментных гранул и (б) после кислым метанолом извлеченный гранулы пигмента.. Шкала бар = 1 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
загрузить / 54803 / 54803fig4.jpg "/>
Рисунок 4: HCl-МеОН экстракция изменяет видимый цвет наноструктурных гранул (А) Светлое поле изображения гранул пигмента на протяжении всего процесса экстракции.. (B) спектры поглощения предварительно (черный) - и после (синий) -. Экстракции вместе с пигментом супернатанта (красный) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировали метод извлечения пигментов из кальмаров хроматофора гранул. Конкретное ориентации гранул, наша цель состоит в том, чтобы определить их роль в опосредовании адаптивную окраску. Этот метод отличается от предыдущих отчетов , предназначенных для характеристики головоногих пигментов с использованием массивных образцов ткани 14 или сублимированные кожу 15.
В то время как этот протокол эффективен при извлечении хроматофора пигментов, она ограничена малыми масштабами реакции. Анатомический один кальмар урожаи ~ 11 мг очищенных гранул. Приблизительно 58% этой массы содержит растворимый пигмент, который извлекается с использованием раствора HCl в MeOH. 12 чистота исходного хроматофора ткани непосредственно влияет на выход продукта из одного рассечения. Если образцы оказываются загрязнены избытком эпидермального или iridophore ткани, собранной во время вскрытия, то лучше, чтобы отделить содержимое образца, ресуспендируют их в дополнительном BUFфер, и начать гомогенизацию шаги снова. Разделительный чистую популяцию пигментных гранул из хроматофора ткани может занять целых восемь, 4 циклов ч обработки ультразвуком, которые могли бы распределить по 4-х дней. Важно, чтобы оставаться пациента в изоляции, чтобы обеспечить чистой популяции гранул пигмента.
Чистота исходного раствора гранула также влияет на стадиях экстракции пигмент с HCl-MeOH. Если гранулы поглощаются непереваренной ткани, просто вихрь и разрушать ультразвуком образцы до 1 ч и гомогенизировать пробу перед повторным началом добычи. Часто 4-5 промывок с использованием 500 мкл HCl-MeOH на пробу необходимо извлечь пигмент из гранул. Если все сделано правильно, то эта процедура будет давать от 2-3 мл растворимого пигмента на пробу. При дополнительной очистки используют с помощью тонкослойной хроматографии, выделенные пигменты разделяются на четыре уникальных фракций, содержащих различные концентрации xanthommatin и decarboxylated xanthommatin. 12
Этот метод может быть использован химики, биологи, или инженеров, чтобы лучше понять роль пигментов в цветовой модуляции. Присутствие пигмента внутри гранул предполагает иерархическую механизм окрашиванию в головоногих, который берет свое начало с молекулярными компонентами, содержащимися в наноструктурированного хроматофора гранул пигмента. Эти данные могут быть использованы для информирования инженерно-технических систем, предназначенных для имитации динамический диапазон адаптивного цвета, отображаемого в головоногих с использованием предварительно упакована пигментные наночастицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).
