Summary
一种颜料从纳米颗粒鱿鱼Doryteuthis pealeii色素细胞提取协议提出。
Introduction
头足类如鱿鱼，墨鱼，章鱼必须动态改变其为伪装和信令外观的能力。1-6这种能力部分地由被称为色素细胞色素器官的选择性面积扩张支撑。4,7-9色素细胞是包含一个cytoelastic球囊内局限于纳米色素颗粒是由肌纤维径向固定网络软执行器。1,3-当他们被启动，色素细胞500％中提出表面积整个器官分配颗粒扩大3,7 ，10,11当该动作一致在若干色素细胞的，动物的整体着色被改变。而，已知的颜料颗粒有助于这种颜色的变化，它们的组合物仍然不明。我们描述了一种方法分离和纯化可被适于将来组成研究色素细胞色素。
。3,12含有色素细胞的组织是通过从头足类小心摘除收获。然后将消化和均化过程用于解离周围组织并分离色素细胞的细胞。纳米结构的颗粒然后使用重复超声处理和离心剩余的色素细胞分离和纯化。经纯化，颜料是从一个过程中的颗粒是从由蝴蝶翅膀可见颜色的提取使用酸性甲醇溶液适于萃取。13扫描电子显微镜（SEM）和分光用于确认色素细胞色素使用成功地提取这一过程。
该方法描述了一种用于探索到c的分子贡献色素细胞颗粒的隔离oloration在头足类动物。从整体动物12小分子的提取往往是一个漫长而乏味的过程。这里的目的是为了通知有效和容易的协议的未来研究人员为购自于头足类动物的纳米颗粒颜料。
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Protocol
在此进行在美国不受监管的无脊椎动物的研究;因此，机构的动物护理和使用委员会对这种协议的审查没有权威。代替美国法规管辖的这些不脱落，作者特此声明，这些研究是与对道德采用真诚的努力，护理和治疗这些动物，最小化的个人的数量和这些努力进行与巴塞尔宣言和国际理事会实验动物科学（ICLAS）的道德准则是一致的。
1. Doryteuthis pealeii（D. pealeii）解剖
- 购买断头鱿鱼D. pealeii从在伍兹霍尔，马海洋生物实验室的海洋资源部或任何新鲜的鱼类市场。不要使用已鱼片或以前才能申请此过程中改变了标本。具体地讲，色度tophore层仍必须是对检体保持完整。
- 如果动物未立即使用，它们储存在-20℃直到使用。解冻的标本，将它们放置在室温水中夹层前1小时。
- 使用不锈钢直细点解剖剪刀，沿动物的后侧切割。开始在腹侧套的底部，并在散热片区域结束。
- 通过解剖镊和解剖用剪刀割断他们的结缔组织解除他们删除所有的内脏（胃，鳃，油墨腺，生殖器官，全身心脏和肱心脏）的。丢弃在试样袋器官。
- 使用在标准的11-1 / 2解剖T型引脚针地幔（翅片的一面朝上）“×7-1 / 2”×1-1 / 2“铝夹层锅含有挠性夹层垫。淹没在所述组织250毫升海水已经通过一个一次性聚苯乙烯真空过滤系统过滤含有0.2微米的孔尺寸。
- 仔细解剖钳去除肌肤表皮层（不透明的颜色），保持含色素细胞皮肤层完好无损。一旦该表皮层被去除，丢弃在试样袋。
- 解剖用钳子和解剖剪刀色素细胞层的小（1毫升×1厘米）的部分。收集在1.5ml微离心管样品（填充的解剖组织每个空管的一半）。
- 加入500微升过滤海水以含有管组织。可将样本过夜，在4℃保存。
2.隔离色素细胞色素颗粒
- 组织消化
- 木瓜蛋白酶/胶原酶的制备
- 称出30毫克胶原酶和使用4“×4”低氮5毫克木瓜蛋白酶的称量纸。转移这些到50ml的聚丙烯离心管中带有螺旋盖。
- 测量10毫升deioniz的用刻度吸量管版水。直接添加到小瓶含木瓜蛋白酶/胶原酶。直到解决方案中的最高设置涡是明确的。
- 删除外组织
- 离心从步骤1.7收集到的色素细胞组织进行5分钟在14000×g的。丢弃海水的顶层成废塑料桶。
- 加入500μl木瓜蛋白酶/胶原酶溶液中使用P1000的体积可变的单通道微管组织。涡旋在最高设置1-2分钟每个样品。
- 超声处理5分钟将样品在40 kHz的频率，以从周围组织分离的细胞。
- 离心机在14,000×克5分钟。弃去上清液进入废塑料桶。
- 离心收集色素细胞组织进行5分钟在14000×g的。丢弃海水的顶层成废塑料桶。再次重复。
- 手动删除任何剩余的大型组织秒系统蒸发散未在此过程中，用镊子在继续下一步骤之前消化。
- 木瓜蛋白酶/胶原酶的制备
- 隔离色素颗粒
- 匀浆缓冲液的制备
- 权衡2.38克的（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸）（HEPES，100毫摩尔），0.095mmol克氯化镁（10毫摩尔），0.856克氢天冬氨酸（50毫摩尔），0.015克二硫苏糖醇（1毫米）。转移到150ml的聚苯乙烯容器用螺帽。添加一个小型商用平板电脑蛋白酶抑制剂。
- 用量筒量取100毫升去离子水。直接添加到含有均化的盐的容器。涡旋直至溶液澄清。
- 色素颗粒同质化
- 离心从步骤2.1每一样品以14,000 xg离心5分钟。弃去上清液进入废塑料桶。该样品应是无效的细胞外组织。
- 添加500＃181：L匀浆缓冲液中，以每管，涡旋每1-2分钟，以彻底混合样品。超声处理30分钟（〜40 kHz）的样品，并按照与14,000×克5分钟离心。
- 弃去上清液进入废塑料桶，然后重复前面的步骤2-3次，以确保球囊色素细胞和蛋白质系绳的完全消化。剩余的溶液应含有淡黄色上清液和含有所述分离的颜料颗粒一个红色沉淀。
- 匀浆缓冲液的制备
3.色素提取
- 酸性甲醇的制备（盐酸-甲醇）
- 小心加入25微升浓（36.5-38％（W / W））盐酸（HCl）至5毫升甲醇（MeOH中）。存储在螺丝帽玻璃样品瓶盐酸 - 甲醇溶液。摇动轻轻地解决混合均匀。
注意：多个酸性溶液中，越颜料将音响期间被提取首先提取。
- 小心加入25微升浓（36.5-38％（W / W））盐酸（HCl）至5毫升甲醇（MeOH中）。存储在螺丝帽玻璃样品瓶盐酸 - 甲醇溶液。摇动轻轻地解决混合均匀。
- 素的提取
- 离心5分钟将颜料颗粒悬浮液（从2.2.2）以14,000 xg离心并弃去上清液入废塑料桶。
- 加入500μl的盐酸甲醇溶液中，涡旋〜3-4分钟，每个样品。超声处理10分钟（〜40千赫）的样品中，然后离心以14,000×g下5分钟。
- 使用移液管，收集在1英钱螺旋盖玻璃小瓶上清液。上清应该是颜色深红。
- 直到没有进一步的颜色提取（〜4-5涤）重复提取步骤3.2.2。
注：每个提取将产生〜1.5毫升色素。剩下的无色颗粒是色素提取颗粒。注意：两个无色颗粒和萃取颜料可在4℃储存在水，直到进一步使用。
4.表征整个提取工艺
- 扫描萨尔瓦多ectron显微镜
- 图像将颗粒用扫描电子显微镜（SEM），以验证提取过程的纯度（从步骤2.2.1和颜料萃取从步骤3.2.3未反应）。
- 要在14000 XG准备颗粒样品进行成像，第一离心机既未反应的颗粒和色素颗粒提取5分钟，弃去上清液进入废塑料桶。在1ml乙醇中，并沉积在颗粒悬浮液的2-3滴上使用移液管的铝的SEM存根重新暂停这些。
- 过夜干燥该样品后，溅射与金 - 铂涂层涂层3分钟以达到15nm的涂层。
- 图像使用SEM与肖特基发射器和一个二次电子检测器。使用5-7千伏光束电压和8和9毫米至图象这些材料之间的工作距离。
- 紫外-可见（UV-VIS）光度法测量
- 监控吸光度亲所有3个条件的文件（从2.2.2未反应的颗粒，从3.2.3中提取色素，并从3.2.4色素提取颗粒）采用了双光束分光光度计从200-800纳米。
- 收集在1ml反应杯为未反应的颗粒和颜料提取颗粒使用去离子水的空白测量。收集两个样品的UV-Vis吸收光谱。
- 收集用1毫升比色杯中用于所提取的色素的酸性甲醇溶液的空白测定。收集样品的UV-Vis吸收光谱。
- 通过识别在该吸收峰达到最大值相对高度的波长测定各样品的最大波长。
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Representative Results
色素细胞从解剖D. pealeii背地幔（ 图1A，1B）。一旦被移除，色素细胞裂解，并使用离心和洗涤循环以分离出颜料颗粒（ 图2A，2B）纯化。酸性甲醇溶液（盐酸-甲醇）用于提取从颗粒（ 图2C）的颜料，产生可溶性色素提取物和不溶性，无色色素萃取颗粒。
提取过程减少了颗粒的平均直径。这是通过使用扫描电子显微镜（SEM）观察。之前将颗粒暴露于盐酸-甲醇，它们具有（527.3±91.8）纳米的平均直径（N = 100，误差标准偏差; 图3A）。当颜料从颗粒中提取，尺寸减小s至（202.6±32.2）纳米（N = 100时，误差是标准差; 图3B）。这种尺寸减小推测是由于颜料的从时用HCl-MeOH处理所述颗粒的提取。
为了检验这一假设，在可见的颜色前，后提取的差异是使用光镜和分光光度法监测。在加入HCl-MeOH中的，与未反应的颗粒相关联的颜色明显减少（ 图4A）。这是通过使用紫外-可见分光光度法（ 图4B），其中，一个宽吸收轮廓（〜280-800纳米）被用于预提取颗粒和后萃取的颗粒在低得多的强度观察到的，尽管其特征还在于;同时，可溶性色素提取物表现出λ最大值在〜500nm的中心，与380〜纳米的肩膀。总的来说，这些数据表明的方法成功地提取该颗粒是可见的颜色。
图 1： 鱿鱼D.色素细胞pealeii。（A）鱿鱼D. pealeii背衣钵。 （B）的红色，黄色，和棕色色素细胞明场图像。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 提取过程图 （A）色素细胞被解剖。 （B）颜料的颗粒从匀浆色素细胞组织取出并使用一系列离心和洗涤周期的纯化。 （C）的颜料可以是前 tracted使用盐酸甲醇产生它是从无色色素提取分离颗粒可溶性色素上清颗粒。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 盐酸-甲醇萃取变造直径纳米颗粒 （A）的预酸性甲醇萃取色素颗粒扫描电子显微照片和（B）后的酸性甲醇萃取色素颗粒。比例尺= 1微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图4： 盐酸甲醇提取改变纳米颗粒的可见颜色 （A）明场色素颗粒在整个提取过程的图像。 （B）前（黑色）的吸收光谱-和post（蓝色） -与颜料上清液（红色）以及提取，请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们已经证明的方法来提取鱿鱼色素细胞颗粒颜料。通过专门针对颗粒，我们的目标是，以确定其在调节适应性着色作用。这种方法使用批量组织样本14或冷冻干燥的皮肤从15到设计的头足类动物的特征色素以前的报告不同。
虽然该协议是在提取色素细胞色素有效，它被限制为小反应的鳞片。解剖1鱿鱼产量〜11毫克纯化的颗粒。约该质量的58％含有12可溶性颜料，这是使用盐酸-甲醇溶液萃取。起始色素细胞组织的纯度直接影响从一个夹层产品的成品率。如果样本出现过剩表皮或解剖过程中收集iridophore组织污染，最好是分离出样品中的内容，在附加的buf重悬FER，并开始再次同质化步骤结束。隔离色素细胞组织的色素颗粒的纯净的人口可能会采取任何可能跨越4天跨越多达八个，4小时周期的超声波。它在隔离要保持耐心，以确保色素颗粒的纯净的人口是非常重要的。
起始颗粒溶液的纯度也影响用盐酸 - 甲醇的色素的提取步骤。如果该颗粒是由未消化的组织，只是涡流闭塞和最多1小时超声处理的样品，并再次开始提取前样品均质化。通常4-5次洗涤使用每个样品500μl的盐酸 - 甲醇中，需要提取该颗粒的颜料。如果做得正确，此过程将2-3毫升，每样可溶性色素之间产生。当通过薄层色谱法采用额外的纯化，分离的颜料分离成含有不同浓度的黄素和decarbo的四个独特的级分xylated黄素。12
这种方法可以通过化学家，生物学家或工程师可以利用，以更好地理解颜料的颜色调制的作用。颜料的颗粒内的存在表明在头足类着色分级机构，它与包含纳米结构化色素细胞色素颗粒内的分子成分起源。这些发现可用于通知旨在模仿使用预先包装的着色纳米颗粒在头足类动物显示自适应色彩的动态范围工程系统。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
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