Summary
Een protocol voor de extractie van de pigmenten uit de nanostructuur korrels in squid Doryteuthis pealeii chromatoforen wordt gepresenteerd.
Introduction
Koppotigen zoals inktvis, inktvis en octopus hebben de mogelijkheid om hun uiterlijk te camoufleren en signalering dynamisch veranderen. 1-6 Deze mogelijkheid wordt mede ondersteund door de selectieve areal uitbreiding van gepigmenteerde organen bekend als chromatoforen. 4,7-9 chromatoforen zijn zachte actuatoren die een netwerk van nanogestructureerde pigmentkorrels voordoen binnen cytoelastic sacculus radiaal is verankerd door spiervezels bevatten. 1,3 Daar ze bediend, chromatoforen breiden met 500% in gepresenteerd oppervlak verspreiden van de granules gedurende het orgel. 3,7 , 10,11 Wanneer deze actie onderling over een aantal chromatoforen de totale kleur van het dier wordt gewijzigd. Hoewel bekend is dat de pigmentkorrels bijdragen kleurverandering, de samenstelling is onbekend. We beschrijven een werkwijze voor het isoleren en zuiveren chromatophore pigmenten die kunnen worden aangepast voor toekomstig compositiestudies.
3,12 Chromat die weefsel wordt geoogst door zorgvuldige uitroeiing van de inktvis. Een digestie en homogeniseren wordt vervolgens gebruikt om het omringende weefsel dissociëren en scheiden de chromatophore cellen. De nanostructuur korrels zijn vervolgens geïsoleerd en gezuiverd uit de resterende chromatoforen met behulp van herhaalde sonicatie en centrifugeren. Na zuivering, worden pigmenten gewonnen uit de korrels in een proces dat geschikt is bij de winning van zichtbare kleur van vlindervleugels middels zure methanoloplossingen. 13 Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en spectrofotometrie worden gebruikt om te bevestigen dat de chromatophore pigmenten met succes worden geëxtraheerd door gebruik dit proces.
Deze werkwijze beschrijft de isolatie van chromatophore granules die wordt gebruikt om de moleculaire bijdragen c staandoloration in koppotigen. 12 kleine molecule extracties van gehele dieren kan vaak een lang en moeizaam proces zijn. Het doel is om toekomstige onderzoekers van een effectieve en gemakkelijke protocol te informeren voor de verwerving van pigmenten uit de nanostructuur korrels in koppotigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ongewervelde dieren studies hierin uitgevoerd worden niet geregeld in de Verenigde Staten; dus de Institutional Animal Care en gebruik Comite heeft geen bevoegdheid tot herziening van dergelijke protocollen. In plaats van deze die niet onder de jurisdictie van de regelgeving in de Verenigde Staten, de auteurs verklaar dat deze studies werden uitgevoerd met een oprechte poging in de richting van het ethisch gebruik, zorg en behandeling van deze dieren, het aantal personen dat werd geminimaliseerd en deze inspanningen zijn in overeenstemming met de Basel verklaring en de Internationale Raad voor Proefdierkunde (ICLAS) ethische richtlijnen.
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection
- Aankoop onthoofd inktvis D. pealeii van de afdeling Marine Resources in het Marine Biological Laboratory in Woods Hole, MA of van een verse vismarkt. Niet specimens die zijn filets of eerder gewijzigd om deze procedure te gebruiken. Met name de chromatophore laag moet nog intact op het monster zijn.
- Wanneer de dieren niet direct worden gebruikt, bewaar ze bij -20 ° C tot gebruik. Om de monsters te ontdooien, plaats ze in water op kamertemperatuur gedurende 1 uur voorafgaand aan de dissectie.
- Gebruikt roestvrij stalen rechte puntig dissectie scharen, langs de postérieure zijde van het dier te snijden. Begint bij de basis van de ventrale mantel en sluit op de vin gebied.
- Verwijder alle van de interne organen (maag, kieuw, inkt klier, voortplantingsorganen, systemische hart en arm hart) door ze te tillen met ontleden pincet en het afsnijden van hun bindweefsel met behulp van dissectie schaar. Gooi organen in een specimen zak.
- Gebruik ontleden T-pinnen om de mantel pin (fin zijde naar boven) in een standaard 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "aluminium dissectie pan met een flexibele dissectie pad. Dompel het weefsel in 250 ml van zeewater die door middel van een eenmalige polystyreen vacuümfiltratie systeem is gefilterdmet 0,2 urn poriën.
- Verwijder voorzichtig de epidermale huidlaag (ondoorzichtige kleur) met ontleden tang, het bijhouden van de chromatophore bevattende huidlaag intact. Zodra de epidermale laag wordt verwijderd, gooi het in een monster zak.
- Ontleden kleine (1 cm x 1 cm) delen van de chromatophore laag met een tang en dissectie schaar. Verzamel monsters in 1,5 ml micro-centrifugebuis (vul helft van elke holle buis met de ontleed weefsel).
- Voeg 500 gl gefiltreerd zeewater aan het weefsel bevattende buizen. De monsters kunnen 's nachts worden opgeslagen bij 4 ° C.
2. Isoleren Chromat pigmentkorrels
- tissue Spijsvertering
- Bereiding van Papaïne / collagenase
- Weeg 30 mg collagenase en 5 mg papaïne met een 4 "x 4" low stikstof wegen papier. Transfer deze in een 50 ml polypropyleen centrifugebuis met een schroefdop.
- Meet 10 ml deionized water met behulp van een gegradueerde pipet. Voeg direct naar flacon met papaïne / collagenase. Vortex hoogste stand totdat de oplossing helder is.
- Het verwijderen van extracellulaire Tissue
- Centrifugeer de verzamelde chromatophore weefsel van stap 1,7 gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Gooi de bovenste laag van het zeewater in een plastic afval emmer.
- Voeg 500 ul van de papaïne / collagenase-oplossing aan het weefsel via een P1000 variabel volume eenkanaals micropipet. Vortex elk monster gedurende 1-2 minuten op de hoogste stand.
- Sonificeer de monsters gedurende 5 minuten bij een frequentie van 40 kHz tot cellen dissociëren uit het omringende weefsel.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Verwijder het supernatant in een plastic afval emmer.
- Centrifugeer de verzamelde chromatophore weefsel gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Gooi de bovenste laag van het zeewater in een plastic afval emmer. Herhaal dit nogmaals.
- Handmatig verwijderen van alle resterende grote weefsel secgen die niet verteren in dit proces met een tang voordat u verder gaat met de volgende stap.
- Bereiding van Papaïne / collagenase
- Isoleren van de pigmentkorrels
- Bereiding van homogenisatiebuffer
- Weeg 2,38 g (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur) (HEPES, 100 mM), 0,095 g magnesiumchloride (10 mM), 0,856 g kalium-aspartaat (50 mM) en 0,015 g dithiotreïtol (1 mM). Over in een 150 ml polystyreen container met een schroefdop. Voeg een commerciële mini tablet proteaseremmer.
- Meet 100 ml gedemineraliseerd water met een maatcilinder. Voeg direct bij de container met de homogenisering zouten. Vortex totdat de oplossing helder is.
- Homogenisering van pigmentkorrels
- Centrifugeren elk monster uit stap 2.1 bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant in een plastic afval emmer. Dit monster moet leegte van extracellulaire weefsel.
- Voeg 500 &# 181; l van homogenisering buffer aan elke buis en vortex voor 1-2 minuten elk om grondig te mengen van de monsters. Sonificeer de monsters gedurende 30 min (~ 40 kHz) en volgen 5 min centrifugeren bij 14.000 x g.
- Verwijder het supernatant in een plastic emmer, en herhaal de vorige stap 2-3 keer naar de volledige vertering van de chromatophore sacculus en eiwitten tethers waarborgen. De overgebleven oplossing een lichtgele bovenstaande vloeistof en een roodgekleurde pellet met de geïsoleerde pigmentkorrels bevatten.
- Bereiding van homogenisatiebuffer
3. Pigment Extraction
- Bereiding van Zure Methanol (HCl-MeOH)
- Voeg voorzichtig 25 pl geconcentreerde (36,5-38% (w / w)) zoutzuur (HCl) tot 5 ml methanol (MeOH). Bewaar de HCl-MeOH oplossing in een schroefdop glazen monsterflesje. Roer voorzichtig gelijkmatig de oplossing te mengen.
OPMERKING: De zuurder de oplossing, hoe meer pigment in de fi extrahereneerste extractie.
- Voeg voorzichtig 25 pl geconcentreerde (36,5-38% (w / w)) zoutzuur (HCl) tot 5 ml methanol (MeOH). Bewaar de HCl-MeOH oplossing in een schroefdop glazen monsterflesje. Roer voorzichtig gelijkmatig de oplossing te mengen.
- Extractie van Pigment
- Centrifugeer het pigment korrel suspensie (vanaf 2.2.2) gedurende 5 min bij 14.000 xg Verwijder de bovenstaande vloeistof in een plastic afval emmer.
- Voeg 500 ul van het HCl-MeOH-oplossing en vortex elk monster gedurende ~ 3-4 min. Sonificeer de monsters gedurende 10 min (~ 40 kHz), centrifugeer 5 min bij 14.000 x g.
- Met behulp van een overdracht pipet, het verzamelen van de bovenstaande vloeistof in een 1 dram schroef-top glazen flacon. De supernatant dient donkerrood van kleur zijn.
- Herhaal de extractie stap 3.2.2 tot er geen kleur wordt onttrokken (~ 4-5 wasbeurten).
OPMERKING: Elke extractie zal opleveren ~ 1,5 ml pigment. Het resterende kleurloze pellet is het pigment geëxtraheerde granules. OPMERKING: De kleurloze korrels en geëxtraheerd pigmenten kunnen worden bewaard in water bij 4 ° C tot verder gebruik.
4. Karakterisering hele Extraction Process
- scanning Electron Microscopie
- Beeld de granules (ongereageerd uit stap 2.2.1 en pigment gewonnen uit stap 3.2.3) met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) om de zuiverheid van het extractieproces te controleren.
- Om korrel monsters voor te bereiden voor de beeldvorming, de eerste centrifuge zowel niet gereageerde korrels en pigment gewonnen granulaten voor 5 min bij 14.000 xg, en gooi de bovenstaande vloeistof in een plastic afval emmer. Resuspendeer deze in 1 ml ethanol en borg 2-3 druppels van de suspensie granule op aluminium SEM stubs met een transferpipet.
- Na drogen van de monsters overnacht sputter coater met goud-platina coating gedurende 3 minuten een 15 nm coating te bereiken.
- Afbeelding met behulp van een SEM met een Schottky emitter en een secundaire elektronen detector. Gebruik een 5-7 kV bundel spanning en een werkafstand tussen 8 en 9 mm op de foto om deze materialen.
- Ultraviolet-zichtbare (UV-vis) Fotometrische metingen
- Bewaken van de absorptie probestanden voor alle 3 voorwaarden (niet-omgezette korrel van 2.2.2, gewonnen pigment uit 3.2.3 en pigment gewonnen granulaat uit 3.2.4) met een dual beam spectrofotometer 200-800 nm.
- Verzamel een blanco meting met gedeïoniseerd water in een 1 ml cuvette het ongereageerde granules en granules pigment geëxtraheerd. Verzamel UV-Vis absorptiespectra voor beide monsters.
- Verzamel een blanco meting met de zure methanoloplossing in een 1 ml cuvette de opgezogen pigment. Verzamel UV-Vis absorptie spectrum voor monster.
- Bepalen maximum golflengte van elk monster door het identificeren van de golflengte waarbij de absorptie piek van de maximale relatieve hoogte bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chromatoforen worden ontleed uit de D. pealeii dorsale mantel (Figuur 1A, 1B). Zodra ze verwijderd worden chromatoforen gelyseerd en gezuiverd middels centrifugatie en wascycli te isoleren uit de gepigmenteerde granules (figuren 2A, 2B). Zure methanol oplossing (HCl-MeOH) worden gebruikt om het pigment van de korrels (figuur 2C) extract, waardoor een oplosbaar pigment extract en onoplosbare, kleurloze pigment geëxtraheerde granules.
Het extractieproces vermindert de gemiddelde diameter van de granules. Dit wordt waargenomen onder toepassing van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Voordat de korrels worden blootgesteld aan HCl-MeOH, ze hebben een gemiddelde diameter (527,3 ± 91,8) nm (N = 100, fout standaarddeviatie Figuur 3A). Wanneer het pigment wordt gewonnen uit de korrels, de verkleins aan (202,6 ± 32,2) nm (N = 100, fout standaarddeviatie Figuur 3B). Deze verkleining wordt verondersteld door de extractie van pigment van de korrel bij behandeling met HCl-MeOH zijn.
Om deze hypothese te testen, zijn de verschillen in zichtbare kleur voor en na extractie gevolgd met lichtmicroscopie en spectrofotometrie. Na toevoeging van HCl-MeOH, de kleur die bij de gereageerde korrels vermindert zichtbaar (Figuur 4A). Dit wordt verder gekarakteriseerd met behulp van UV-vis spectrofotometrie (figuur 4B), waarbij een brede absorptieprofiel (~ 280-800 nm) wordt waargenomen voor de pre-geëxtraheerde granules en post-geëxtraheerde granules, zij het veel lagere intensiteit; terwijl het oplosbare pigment extract vertoont een lambda max gecentreerd bij ~ 500 nm, met een schouder bij ~ 380 nm. Gezamenlijk suggereren deze gegevens een methode om de zichtbare kleur van de granules winnen uit.
Figuur 1: chromatoforen van pijlinktvis D. pealeii. (A) Squid D. pealeii dorsale mantel. (B) het veld afbeelding van rood, geel en bruin chromatoforen Bright. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Illustratie van extractieproces (A) chromatoforen worden ontleed. (B) Pigment korrels van chromatophore gehomogeniseerd weefsel verwijderd en gezuiverd met een reeks van centrifugatie en wascycli. (C) Het pigment kan worden ex steed uit de korrels met behulp van HCl-MeOH waarbij een oplosbaar pigment supernatant die gescheiden is van de kleurloze pigment gewonnen korrels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: HCl-MeOH extractie verandert diameters van de nanogestructureerde granules Rasterelektronenmicrografieën van (A) pre-zure methanol geëxtraheerd pigmentkorrels en (B) na zure methanol geëxtraheerd pigmentkorrels.. Schaal bar = 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
uploaden / 54803 / 54803fig4.jpg "/>
Figuur 4: HCl-MeOH extractie verandert zichtbare kleur van nanogestructureerde korrels (A) Bright gebied beelden van pigmentkorrels gedurende het extractieproces.. (B) De absorptie spectra van pre (zwart) - en post (blauw) -. Extractie samen met het pigment supernatans (rood) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een methode om pigmenten pijlinktvis chromatophore granules extract aangetoond. Door specifiek te richten op de korrels, ons doel is om hun rol in het bemiddelen van adaptieve kleur te bepalen. Deze methode verschilt van eerdere rapporten ontworpen om cephalopod pigmenten te karakteriseren met behulp van bulk weefselmonsters 14 of gevriesdroogd huid 15.
Hoewel dit protocol is effectief bij het extraheren chromatophore pigmenten wordt beperkt tot kleine reactie schaal. Ontleden van een inktvis levert ~ 11 mg van gezuiverd korrels. Ongeveer 58% van deze massa bevat het oplosbare pigment, dat wordt gewonnen met het HCl-MeOH-oplossing. 12 De zuiverheid van het uitgangsmateriaal chromatophore weefsel rechtstreeks welke productopbrengst van een dissectie. Indien de monsters verschijnen verontreinigd door overmatige epidermaal of iridophore weefsel tijdens de dissectie verzameld, is het beste te scheiden van de inhoud van het monster, resuspendeer ze extra buffer, en beginnen met de homogenisering stappen opnieuw. Het isoleren van een zuivere populatie van pigmentkorrels uit chromatophore weefsel kan wel acht, 4 uur sonicatie cycli die over 4 dagen kon overspannen nemen. Het is belangrijk om de patiënt blijft bij de isolatie van een zuivere populatie van pigmentkorrels waarborgen.
De zuiverheid van het uitgangsmateriaal granule oplossing beïnvloedt ook het pigment extractiestappen met HCl-MeOH. Als de korrels worden afgesloten door onverteerd weefsel, simpelweg vortex en ultrasone trillingen van de monsters tot 1 uur en homogeniseren van het monster alvorens opnieuw het begin van de extractie. Vaak 4-5 wasbeurten gebruiken 500 pl HCl-MeOH per monster nodig om het pigment van de korrels te extraheren. Als dit juist gebeurt, zal deze procedure opleveren tussen 2-3 ml oplosbaar pigment per monster. Wanneer aanvullende zuivering wordt toegepast via dunnelaagchromatografie, de geïsoleerde pigmenten scheiden in vier unieke fracties die variërende concentraties xanthommatin en decarboxylated xanthommatin. 12
Deze methode kan worden gebruikt door chemici, biologen, of ingenieurs om beter inzicht in de rol van de pigmenten in kleur modulatie. De aanwezigheid van het pigment binnen de granules suggereert een hiërarchisch mechanisme voor kleuring gedurende koppotigen welke afkomstig is van de moleculaire componenten vervat in nanogestructureerde chromatophore pigmentkorrels. Deze bevindingen kunnen worden gemanipuleerd om systemen die het dynamische bereik van adaptieve kleur weergegeven in koppotigen gebruik voorverpakte gepigmenteerde nanodeeltjes bootsen hoogte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).
