Summary
En protokoll for utvinning av pigmenter fra nanostrukturerte granulene i blekksprut Doryteuthis pealeii kromatofor er presentert.
Introduction
Blekkspruter som blekksprut, blekksprut og blekksprut har evnen til å dynamisk endre sitt utseende for å kamuflere og signalering. 1-6 Denne funksjonen støttes delvis av den selektive areal utvidelse av pigment organer kjent som kromatofor. 4,7-9 kromatofor er myke aktuatorer som inneholder et nettverk av nanostrukturerte pigment granulater trange innenfor en cytoelastic sacculus som er forankret radialt av muskelfibre. 1,3 Ettersom de er aktivert, kromatofor utvide med 500% i present areal å fordele granulater hele organ. 3,7 , 10,11 Når denne handlingen er samordnet over et antall kromatofor, blir den samlede fargen av dyret endret. Mens det er kjent at pigmentgranulater bidra til denne fargeendring, forblir deres sammensetning ukjent. Vi beskriver en fremgangsmåte for å isolere og rense chromatophore pigmenter som kan tilpasses for fremtidige komposisjonelle studier.
3,12 chromatophore inneholder vev er høstet gjennom forsiktig extirpation fra cephalopod. En fordøyelse og homogenisering prosess blir så brukt for å dissosiere det omgivende vev og skille de chromatophore cellene. Den nanostrukturerte granuler blir så isolert og renset fra de gjenværende kromatofor ved hjelp av gjentatt, ultralydbehandling og sentrifugering. Etter rensing blir pigmenter ekstrahert fra granuler i en prosess som er tilpasset etter utvinning av synlig farge fra kulisser ved hjelp av sure metanolløsninger. 13 Scanning elektronmikroskopi (SEM) og spektrofotometri blir anvendt for å bekrefte at chromatophore pigmentene med hell ekstraheres ved hjelp denne prosessen.
Denne fremgangsmåten beskriver isoleringen av chromatophore granuler som brukes for å utforske de molekylære bidrag til coloration i blekkspruter. 12 lite molekyl utdrag fra hele dyr kan ofte være en lang og langtekkelig prosess. Målet her er å informere fremtidige forskere av en effektiv og lettvint protokoll for anskaffelsen av pigmenter fra nanostrukturerte granulater i blekkspruter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Virvelløse dyr studier utført her, er ikke regulert i USA; derfor Institutional Animal Care og bruk komité har ingen myndighet for vurdering av slike protokoller. I stedet for disse ikke faller inn under jurisdiksjonen til regulering i USA, forfatterne herved oppgir at disse studiene ble utført med oppriktig innsats mot etisk bruk, omsorg og behandling av disse dyrene, antall individer ble minimert og dette arbeidet er i overensstemmelse med Basel-erklæringen og det internasjonale råd for Laboratory Animal Science (ICLAS) etiske retningslinjer.
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection
- Kjøpshalshugget blekksprut D. pealeii fra marine ressurser avdeling ved Marine Biological Laboratory ved Woods Hole, MA eller fra fersk fisk markedet. Ikke bruk prøver som er filet eller tidligere endret for å utføre denne prosedyren. Nærmere bestemt, chromatophore laget må fortsatt være intakt på prøven.
- Hvis dyrene ikke brukes straks, bør de oppbevares ved -20 ° C inntil bruk. For å tine prøvene, plassere dem i romtemperatur vann i 1 time før disseksjon.
- Ved hjelp av rustfritt stål rette fin-punkts disseksjon saks, klippe langs bakre side av dyret. Begynn på bunnen av ventral mantelen, og ender på finnen regionen.
- Fjern alle de indre organer (mage, Gill, blekk kjertel, reproduktive organer, systemisk hjerte, og brachialis hjerte) ved å løfte dem med dissekere pinsett og severing deres bindevevet ved hjelp av disseksjon saks. Kast organer i en prøvepose.
- Bruk dissekere T-pins til pin mantelen (fin siden opp) i en standard 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "aluminiums disseksjon panne med en fleksibel disseksjon pad. Senk vev i 250 ml sjøvann som har blitt filtrert gjennom et engangs-polystyren vakuumfiltreringssysteminneholdende 0,2 um porestørrelse.
- Fjern forsiktig epidermal hudlaget (opak farge) med dissekere tang, holde chromatophore inneholder hudlaget intakt. Når det epidermale sjikt fjernes, kaste den i en prøvepose.
- Dissekere små (1 cm x 1 cm) deler av chromatophore lag med pinsett og disseksjon saks. Utlevering prøvene i 1,5 ml mikro-sentrifugerør (fyller halvparten av hver tomme rør med den dissekerte vev).
- Legg 500 mL av filtrert sjøvann til vevet inneholdende rør. Prøvene kan lagres over natten ved 4 ° C.
2. Isola chromatophore pigmentgranula
- tissue Fordøyelse
- Utarbeidelse av Papain / kollagenase
- Vei opp 30 mg kollagenase og 5 mg papain ved hjelp av en 4 "x 4" lavt nitrogen veie papir. Overføre disse til et 50 ml polypropylen-sentrifugerør med skrukork.
- Mål 10 ml deionized vann ved hjelp av en gradert pipette. Legg direkte til hetteglass som inneholder papain / kollagenase. Vortex på den høyeste innstillingen til oppløsningen er klar.
- Fjerne ekstracellulær Tissue
- Sentrifuger de innsamlede chromatophore vev fra trinn 1,7 i 5 minutter ved 14 000 x g. Kast det øverste laget av sjøvann inn i en plastavfall bøtte.
- Legg 500 mL av papain / kollagenaseoppløsning til vevet ved hjelp av en P1000 variabelt volum enkeltkanal mikropipette. Vortex hver prøve for 1-2 min på den høyeste innstillingen.
- Sonikere prøvene i 5 min ved en frekvens på 40 kHz for å dissosiere celler fra det omgivende vev.
- Sentrifuger i 5 min ved 14000 x g. Kast supernatanten til et plastavfall bøtte.
- Sentrifuger oppsamlet chromatophore vevet i 5 minutter ved 14 000 x g. Kast det øverste laget av sjøvann inn i en plastavfall bøtte. Gjenta igjen.
- fjerne eventuelle gjenværende store vev sek manueltsjoner som ikke fordøye i denne prosessen med pinsett før du går videre til neste trinn.
- Utarbeidelse av Papain / kollagenase
- Isolere pigmentgranula
- Fremstilling av homogeniseringsbuffer
- Veie 2,38 g av (4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre) (HEPES, 100 mM), 0,095 g av magnesium-klorid (10 mM), 0,856 g kalium-aspartat (50 mM), og 0,015 g ditiotreitol (1 mM). Overfør til et 150 ml polystyren-beholder med skrukork. Legg en kommersiell mini tablett proteasehemmer.
- Mål 100 ml deionisert vann ved bruk av en målesylinder. Legg direkte til beholderen inneholdende homogenisering salter. Vortex inntil løsningen er klar.
- Homogenisering av pigmentgranula
- Sentrifuger hver prøve fra trinn 2.1 ved 14 000 xg i 5 minutter. Kast supernatanten til et plastavfall bøtte. Denne prøven skal være blottet for ekstracellulært vev.
- Legg 500 &# 181; l av homogeniseringsbuffer til hvert rør og virvle i 1-2 min hver for å blande grundig prøvene. Sonikere prøvene i 30 min (~ 40 kHz) og følger med 5 min av sentrifugering ved 14.000 x g.
- Kast supernatanten til et plastavfall bøtte, og gjenta forrige trinn 2-3 ganger for å sikre fullstendig fordøyelse av chromatophore sacculus og protein fortøyningene. Den gjenværende løsning bør inneholde en lys gul supernatant og en rød-farget pellet inneholdende de isolerte pigmentgranulater.
- Fremstilling av homogeniseringsbuffer
3. Pigment Utvinning
- Utarbeidelse av Surt Metanol (HCl-MeOH)
- Tilsett forsiktig 25 ul av konsentrert (36,5 til 38% (vekt / vekt)) saltsyre (HCl) for å 5 ml metanol (MeOH). Oppbevar HCl-MeOH-oppløsning i en skrukork glass prøveglass. Swirl forsiktig til jevnt blande løsningen.
MERK: surere løsningen, jo mer pigment bli hentet i løpet av first utvinning.
- Tilsett forsiktig 25 ul av konsentrert (36,5 til 38% (vekt / vekt)) saltsyre (HCl) for å 5 ml metanol (MeOH). Oppbevar HCl-MeOH-oppløsning i en skrukork glass prøveglass. Swirl forsiktig til jevnt blande løsningen.
- Utvinning av Pigment
- Sentrifuger pigmentsuspensjon granulat (fra 2.2.2) i 5 minutter ved 14.000 xg og kast supernatanten til en plastavfall bøtte.
- Legg 500 mL av den HCl-MeOH-løsning og vortex hver prøve for ~ 3-4 min. Sonikere prøvene i 10 min (~ 40 kHz), og sentrifuger i 5 minutter ved 14 000 x g.
- Ved hjelp av en overføring pipette, samle supernatanten i en en dram skrue-top hetteglass. Supernatanten skal være mørk rød farge.
- Gjenta ekstraksjonstrinnet 3.2.2 inntil det ikke lenger farge blir ekstrahert (~ 4-5 vaskinger).
MERK: Hver utvinning vil gi ~ 1,5 ml pigment. De resterende fargeløs pellet er pigment hentet granulat. MERK: Begge farveløse granuler og ekstrahert pigmenter kan lagres i vann ved 4 ° C inntil videre anvendelse.
4. Karakterisering hele utpakkingen
- skanning Electron Mikroskopi
- Bilde granulene (uomsatte fra trinn 2.2.1 og pigment-ekstrahert fra trinn 3.2.3) ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM) for å kontrollere renheten av ekstraksjonsprosessen.
- For å forberede granule prøver for bildebehandling, først sentrifuge både ureagerte granulater og pigment hentet granulater i 5 min ved 14 000 xg, og kast supernatanten til et plastavfall bøtte. Re-suspendere disse i 1 ml etanol, og innskudd 2-3 dråper granulen suspensjon på aluminium SEM stubber hjelp av en overførings pipette.
- Etter tørking av prøvene over natten, frese frakk med gull-platina belegg i 3 minutter for å oppnå en 15 nm belegg.
- Bilde ved hjelp av en SEM med en Schottky emitter og en sekundær elektron detektor. Bruk en 5-7 kV bjelke spenning og en arbeidsavstand på mellom 8 og 9 mm til bilde disse materialene.
- Ultraviolet-synlig (UV-vis) spektrofotometrisk måling
- Overvåk absorbans profiler for alle 3 forhold (ikke omsatt granulat fra 2.2.2, hentet pigment fra 3.2.3, og pigment hentet granuler fra 3.2.4) ved hjelp av en dobbel stråle spektrofotometer 200-800 nm.
- Samle en blank måling ved hjelp av deionisert vann i en 1 ml kuvette for uomsatte granuler og pigment ekstrahert granuler. Samle UV-Vis absorpsjon spektra for begge prøvene.
- Samle en blank måling ved hjelp av den sure metanoloppløsning i en 1 ml kyvette for det ekstraherte pigment. Samle UV-Vis absorpsjon spekteret for prøven.
- Bestemme maksimal bølgelengde for hver prøve ved å identifisere den bølgelengde ved hvilken absorbanstoppen når sin maksimale relative høyde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kromatofor dissekeres fra D. pealeii dorsal mantelen (figur 1A, 1B). Når de er fjernet, blir kromatofor lysert og renset ved hjelp av sentrifugering og vaskesykluser for å isolere ut de pigmenterte granuler (figurene 2A, 2B). Sure oppløsninger metanol (HCl-MeOH) benyttes for å ekstrahere pigment fra kornene (figur 2C), noe som ga et oppløselig pigment ekstrakt og uoppløselige, fargeløse pigment ekstrahert granuler.
Utpakkingen reduserer den midlere diameter av granulene. Dette blir observert ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM). Før granulene er utsatt for HCl-MeOH, de har en gjennomsnittlig diameter på (527,3 ± 91,8) nm (N = 100, feil er standardavviket, figur 3A). Når pigmentet er hentet fra kornene, størrelsen reduksjons til (202,6 ± 32,2) nm (N = 100, er feil standardavvik, figur 3B). Denne størrelsesreduksjon er antatt å være på grunn av ekstraksjon av pigmentet fra granulen når de ble behandlet med HCl-MeOH.
For å teste denne hypotesen, er forskjellene i synlig farge pre- og post-utvinning overvåkes ved hjelp av lys mikroskopi og spektrofotometri. Ved tilsetning av HCl-MeOH fargen forbundet med de uomsatte granulene reduserer synlig (figur 4A). Dette er videre karakterisert ved hjelp av UV-vis spektrofotometri (figur 4B), hvor et bredt absorbans profil (~ 280-800 nm) er observert for de forhånds hentet granulater og etter hentet granulater, om enn på en mye lavere intensitet; mens oppviser løselig pigment ekstraktet et lambda max sentrert på ~ 500 nm, med en skulder ved ~ 380 nm. Til sammen tyder disse data på en fremgangsmåte for å kunne ekstrahere den synlige fargen fra kornene.
Figur 1: kromatofor fra blekksprut D. pealeii. (A) Squid D. pealeii rygg mantelen. (B) Bright felt bilde av røde, gule og brune kromatofor. Scale bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Illustrasjon av ekstraksjonsprosessen (A) kromatofor dissekeres. (B) Pigment granuler fjernes fra homogenisert chromatophore vev og renset ved anvendelse av en serie sentrifugering og vaskesykluser. (C) Et pigment kan være ex trukket tilbake fra granulatet ved hjelp HCl-MeOH gir en løselig pigment supernatant som er atskilt fra fargeløs pigment hentet granulat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: HCl-MeOH ekstraksjon Endrer diametrene av nanostrukturerte granulene Scanning elektronmikroskopibilder av (a) forhånds sure metanol ekstrahert pigmentgranulater og (B) etter sur metanol ekstrahert pigmentgranulater.. Scale bar = 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
laste opp / 54803 / 54803fig4.jpg "/>
Figur 4: HCl-MeOH utvinning endrer synlig farge på nanostrukturerte granulater (A) Bright felt bilder av pigment granulater hele utpakkingen.. (B) absorbans spektra av pre (svart) - og etter (blå) -. Ekstraksjon sammen med pigment supernatant (rød) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist en metode for å utvinne pigmenter fra blekksprut chromatophore granulat. Av spesiell fokus på granulater, er vårt mål å bestemme deres rolle som formidler adaptive farge. Denne metoden skiller seg fra tidligere rapporter utformet for å karakterisere Cephalopod pigmenter bruker bulk vevsprøver 14 eller frysetørket hud 15.
Mens denne protokollen er effektiv ved utpakking chromatophore pigmenter, er det begrenset til små reaksjons skalaer. Dissekere en blekksprut gir ~ 11 mg renset granulat. Omtrent 58% av denne massen inneholder det løselige pigmentene, som er utvunnet ved hjelp av HCl-MeOH-løsning. 12 Renheten av utgangs chromatophore vevet direkte påvirker produktutbyttet fra en disseksjon. Dersom prøvene vises forurenset av overflødig epidermal eller iridophore vev samlet inn under disseksjon, er det best å skille ut prøve innhold, suspendere dem i ytterligere buffer, og begynne homogenisering trinn om igjen. Isolere en ren populasjon av pigment granulater fra chromatophore vev kan ta så mange som åtte, fire timers ultralyd sykluser som kunne spenner over 4 dager. Det er viktig å holde pasienten i isolering for å sikre en ren populasjon av pigmentgranulater.
Renheten av utgangs granulat oppløsningen påvirker også pigment ekstraksjonstrinn med HCI-MeOH. Hvis granulene blir tilstoppet av ufordøyd vev, er det bare vortex og sonikere prøvene opp til 1 time og homogenisere prøven før begynnelsen av ekstraksjon på nytt. Ofte 4-5 vaskinger ved bruk av 500 mL av HCl-MeOH per prøve er nødvendig for å ekstrahere pigment fra kornene. Hvis det gjøres riktig, vil denne prosedyren gi mellom 2-3 ml løselig pigment per prøve. Når ytterligere rensing anvendes via tynnsjiktskromatografi, de isolerte pigmenter skilles i fire unike fraksjoner inneholdende varierende konsentrasjoner av xanthommatin og decarboxylated xanthommatin. 12
Denne metoden kan brukes av kjemikere, biologer, eller ingeniører for å bedre forstå rollen av pigmenter i fargen modulering. Nærværet av pigment i granulene antyder en hierarkisk mekanisme for farging i blekkspruter som har utspring med de molekylære komponenter som finnes i nanostrukturerte chromatophore pigmentgranulater. Disse funnene kan brukes til å informere konstruerte systemer designet for å etterligne det dynamiske området adaptive fargen som vises blekkspruter bruker pre-pakket pigmentert nanopartikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).
