Summary
Ein Protokoll für die Extraktion von Pigmenten aus den nanostrukturierten Granulat in Tintenfisch Doryteuthis pealeii Chromatophoren vorgestellt.
Introduction
Kopffüßer wie Tintenfische, Tintenfische und Kraken haben die Fähigkeit, dynamisch ihr Aussehen verändern , für Tarnen und Signalisierung. 1-6 Diese Fähigkeit durch die selektive Flächenausdehnung von pigmentierten Organe teilweise als Chromatophoren bekannt unterstützt wird. 4,7-9 Chromatophoren Weich Aktoren , die ein Netzwerk von nanostrukturiertem Pigmentgranulaten in einem cytoelastic sacculus beschränkt enthalten , die radial von Muskelfasern verankert ist. 1,3 Da sie betätigt werden, Chromatophoren um 500% in präsentierten Oberfläche erweitern , um die Granulate im gesamten Organ verteilen. 3,7 10,11, Wenn diese Aktion über eine Anzahl von aufeinander abgestimmten Chromatophoren wird, wird die Gesamtfärbung des Tieres verändert. Während es bekannt ist, daß die Pigmentgranulate dieser Farbänderung beitragen, bleibt deren Zusammensetzung unbekannt. Wir beschreiben ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von chromatophore Pigmente, die für zukünftige Studien Zusammensetzungs angepasst werden kann.
3,12 Chromatophor haltiges Gewebe durch sorgfältige Exstirpation von der Kopffüßer geerntet wird. Eine Verdauung und Homogenisierungsverfahren wird dann verwendet, um das umgebende Gewebe zu dissoziieren und die chromatophore Zellen trennen. Die nanostrukturierten Granula werden dann isoliert und gereinigt aus den verbleibenden Chromatophoren wiederholt unter Verwendung von Beschallung und Zentrifugation. Nach der Reinigung werden Pigmente aus dem Granulat in einem Verfahren extrahiert , das aus der Gewinnung von sichtbaren Farbe aus Schmetterlingsflügeln mit saurem Methanol - Lösungen. 13 Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Spektrometrie werden verwendet , um zu bestätigen , dass die Chromatophoren - Pigmente erfolgreich extrahiert angepasst ist , dieser Prozess.
Diese Methode beschreibt die Isolierung von chromatophore Granulat, das verwendet wird, um die molekularen Beiträge zu c zu erkundenoloration in Kopffüßer. 12 kleine Molekül - Extraktionen von ganzen Tieren kann oft ein langer und mühsamer Prozess sein. Das Ziel hier ist es, zukünftige Forscher einer effektiven und einfachen Protokoll für den Erwerb von Pigmenten aus den nanostrukturierten Granulat in Kopffüßer zu informieren.
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Protocol
Invertebrate Tierstudien durchgeführt, hier sind in den Vereinigten Staaten nicht geregelt; daher die Institutional Animal Care und Use Committee hat keine Befugnis zur Überprüfung solcher Protokolle. Anstelle dieser nicht unter die Zuständigkeit der Regulierung in den Vereinigten Staaten fallen, so die Autoren hiermit, dass diese Studien wurden mit aufrichtigen Bemühungen im Hinblick auf die ethische Nutzung, Pflege und Behandlung dieser Tiere durchgeführt wird, wurde die Anzahl der Individuen minimiert und diese Bemühungen mit der Basler Deklaration und des Internationalen Rates für Versuchstierkunde (ICLAS) Ethik-Richtlinien stehen im Einklang.
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection
- Kauf enthauptet Tintenfisch D. pealeii von der Marine Ressourcen Abteilung am Marine Biological Laboratory in Woods Hole, MA oder einer Frischfischmarkt. Verwenden Sie keine Proben, die um verrundet oder zuvor geändert wurden, um dieses Verfahren anzuwenden. Insbesondere ist die Chromatophore Schicht muss noch auf die Probe intakt sein.
- Wenn die Tiere nicht sofort verwendet werden, lagern Sie sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. Um die Proben aufzutauen, legen Sie sie in Wasser bei Raumtemperatur für 1 Stunde vor der Präparation.
- Mit Edelstahl gerade fein-Punkt-Dissektion Schere entlang der hinteren Seite des Tieres geschnitten. Beginnen an der Basis des ventralen Mantel und an dem Rippenbereich endet.
- Entfernen Sie alle inneren Organe (Magen, Kiemen, Tinte Drüse, Fortpflanzungsorgane, systemische Herz und brachial Herz) von ihnen heben mit einer Pinzette zu sezieren und Abtrennen ihre Bindegewebe Dissektion Schere. Entsorgen Organe in einem Probenbeutel.
- Verwenden Sie sezieren T-Pins den Mantel an Pin (fin Seite nach oben) in einem Standard-11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan Aluminium Dissektion eine flexible Präparation Pad enthält. Versenken des Gewebes in 250 ml Meerwasser, das durch eine Einweg-Polystyrol-Vakuum-Filtrationssystem gefiltert wurdeenthaltend 0,2 & mgr; m Porengrößen.
- den epidermalen Hautschicht (Deckfarbe) mit Pinzette, die Chromatophoren haltige Hautschicht intakt bleibt vorsichtig entfernen. Sobald die epidermale Schicht entfernt wird, entsorgen Sie sie in einem Probenbeutel.
- Präparieren klein (1 cm x 1 cm) Abschnitte der Chromatophoren-Schicht mit einer Pinzette und Schere Dissektion. Die Proben werden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (füllen die Hälfte jedes Leerrohr mit dem sezierten Gewebe).
- Hinzufügen 500 ul gefiltertes Seewasser mit dem Gewebe enthaltenden Röhrchen. Die Proben können über Nacht bei 4 ° C gelagert werden.
2. Isolierkanne Chromatophor Pigmentgranula
- Tissue Verdauung
- Herstellung von Papain / Kollagenase
- Man wiegt 30 mg Kollagenase und 5 mg Papain mit einem 4 "x 4" niedrigen Stickstoff wiegen Papier. Bringen Sie diese in einem 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss.
- Messen Sie 10 ml deionized Wasser mit einer Messpipette. Fügen Sie direkt Papain / Kollagenase Fläschchen enthält. Vortex auf die höchste Einstellung, bis die Lösung klar ist.
- Entfernen extrazelluläre Anhäufung
- Zentrifugieren des gesammelten chromatophore Gewebe aus Schritt 1.7 für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie die obere Schicht aus Meerwasser in einen Kunststoffabfallbehälter.
- In 500 ul der Papain / Kollagenase-Lösung auf das Gewebe ein P1000 variablen Volumen Einkanal-Mikropipette. Vortex jede Probe für 1-2 Minuten auf die höchste Einstellung.
- Beschallen die Proben 5 min bei einer Frequenz von 40 kHz Zellen aus dem umgebenden Gewebe zu trennen.
- Zentrifuge für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter.
- Zentrifugieren des gesammelten chromatophore Gewebe für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie die obere Schicht aus Meerwasser in einen Kunststoffabfallbehälter. Wiederholen Sie noch einmal.
- Entfernen Sie manuell alle verbleibenden großen Gewebe secgen, die in diesem Prozess mit einer Pinzette verdauen nicht vor dem nächsten Schritt fortfahren.
- Herstellung von Papain / Kollagenase
- Isolieren der Pigmentkörnchen
- Herstellung von Homogenisierungspuffer
- Wiegen 2,38 g (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure) (HEPES, 100 mM), 0.095 g Magnesiumchlorid (10 mM), 0,856 g Kalium-aspartat (50 mM) und 0,015 g Dithiothreitol (1 mM). In einen 150 ml Polystyrolbehälter mit Schraubverschluss. In einer kommerziellen Mini-Tablet-Protease-Inhibitor.
- Messung der 100 ml entionisiertes Wasser mit einem Meßzylinder verwendet wird. Fügen Sie direkt in den Behälter, der die Homogenisierung Salze enthält. Vortex, bis die Lösung klar ist.
- Homogenisieren von Pigmentgranulaten
- Zentrifugieren jede Probe aus Schritt 2.1 bei 14000 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter. Diese Probe sollte frei von extrazellulären Gewebe sein.
- In 500 &# 181; l Homogenisierungspuffer in jedes Röhrchen und Vortex für 1-2 min je gründlich die Proben mischen. Beschallen die Proben für 30 Minuten (~ 40 kHz) und folgen mit 5 min Zentrifugation bei 14.000 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter, und wiederholen Sie 2-3 mal den vorherigen Schritt die vollständige Verdauung der chromatophore sacculus und Protein Anbindehaltung zu gewährleisten. Die verbleibende Lösung sollte eine hellgelbe Überstand enthalten und eine rot gefärbte Pellet die isolierten Pigmentkörnchen enthalten.
- Herstellung von Homogenisierungspuffer
3. Pigmentextraktion
- Herstellung von saurem Methanol (HCl-MeOH)
- Vorsichtig 25 ul konzentriert (36,5 bis 38% (w / w)), Salzsäure (HCl) zu 5 ml Methanol (MeOH). Lagern Sie das HCl-MeOH-Lösung in einem Schraubdeckel Glasprobenfläschchen. Vorsichtig schwenken, um die Lösung gleichmäßig mischen.
HINWEIS: Je saurer die Lösung ist, desto mehr Pigment wird während der fi extrahiert werdenerste Extraktion.
- Vorsichtig 25 ul konzentriert (36,5 bis 38% (w / w)), Salzsäure (HCl) zu 5 ml Methanol (MeOH). Lagern Sie das HCl-MeOH-Lösung in einem Schraubdeckel Glasprobenfläschchen. Vorsichtig schwenken, um die Lösung gleichmäßig mischen.
- Extraktion von Pigment
- Zentrifugieren Sie die Pigmentgranulatsuspension (von 2.2.2) für 5 min bei 14.000 xg und entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter.
- In 500 ul der HCl-MeOH-Lösung und Vortex jede Probe für ~ 3-4 min. Beschallen die Proben für 10 min (~ 40 kHz), dann zentrifugieren für 5 min bei 14.000 x g.
- Mit Hilfe einer Transferpipette, sammeln Sie den Überstand in einer 1-Dram-Schraubdeckel-Glasfläschchen. Der Überstand sollte in der Farbe dunkelrot sein.
- Wiederholen Sie den Extraktionsschritt 3.2.2 bis keine weitere Farbe extrahiert (~ 4-5 Wäschen).
HINWEIS: Jede Extraktion wird ~ 1,5 ml Pigment ergeben. Das verbleibende farblose Pellet wird das Pigment extrahierte Granulat. Hinweis: beide farblos Granulat und extrahiert Pigmente können in Wasser bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
4. Charakterisierung gesamten Extraktionsverfahren
- Scannen Electron Mikroskopie
- Bild das Granulat (nicht umgesetztes aus Schritt 2.2.1 und pigment extrahiert aus Schritt 3.2.3) unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), um die Reinheit des Extraktionsprozesses zu überprüfen.
- Um Granulatproben für die Bildgebung, erste Zentrifuge beide nicht umgesetzten Granulat und Pigment extrahiert Granulat für 5 min bei 14.000 · g, und entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter herzustellen. Re-suspendieren diese in 1 ml Ethanol und Ablagerung 2-3 Tropfen der Granulatsuspension auf Aluminium SEM Stubs eine Transferpipette.
- über Nacht, nachdem die Proben trocknen, Sputter-Mantel mit Gold-Platin-Beschichtung für 3 min eine 15 nm Beschichtung zu erreichen.
- Bild unter Verwendung eines SEM mit einer Schottky-Emitter und einem Sekundärelektronendetektor. Verwenden Sie einen 5-7 kV Strahlspannung und einen Arbeitsabstand zwischen 8 und 9 mm Bild diese Materialien.
- UV-VIS (UV-vis) spektrophotometrische Messungen
- Überwachen Sie die Absorption proDateien für alle drei Bedingungen (nicht umgesetztes Granulat aus 2.2.2, extrahiert Pigment aus 3.2.3 und Pigment extrahiert Granulat aus 3.2.4) mit einem Doppelstrahl-Spektrophotometer 200-800 nm verwendet wird.
- Sammeln Sie eine Leermessung VE-Wasser in einer 1-ml-Küvette für den nicht umgesetzten Granulat und das Pigment extrahiert Granulat verwendet wird. Sammeln Sie UV-Vis-Absorptionsspektren für beide Proben.
- Sammeln Sie eine leere Messung der sauren Methanollösung in einer 1-ml-Küvette für das extrahierte Pigment verwendet wird. Sammeln Sie UV-Vis-Absorptionsspektrum für die Probe.
- Bestimmen maximale Wellenlänge jeder Probe durch die Wellenlänge identifiziert, an dem die Absorptionsspitze ihre maximale relative Höhe erreicht.
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Representative Results
Chromatophoren werden aus dem D. seziert pealeii dorsal Mantel (1A, 1B). Sobald sie entfernt werden, werden Chromatophoren lysiert und gereinigt Zyklen Zentrifugation und Waschen der pigmentierten Granulate (2A, 2B) zu isolieren geführt. Sauren Methanollösungen (HCl-MeOH) werden verwendet , um das Pigment aus dem Granulat (2C) zu extrahieren, um ein lösliches Pigment Extrakt und unlöslichen, farblose Pigment extrahierte Granulat ergab.
Das Extraktionsverfahren verringert den durchschnittlichen Durchmesser der Körner. Dies wird unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) beobachtet. Bevor das Granulat zu HCl-MeOH ausgesetzt sind, haben sie einen durchschnittlichen Durchmesser von (527,3 ± 91,8) nm (N = 100, Fehler Standardabweichung; 3A). Wenn das Pigment aus dem Granulat extrahiert wird, Verringerung der Größes (202,6 ± 32,2) nm (N = 100, Fehler Standardabweichung; 3B). Diese Zerkleinerung wird angenommen, von dem Granulat auf die Extraktion von Pigment zurückzuführen sein, wenn es mit HCl-MeOH behandelt.
Um diese Hypothese zu testen, werden die Unterschiede in der sichtbaren Farbe vor und nach der Extraktion unter Verwendung von Lichtmikroskopie und Spektrometrie überwacht. Nach der Zugabe von HCl-MeOH, die Farbe mit den nicht umgesetzten Granulat zugeordnet reduziert sichtbar (4A). Dies wird weiter unter Verwendung von UV-vis - Spektrophotometrie (4B) aus, wobei ein breites Absorptionsprofil (~ 280-800 nm) für die vorextrahierte Granulat und post-extrahierte Granulat beobachtet wird, wenn auch mit einer viel geringeren Intensität; während das lösliche Pigment Extrakt einen Lambda-max bei ~ 500 nm zentriert ist, mit einer Schulter bei ~ 380 nm. Zusammengefasst legen diese Daten nahe, ein Verfahren erfolgreich die sichtbare Farbe aus dem Granulat zu extrahieren.
Abbildung 1: Chromatophoren von Tintenfisch D. pealeii. (A) Squid D. pealeii Rücken Mantel. (B) Hellfeld - Bild von rot, gelb und braun Chromatophoren. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Abbildung des Extraktionsprozesses (A) Chromatophoren seziert. (B) Pigmentgranulate werden aus homogenisierten chromatophore Gewebe entfernt und gereinigt unter Verwendung einer Reihe von Zentrifugation und Waschzyklen. (C) Das Pigment kann ex sein gezogenen aus dem Granulat unter Verwendung von HCl-MeOH ein lösliches Pigment Überstand ergibt , die aus den farblosen Pigment extrahiert Granulat getrennt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: HCl-MeOH Extraktion Abspaltungen Durchmesser der Nanostruktur Granulat Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von (A) vorge saurem Methanol extrahiert Pigmentkörnchen und (B) nach saurem Methanol extrahiert Pigmentkörnchen.. Maßstabsbalken = 1 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4: HCl-MeOH Extraktion verändert sichtbare Farbe von nanostrukturierten Granulat (A) Hellfeldbilder von Pigmentkörnchen während des Extraktionsprozesses.. (B) Absorptionsspektren von pre (schwarz) - und Post (blau) -. Extraktion zusammen mit dem Pigment Überstand (rot) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir haben ein Verfahren zum Extrahieren von Pigmenten squid chromatophore Granulat demonstriert. Durch speziell auf die Granulat-Targeting, unser Ziel ist es, ihre Rolle bei der Vermittlung der adaptive Färbung zu bestimmen. Diese Methode unterscheidet sich von früheren Berichten entworfen Kopffüßer Pigmente mit Bulk - Gewebeproben 14 oder gefriergetrocknet Haut 15 zu charakterisieren.
Während dieses Protokolls auf Extrahieren chromatophore Pigmente wirksam ist, wird sie in kleine Reaktionsskalen begrenzt. Sezieren ein Tintenfisch Ausbeute ~ 11 mg des gereinigten Granulat. Ungefähr 58% dieser Masse enthält , um das lösliche Pigment, das das HCl-MeOH - Lösung extrahiert wird , verwendet wird . 12 Die Reinheit des Ausgangs chromatophore Gewebe beeinflusst direkt die Produktausbeute von einer Dissektion. Wenn die Proben während der Präparation gesammelt durch überschüssige epidermalen oder Iridophoren Gewebe verunreinigt erscheinen, ist es am besten, die Probe den Inhalt zu trennen, resuspendieren sie in zusätzliche buffer, und beginnen die Homogenisierung wieder Schritte über. Isolieren einer reinen Population von Pigmentkörnchen aus chromatophore Gewebe kann so viele wie acht, 4 h Beschallungszyklen dauern, die sich über vier Tage erstrecken könnte. Es ist wichtig, Patienten in der Isolation zu bleiben, um eine reine Population von Pigmentkörnchen zu gewährleisten.
Die Reinheit des Ausgangsgranulatlösung beeinflusst auch die Pigment-Extraktionsschritte mit HCl-MeOH. Wenn das Granulat durch unverdauten Gewebe verschlossen, einfach Wirbel und beschallen die Proben bis zu 1 Stunde und die Probe zu homogenisieren, bevor die Extraktion wieder beginnen. Oft 4-5 Waschungen unter Verwendung von 500 & mgr; l HCl-MeOH pro Probe für das Pigment aus dem Granulat zu extrahieren. Wenn es richtig gemacht, wird dieses Verfahren zwischen 2-3 ml lösliches Pigment pro Probe ergeben. Wenn zusätzliche Reinigung über Dünnschicht-Chromatographie verwendet wird, trennen sich die isolierten Pigmente in vier einzigartige Fraktionen unterschiedliche Konzentrationen von xanthommatin und decarbo enthältxylated xanthommatin. 12
Dieses Verfahren kann durch Chemiker, Biologen oder Ingenieuren verwendet werden, um besser die Rolle von Pigmenten in Farbmodulation verstehen. Die Anwesenheit des Pigments in den Granulaten schlägt eine hierarchische Mechanismus zur Färbung in Cephalopoden, die innerhalb nanostrukturiertem chromatophore Pigmentgranulate mit den molekularen Komponenten enthalten stammt. Diese Erkenntnisse können verwendet werden, Engineered Systems zu informieren, entwickelt, um die Dynamik von adaptiven Farbe in Kopffüßer mit abgepackten pigmentierte Nanopartikel angezeigt zu imitieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
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