Summary
Ett protokoll för utvinning av pigment från nanostrukturerade granulat i bläckfisk Doryteuthis pealeii kromatofor presenteras.
Introduction
Bläckfisk som bläckfisk, bläckfisk och bläckfisk har förmågan att dynamiskt ändra sitt utseende för att kamouflera och signalering. 1-6 Denna funktion stöds delvis genom selektiv areal utbyggnaden av pigmenterade organ kallas kromatofor. 4,7-9 kromatofor är mjuka ställdon som innehåller ett nätverk av nanostrukturerade pigmentkorn begränsade inom en cytoelastic säcken som är förankrad radiellt av muskelfibrer. 1,3 När de påverkas, kromatofor växa med 500% i presenterade yta fördela kornen hela organ. 3,7 , 10,11 När denna åtgärd samordnade över ett antal kromatofor den totala färgningen av djuret ändras. Medan det är känt att pigmentgranulat bidra till denna färgförändring, förblir deras sammansättning okänd. Vi beskriver ett förfarande för att isolera och rena kromatofor pigment som kan anpassas för kommande kompositionsstudier.
3,12 kromatofor innehållande vävnad skördas genom noggrann utrotande från bläckfisk. En matsmältning och homogeniseringsprocessen används sedan för att dissociera den omgivande vävnaden och separera kromatofor cellerna. De nanostrukturerade granuler isoleras därefter och renas från de återstående kromatofor som använder upprepad sonikering och centrifugering. Vid rening, pigment extraherade från granulerna i en process som är anpassad från utvinning av synlig färg från fjärilsvingar användning av sura metanollösningar. 13 Svepelektronmikroskopi (SEM) och spektrofotometri används för att bekräfta att de kromatofor pigmenten framgångsrikt extraheras med användning av denna process.
Denna metod beskriver isolering av kromatofor granulat som används för att undersöka de molekylära bidrag till coloration i bläckfisk. 12 småmolekylära extraktioner från hela djur kan ofta vara en lång och mödosam process. Syftet är att informera framtida forskare i en effektiv och enkel protokoll för förvärvet av pigment från nanostrukturerade granulat i bläckfisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ryggradslösa djurstudier utförda häri regleras inte i USA; Därför Institutional Animal Care och användning kommittén har ingen myndighet för granskning av sådana protokoll. I stället för dessa inte faller under jurisdiktion av reglering i USA, författarna förklarar härmed att dessa studier genomfördes med uppriktig ansträngning mot etisk användning, vård och behandling av dessa djur, antalet individer minimerades och dessa ansträngningar är förenliga med Basel Deklarationen och International Council för försöksdjursvetenskap (ICLAS) etiska riktlinjer.
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection
- Inköp decapitated bläckfisk D. pealeii från Marine avdelningen vid marinbiologiska laboratorium vid Woods Hole, MA eller från någon färsk fiskmarknaden. Använd inte exemplar som har filéer eller tidigare ändras för att tillämpa detta förfarande. Specifikt, chromatophore skiktet måste fortfarande vara intakt på provet.
- Om djuren inte används omedelbart, förvara dem vid -20 ° C fram till användning. Att tina exemplaren, placera dem i vatten av rumstemperatur under 1 h före dissektion.
- Använda rostfritt stål rak fin-point dissektion sax, klippa längs den bakre sidan av djuret. Börja vid foten av den ventrala mantel, och slutar vid fenan regionen.
- Ta bort alla inre organ (mage, gäl, bläck körtel, reproduktiva organ, system hjärta, och brachial hjärta) genom att lyfta dem med dissekera pincett och bryta deras bindväv med hjälp av dissektion sax. Kasta organ i en provpåse.
- Använd dissekera T-stift till stift mantel (fin uppåt) i en standard 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "aluminium dissektion panna innehåller en flexibel dissektion pad. Sänk vävnaden i 250 ml havsvatten som har filtrerats genom ett engångs polystyren vakuumfiltreringssysteminnehållande 0,2 | j, m porstorlekar.
- Försiktigt bort epidermal hudlagret (ogenomskinlig färg) med dissekera pincett, hålla kromatofor innehåller ytskiktet intakt. När epidermal lagret tas bort, kasta den i en provpåse.
- Dissekera små (1 cm x 1 cm) delar av kromatofor skiktet med pincett och dissektion sax. Samla prov i 1,5 ml mikro-centrifugrör (fyll en-hälften av varje tomt rör med dissekerade vävnaden).
- Tillsätt 500 pl av filtrerat havsvatten till vävnaden innehållande rör. Proverna kan förvaras över natten vid 4 ° C.
2. Isolera kromatofor pigmentkornen
- vävnads Digestion
- Framställning av Papain / kollagenas
- Väg upp 30 mg av kollagenas och 5 mg papain med användning av en 4 "x 4" låg kväve väger papper. Överföra dessa i ett 50 ml polypropen-centrifugrör med skruvlock.
- Mät 10 ml deionized vatten med hjälp av en graderad pipett. Lägg direkt till flaska innehållande papain / kollagenas. Vortex på den högsta inställningen tills lösningen är klar.
- Avlägsnande Extracellulär Tissue
- Centrifugera den uppsamlade kromatofor vävnad från steg 1,7 i 5 min vid 14000 x g. Kassera det översta lagret av havsvatten i en plastavfallshink.
- Tillsätt 500 l av papain / kollagenas lösning på vävnaden med hjälp av en P1000 variabel volym enda kanal mikropipett. Virvel varje prov i 1-2 minuter på den högsta inställningen.
- Sonikera proverna för 5 minuter vid en frekvens på 40 kHz för att dissociera cellerna från den omgivande vävnaden.
- Centrifugera i 5 minuter vid 14.000 x g. Kassera supernatanten i en plastavfallshinken.
- Centrifugera den uppsamlade kromatofor vävnaden under 5 min vid 14.000 x g. Kassera det översta lagret av havsvatten i en plastavfallshink. Upprepa en gång.
- Manuellt ta bort eventuella kvarvarande stora vävnad sektioner som inte smälta i denna process med pincett innan man går vidare till nästa steg.
- Framställning av Papain / kollagenas
- Isolering av pigmentkornen
- Framställning av homogeniseringsbuffert
- Väg 2,38 g av (4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra) (HEPES, 100 mM), 0,095 g magnesiumklorid (10 mM), 0,856 g kalium-aspartat (50 mM) och 0,015 g ditiotreitol (1 mM). Överför till en 150 ml polystyren behållare med skruvlock. Tillsätt en kommersiell mini tablett proteashämmare.
- Mät 100 ml avjoniserat vatten med användning av en graderad cylinder. Lägg direkt till den container som innehåller homogenisering salter. Vortex tills lösningen är klar.
- Homogenisering av pigmentkornen
- Centrifugera varje prov från steg 2,1 vid 14.000 xg under 5 min. Kassera supernatanten i en plastavfallshinken. Detta prov bör vara ogiltig av extracellulärt vävnad.
- Lägg 500 &# 181; l homogeniseringsbuffert till varje rör och virvel för 1-2 minuter vardera för att blanda proverna. Sonikera proverna för 30 min (~ 40 kHz) och följer med 5 min av centrifugering vid 14.000 x g.
- Kassera supernatanten i en plastavfallshinken, och upprepa föregående steg 2-3 gånger för att säkerställa fullständig nedbrytning av kromatofor säcken och protein tjuder. Den återstående lösningen skall innehålla en ljusgul supernatant och en rödfärgad pellet innehållande de isolerade pigmentkornen.
- Framställning av homogeniseringsbuffert
3. Pigment Extraktion
- Framställning av sur metanol (HCl-MeOH)
- Tillsätt försiktigt 25 | il koncentrerad (36,5-38% (vikt / vikt)) saltsyra (HCl) till 5 ml metanol (MeOH). Lagra HCI-MeOH-lösning i ett skruvlock av glas provflaska. Snurra försiktigt för att jämnt blanda lösningen.
OBS: Den surare lösningen, desto mer pigment extraheras under first extraktion.
- Tillsätt försiktigt 25 | il koncentrerad (36,5-38% (vikt / vikt)) saltsyra (HCl) till 5 ml metanol (MeOH). Lagra HCI-MeOH-lösning i ett skruvlock av glas provflaska. Snurra försiktigt för att jämnt blanda lösningen.
- Extraktion av Pigment
- Centrifugera pigmentet granulat suspension (från 2.2.2) under 5 minuter vid 14.000 xg och kassera supernatanten i en plastavfallshinken.
- Tillsätt 500 pl av HCl-MeOH-lösning och vortexa varje prov för ~ 3-4 min. Sonikera proverna för 10 min (~ 40 kHz), centrifugera sedan i 5 min vid 14000 x g.
- Med användning av en överföringspipett, samla supernatanten i en 1 dram skruvlock glasflaska. Supernatanten bör vara mörkt röd till färgen.
- Upprepa extraktionssteget 3.2.2 tills ingen färg längre heras (~ 4-5 tvättar).
OBS! Varje extraktion kommer att ge ~ 1,5 ml av pigment. Den återstående färglösa pellets är pigment extraherade granuler. OBS! Båda färglösa granuler och extraherade pigment kan lagras i vatten vid 4 ° C fram till vidare användning.
4. Karakterisering hela Extraction Process
- scanning Electron Mikroskopi
- Image granulerna (oreagerade från steg 2.2.1 och pigment utvinns ur steg 3.2.3) med hjälp av svepelektronmikroskop (SEM) för att kontrollera renheten hos utvinningsprocessen.
- För att förbereda granulatprov för avbildning, första centrifug både oreagerade granulat och pigment extraherade granulat till 5 minuter vid 14.000 xg, och kassera supernatanten i en plastavfallshinken. Återsuspendera dessa i 1 ml etanol, och insättning 2-3 droppar av granulatsuspension på aluminium SEM stubbar med hjälp av en pipett.
- Efter torkning av proverna över natten, spotta kappa med guld-platina beläggning under 3 minuter för att uppnå en 15 nm beläggning.
- Bild med en SEM med en Schottky sändare och en sekundär elektrondetektor. Använda en 5-7 kV strålspänning och ett arbetsavstånd mellan 8 och 9 mm till bild dessa material.
- Ultraviolett synliga (UV-vis) spektrofotometriska
- Övervaka absorbansen profiler för alla 3 villkor (oreagerad granulat från 2.2.2, extraherade pigment från 3.2.3, och pigment extraherade granulat från 3.2.4) med hjälp av en dubbelstråle spektrofotometer 200-800 nm.
- Samla in en tom mätning med användning av avjoniserat vatten i en 1 ml kyvett för de oreagerade granuler och pigment extraherades granuler. Samla UV-Vis absorptionsspektra för båda proven.
- Samla in en tom mätning med hjälp av sur metanol lösning i en 1 ml kyvett för den extraherade pigmentet. Samla UV-Vis-spektrumet för provet.
- Bestämma maximal våglängd för varje prov genom att identifiera den våglängd vid vilken absorbansen topp når sin maximala relativa höjd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kromatofor dissekeras från D. pealeii dorsal mantel (Figur 1A, 1B). När de tas bort, är kromatofor lyseras och renas med hjälp av centrifugering och tvättcykler för att isolera de pigmenterade granuler (figurerna 2A, 2B). Sura metanollösningar (HCl-MeOH) används för att extrahera pigment från granulerna (fig 2C), vilket gav ett lösligt pigment extrakt och olösliga, färglösa pigment extraherades granuler.
Extraktionsprocessen minskar medeldiametern för de små kornen. Detta observeras med användning av svepelektronmikroskopi (SEM). Innan granulerna utsätts för HCl-MeOH, de har en genomsnittlig diameter av (527,3 ± 91,8) nm (N = 100, felet är standardavvikelse, fig 3A). När pigmentet utvinns ur granulerna storleksminsknings till (202,6 ± 32,2) nm (N = 100, är fel standardavvikelse, figur 3B). Denna storleksminskning är en hypotes bero på extraktion av pigment från granulen när de behandlades med HCl-MeOH.
För att testa denna hypotes, är skillnaderna i synlig färg före och efter extraktion övervakas med ljusmikroskop och spektrofotometri. Vid tillsats av HCl-MeOH, färgen förknippas med de oreagerade granulerna minskar synbart (figur 4A). Detta är karaktäriserades ytterligare med UV-vis spektrofotometri (figur 4B), där en bred absorbans profil (~ 280-800 nm) observeras för pre-extraherade granuler och efter extraherade granulat, om än i mycket lägre intensitet; medan uppvisar det lösliga pigmentet extraktet en lambda max centrerad vid ~ 500 nm, med en skuldra vid ~ 380 nm. Kollektivt antyder dessa data en metod för att framgångsrikt extrahera den synliga färgen från granulerna.
Figur 1: kromatofor från bläckfisk D. pealeii. (A) Squid D. pealeii dorsala mantel. (B) Bright fält bild av röda, gula och bruna kromatofor. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Illustration av extraktionsprocess (A) kromatofor dissekeras. (B) pigmentkornen avlägsnas från homogeniserad kromatofor vävnad och renas med hjälp av en serie av centrifugering och tvättcykler. (C) Pigmentet kan vara ex krympte från granulerna med HCI-MeOH, vilket gav en löslig pigment supernatant som är skild från den färglösa pigment extraherade granulat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: HCI-MeOH utvinning förändrar diametrar nanostrukturerade granulerna svepelektronmikro av (a) pre-sur metanol utvinns pigmentgranulat och (B) efter sur metanol utvinns pigmentkorn.. Skalstreck = 1 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
ladda / 54.803 / 54803fig4.jpg "/>
Figur 4: HCI-MeOH extraktion förändrar synlig färg av nanostrukturerade granulat (A) Bright fält bilder av pigmentkorn under utvinningsprocessen.. (B) Absorbans spektrum av pre (svart) - och efter (blå) -. Extraktion tillsammans med pigmentet vätskan (röd) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har visat en metod för att extrahera pigment från bläckfisk kromatofor granuler. Genom att särskilt rikta granulerna, är vårt mål att bestämma deras roll i att medla adaptiv färg. Denna metod skiljer sig från tidigare rapporter som syftar till att karakterisera bläckfiskpigment med hjälp av bulkvävnadsprover 14 eller frystorkad hud 15.
Även om detta protokoll är effektiv på att utvinna kromatofor pigment, är det begränsat till små reaktions skalor. Dissekera en bläckfisk utbyten ~ 11 mg renade granuler. Cirka 58% av denna massa innehåller lösliga pigment, som utvinns med hjälp av HCI-MeOH-lösning. 12 Renheten av start kromatofor vävnaden påverkar direkt produktutbytet från en dissektion. Om proverna verkar förorenat av överskott epidermal eller iridophore vävnad som samlats in under dissektion, är det bäst att separera ut prov innehåll, resuspendera dem i ytterligare buffer, och börja homogenisering steg igen. Isolera en ren population av pigmentgranulat från kromatofor vävnad kan ta så många som åtta, fyra timmar sonication cykler som kan spänner över 4 dagar. Det är viktigt att vara patient i isolering för att säkerställa en ren population av pigmentgranulat.
Renheten hos utgångsgranulatlösning påverkar också pigment extraktionssteg med HCl-MeOH. Om granulerna tilltäppt av osmält vävnad, helt enkelt virvel och sonikera proverna upp till en timme och homogenisera provet innan extraktion igen. Ofta 4-5 tvättningar med användning av 500 pl av HCl-MeOH per prov krävs för att extrahera pigment från granulerna. Om det görs på rätt sätt, kommer detta förfarande att ge mellan 2-3 ml lösligt pigment per prov. När ytterligare rening användes via tunnskiktskromatografi, de isolerade pigment separera till fyra unika fraktioner som innehöll varierande koncentrationer av xanthommatin och decarboxylated xanthommatin. 12
Denna metod kan utnyttjas av kemister, biologer, eller ingenjörer för att bättre förstå den roll som pigment i färg modulering. Närvaron av pigmentet inom granulerna antyder en hierarkisk mekanism för färgning i bläckfisk som har sitt ursprung med de molekylära komponenterna som ingår i nanostrukturerade kromatofor pigmentgranulat. Dessa fynd kan användas för att informera Engineered Systems är utformade för att efterlikna det dynamiska omfånget av adaptiv färg visas i bläckfisk med hjälp av färdigförpackade pigmenterade nanopartiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).
