Summary
Kalamar Doryteuthis pealeii kromatoforlardaki nano yapılı granüllerden pigmentlerin çıkarılması için bir protokol verilmektedir.
Introduction
Bu tür kalamar, mürekkepbalığı ve ahtapot gibi kafadan bacaklılar dinamik kamufle ve sinyalizasyon için kendi görünümünü değiştirmek için yeteneği var. 1-6 Bu özellik kromatoforların olarak bilinen pigmentli organların seçici alansal genişleme kısmen destekleniyor. 4,7-9 kromatoforların vardır onlar harekete geçirilir gibi kas lifleri tarafından radyal demirlemiş bir cytoelastic sacculus içinde sınırlı nano yapılı pigment granüllerinin bir ağ ihtiva yumuşak aktüatörler. 1,3, kromatoforlar organı boyunca granülleri dağıtmak sunulan yüzey alanı% 500 genişletin. 3,7 Bu işlem, kromatoforların bir dizi üzerinden birbiriyle uyumlu olduğunda, 10,11, hayvanın genel rengi değiştirilir. Bu pigment granülleri bu renk değişikliğine neden olduğu bilinmekle birlikte, bunların bileşimi bilinmemektedir. Bu izole edilmesi ve gelecekteki kompozisyon çalışmalar için uyarlanabilir chromatophore pigmentler saflaştırmak için bir prosedür açıklanmaktadır.
3,12 chromatophore içeren doku kafadanbacaklı itibaren dikkatli çıkarıldıktan ile hasat edilir. Bir sindirim ve homojenizasyon işlem daha sonra chromatophore hücreleri çevreleyen doku ayırmak ve ayırmak için kullanılır. nano yapılı granüller tekrar sonifikasyon ve santrifüjlemeden kullanılarak geri kalan kromatoforların den daha sonra izole edilir ve saflaştırılır. Saflaştırma üzerine, pigmentler, asidik metanol solüsyonları kullanılarak kelebek kanatları görünür renk ekstre uyarlanmış olan bir işlemde granüller elde edilir. 13 tarama elektron mikroskobu (SEM) ve spektrofotometri chromatophore pigmentler kullanarak başarılı şekilde ekstre onaylamak için kullanılan bu süreç.
Bu yöntem, C moleküler katılım keşfetmek için kullanılan chromatophore granüller izolasyonunu anlatmaktadıroloration Kafadanbacaklılarda içinde. Bütün hayvanlardan 12 Küçük molekül ekstraksiyon genellikle uzun ve sıkıcı bir süreç olabilir. Buradaki amaç Kafadanbacaklılarda içinde nanoyapılı granüllerden pigmentlerin edinimi için etkili ve kolay protokolün gelecek araştırmacıları bilgilendirmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Amerika Birleşik Devletleri'nde düzenlenmiş değildir, burada yapılan omurgasız hayvan çalışmaları; Bu nedenle Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, protokollerin incelenmesi için yetkisi yoktur. Bu ABD'de düzenlemenin yetki alanına giren değil yerine, yazarlar burada bu çalışmalar samimi etik kullanımı konusunda çaba, özen ve bu hayvanların tedavi, birey sayısı minimize edilmiş ve bu çabaların ile yapılmıştır devlet olduğunu Basel Bildirgesi ve Laboratuar Hayvan Uluslararası Bilim Konseyi (ICLAS) etik kurallarına uyum içindedir.
1. Doryteuthis pealeii (D pealeii) Diseksiyon
- Satın alma decapitated kalamar D. Woods Hole, MA Marine Biological Laboratory at Deniz Kaynakları Bölümü veya herhangi bir taze balık pazarından pealeii. yuvarlanabilir veya daha önce bu prosedürü uygulamak için değiştirilmiş olan örnekleri kullanmayın. Özellikle, kromatophore tabakası hala örnek üzerinde bozulmamış olmalıdır.
- Hayvanlar hemen kullanılmazsa, kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın. örnekleri defrost için, diseksiyon önce 1 saat boyunca oda sıcaklığında su koyun.
- hayvanın arka tarafı boyunca kesilmiş paslanmaz çelik düz ince nokta diseksiyon makas, kullanma. ventral manto üssünde başlayın ve yüzgeç bölgede biter.
- forseps diseksiyon ve diseksiyon makas kullanarak bağ dokusu kesilmesi ile kaldırarak iç organların (mide, solungaç, mürekkep bezi, üreme organları, sistemik kalp ve brakiyal kalp) tüm çıkarın. Bir örnek torbaya organları atın.
- Standart 11-1 / 2'de (fin tarafı) manto pin T-işaretçilerine diseksiyon kullan "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "esnek bir diseksiyon pedi içeren alüminyum diseksiyon tava. doku Batmak bir tek kullanımlık polistiren vakum filtrasyon sistemi ile filtre edilmiş deniz suyu 250 ml0.2 um gözenek boyutlarına ihtiva etmektedir.
- Dikkatle bozulmamış chromatophore içeren cilt tabakası tutarak, diseksiyon forseps ile epidermal deri tabakası (opak renk) çıkartın. epidermal tabaka kaldırıldıktan sonra, bir numune torbasına atın.
- forseps ve diseksiyon makas ile chromatophore tabakasının küçük (1 cm x 1 cm) bölümleri parçalara ayır. 1.5 ml mikro santrifüj tüplerine numune toplamak (disseke doku ile her boş tüpün yarısını doldurun).
- tüpler içeren dokuya süzülmüş deniz suyu 500 ul ekle. Numuneler 4 ° C'de gece boyunca saklanır.
2. Ayırma chromatophore Pigment Granül
- Doku sindirimi
- Papain / kolajenaz hazırlanması
- Kağıt tartmak kollajenaz 30 mg ve 4 "x 4" düşük azot kullanarak papain 5 mg tartın. bir vida kapaklı 50 ml'lik bir polipropilen santrifüj tüpü içine bu aktarın.
- deioniz 10 ml ölçünBir dereceli pipet kullanarak ed su. papain / kollajenaz içeren flakon doğrudan ekleyin. çözelti kadar yüksek ayarda Vortex açıktır.
- Hücre dışı Doku Çıkarma
- x g 5 dakika 14,000 Aşama 1.7 toplanan chromatophore doku santrifüjleyin. Bir plastik atık kovaya deniz suyunun üst tabaka atın.
- P1000 değişken hacimli tek kanallı mikropipet kullanarak doku papain / kollajenaz çözüm 500 ul ekleyin. En yüksek ayarda 1-2 dakika boyunca her bir örnek Vortex.
- çevreleyen doku hücreleri ayırmak için 40 kHz'lik bir frekansta 5 dakika boyunca numune sonikasyon.
- 14.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Bir plastik atık kovaya süpernatant atın.
- x g 5 dakika 14,000 toplanan chromatophore doku santrifüjleyin. Bir plastik atık kovaya deniz suyunun üst tabaka atın. bir kez daha tekrarlayın.
- El ile kalan geniş doku sn kaldırmakBir sonraki adıma geçmeden önce forseps ile bu süreçte sindirimi yoktu leri.
- Papain / kolajenaz hazırlanması
- Pigment granüller Yalıtımlı
- Homojenizasyon tamponu hazırlanması
- 2.38 g tartılır (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit) (HEPES, 100 mM), magnezyum klorür (10 mM), potasyum-aspartat 0.856 g (50 mM) 0.095 gr, 0.015 g ditiyotireitol (1 mM). bir vida kapaklı 150 ml'lik bir polistiren kap içine aktarın. Ticari bir küçük tablet proteaz önleyici.
- Bir dereceli silindir kullanarak, iyonu giderilmiş su, 100 ml ölçün. homojenizasyon tuzlar içeren kabın doğrudan ekleyin. çözelti kadar Vortex açıktır.
- Pigment Granül homojenizasyon
- 5 dakika boyunca 14.000 xg'de adım 2.1 her bir örnek santrifüj. Bir plastik atık kovaya süpernatant atın. Bu örnek dışı doku geçersiz olmalıdır.
- Ekle 500# 181; 1-2 dakika her biri için her bir tüp ve vorteks homojenizasyon tamponu iyice örnekleri karıştırın. 30 dakika (~ 40 kHz) numuneler sonikasyon ve 14,000 x g 'de santrifüj 5 dakika ile takip edin.
- Bir plastik atık kovaya supernatant atmak ve chromatophore sakkuluslar ve protein hayvan iplerini tam sindirim sağlamak için önceki adımı 2-3 kez tekrarlayın. Geri kalan çözelti, açık sarı bir süpernatan ve izole pigment granülleri içeren kırmızı renkli bir pelet içermelidir.
- Homojenizasyon tamponu hazırlanması
3. Pigment Ekstraksiyon
- Asidik metanol preparasyonu (HCl-MeOH)
- Dikkatle 5 ml metanol (MeOH) konsantre (36,5-38% (w / w)), hidroklorik asit (HCI) 25 ul ekle. bir vida kapaklı bir cam numune şişesine HCl-MeOH çözeltisi saklayın. eşit çözüm karıştırmak için hafifçe döndürün.
NOT: Daha fazla asidik çözelti, daha pigment fi sırasında çıkartılacaktırilk çıkarma.
- Dikkatle 5 ml metanol (MeOH) konsantre (36,5-38% (w / w)), hidroklorik asit (HCI) 25 ul ekle. bir vida kapaklı bir cam numune şişesine HCl-MeOH çözeltisi saklayın. eşit çözüm karıştırmak için hafifçe döndürün.
- Pigment Ekstraksiyon
- 14.000 xg'de 5 dakika boyunca (2.2.2) pigment granül süspansiyonu Santrifüj ve bir plastik atık kovaya süpernatant atın.
- HCl-MeOH çözeltisi 500 ul ilave edin ve 3-4 dakika ~ için her bir örnek girdap. 10 dakika boyunca (~ 40 kHz) numuneler sonikasyon, daha sonra 14,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
- Bir transfer pipeti kullanarak, bir 1 dramlık vidalı kapaklı cam şişede supernatant toplamak. süpernatant rengi koyu kırmızı olmalıdır.
- başka bir renk (~ 4-5 yıkar) ekstre kadar çıkarma adımı 3.2.2 tekrarlayın.
NOT: Her çıkarma ~ pigment 1.5 ml verecektir. Geri kalan renksiz bir pelet pigmenti ekstre granüller olup. Not: renksiz granül ve ekstre pigmentler iki sonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta su içinde saklanabilir.
Ekstraksiyon Süreci boyunca 4. Karakterizasyonu
- Tarama ElECTRON Mikroskopi
- ekstraksiyon işlemi saflığını doğrulamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak (adım 2.2.1 ve pigment ekstre adım 3.2.3 dan girmemiş) Görüntü granülleri.
- 14.000 xg'de 5 dakika boyunca görüntüleme, ilk santrifüj hem reaksiyona girmemiş granül ve pigment çıkarılan granüller granül örnekleri hazırlamak ve bir plastik atık kovaya süpernatant atmak için. 1 ml etanol ve mevduat bir transfer pipet kullanarak alüminyum SEM taslakları üzerine granül süspansiyonu 2-3 damla bu yeniden askıya.
- gece boyunca örnekleri kurutulduktan sonra 15 mil bir kaplama elde etmek 3 dakika için altın, platin kaplamalı kat püskürtmeyle çökeltilmesi.
- Bir Schottky verici ve bir ikincil elektron dedektörü ile bir SEM ile görüntü. 5-7 kV ışını gerilim ve görüntüye 8 ve 9 mm, bu malzemeler arasında bir çalışma mesafesi kullanın.
- Ultraviyole-Görünür (UV-Vis) Spektrofotometrik Ölçümler
- absorbans pro Monitör200-800 nm bir çift ışın spektrofotometre kullanılarak 3 koşulları için dosyaları (2.2.2 girmemiş granül, 3.2.3 çıkarılan pigment ve 3.2.4 pigment çıkarılan granül).
- reaksiyona girmemiş granüller ve pigment ekstre granüller için 1 ml'lik bir küvete deiyonize su kullanılarak boş bir ölçüm toplayın. Her iki numune için UV-Vis absorpsiyon spektrumları toplayın.
- ekstre pigment için 1 ml'lik bir küvete asidik metanol çözeltisi kullanılarak boş bir ölçüm toplayın. numune için UV-Vis absorpsiyon spektrumu toplayın.
- Soğurma tepe noktasının maksimum görece yüksekliğe ulaşır dalgaboyunu tanımlayarak Her numunenin maksimum bir dalga boyuna belirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kromatoforlar D. disseke edilir pealeii dorsal manto (Şekil 1A, 1B). Bunlar kaldırıldıktan sonra, kromatoforlar lize edildi ve pigment granülleri (Şekil 2A, 2B) üzerinden izole etmek için santrifüj ve yıkama döngüleri kullanılarak saflaştırılır. Asidik metanol solüsyonları (HCl-MeOH) çözülebilir pigment özü ve çözünmeyen, renksiz bir pigment ekstre granüller hasıl granüller (Şekil 2C) için pigment elde etmek için kullanılır.
çıkarma işlemi granüllerin ortalama çapı azalır. Bu tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak gözlenir. (Şekil 3A, N = 100 hata standart sapma) granülleri HCl-MeOH maruz önce, (527.3 ± 91.8) nm arasında bir ortalama çapa sahiptir. Pigment granül elde edilir, boyut azalmasıs (202.6 ± 32.2) mil (n = 100, hata standart sapma, Şekil 3B). Bu boyut küçültme HCl-MeOH ile işlemden geçirildi granül pigment ekstre bağlı olduğu varsayılmaktadır.
Bu hipotezi test etmek için, görünür renk öncesi ve sonrası çıkarma farklılıklar ışık mikroskopisi ve spectrofotometrisi kullanılarak izlenmektedir. HCl-MeOH ilave edilmesi üzerine, reaksiyona girmeyen granüller ile ilgili renk görünür (Şekil 4A) azaltır. Bu da, geniş bir emme profili (~ 280-800 nm) çok daha düşük bir yoğunlukta olsa önceden ekstre granüller ve sonrası ekstre granüller için görülmektedir UV-vis spektrofotometri (Şekil 4B) kullanılarak karakterize edilir; birlikte, çözülebilir pigment özü ~ 380 nm'de bir omuz ile ~ 500 nm'de merkezlenmiş bir lambda maks sergiler. Topluca, bu veriler başarıyla granül görünür renk ayıklamak için bir yöntem önermek.
Şekil 1: kalamar D. kromatoforların pealeii. (A) Squid D. pealeii dorsal manto. (B), kırmızı, sarı ve kahverengi kromatoforların Aydınlık alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Ekstraksiyon işleminin İllüstrasyon (A) kromatoforların disseke edilir. (B) Pigment granülleri homojenize chromatophore dokudan ayrılmış ve santrifüjleme ve yıkama döngüleri bir dizi kullanılarak saflaştırılır. (C) pigment eski olabilir hâl almıştır renksiz pigment çıkarılan granül ayrılır çözünebilir pigment süpernatant veren HCl-MeOH kullanılarak zerrelerden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: nanoyapılı granül HCl-MeOH çıkarma değiştirir çapları (A) öncesi asidik metanol çıkarılan pigment granüllerinin tarama elektron mikroskop ve (B) post-asidik metanol çıkarılan pigment granülleri.. Ölçek çubuğu = 1 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/ 54803 / 54803fig4.jpg "upload />
Şekil 4:. HCl-MeOH ekstraksiyon nano yapılı granüller görünür renk değiştirir ekstraksiyon süreci boyunca pigment granül (A) Aydınlık alan ve görüntüler. (B) ön (siyah) absorbansı spektrumları - ve sonrası (mavi) -. Pigment süpernatant (kırmızı) ile birlikte ekstraksiyon bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kalamar chromatophore granüllerden pigmentlerin elde etmek için bir yöntem gösterilmiştir. Özellikle granülleri hedefleyerek, hedefimiz adaptif renklenmeye aracılık rollerini tespit etmektir. Bu yöntem toplu doku örnekleri 14 veya dondurularak kurutulmuş bir cilt 15 kullanılarak cephalopod pigmentler karakterize etmek için tasarlanan önceki raporlarda farklıdır.
Bu protokol, chromatophore pigmentler ekstre etkili olsa da, küçük reaksiyon ölçekler ile sınırlıdır. Bir mürekkep balığı verim Kesme ~ saflaştınldı granüller 11 mg. Yaklaşık bu kitlenin% 58 HCl-MeOH çözeltisi kullanılarak ekstre çözünür pigment içerir. 12. Başlangıç chromatophore doku saflığı doğrudan tek diseksiyon ürün verimini etkilemektedir. Numuneler aşırı epidermal veya diseksiyon sırasında toplanan iridofor dokusu ile kirlenmiş görünüyorsa, bu, numunenin içeriğini ayrı ek buf onları tekrar süspansiyon en iyisidirfer ve homojenizasyon tekrar adımları başlar. chromatophore dokusundan pigment granülleri saf nüfusu izole 4 gün boyunca yayılan olabilir gibi birçok 4, sekiz saat sonication döngüleri sürebilir. Pigment granüllerin saf popülasyonu sağlamak için ayrı olarak hastaya kalması önemlidir.
Başlangıç zerre çözeltisi saflığı HCl-MeOH pigment ekstraksiyon adımları etkiler. granüller sindirilmemiş dokusu, sadece girdap tarafından tıkanmıştır ve yukarı 1 saat örnekleri ses dalgalarına maruz ve tekrar çıkarma başlamadan önce örnek homojenize ise. örnek başına HCl-MeOH 500 ul kullanılarak genellikle 4-5 yıkama granüllerden pigment elde etmek için gereklidir. Doğru şekilde yapılırsa, bu prosedür örnek başına çözünür pigment 2-3 ml arasında verecektir. ilave saflaştırma ince katman kromatografisi ile kullanıldığında, izole edilmiş pigmentler xanthommatin ve decarbo değişken konsantrasyonlarda ihtiva eden dört eşsiz fraksiyonlara ayırmakxylated xanthommatin. 12
Bu yöntem, daha iyi renk modülasyon pigmentlerin rolünü anlamak için kimyager, biyolog veya mühendisler tarafından kullanılabilir. granüller içinde pigmentin varlığında nano yapılı chromatophore pigment granül içinde bulunan molekül bileşenleri ile kaynaklanan kafadan, boyama için hiyerarşik bir mekanizma önerir. Bu bulgular, önceden paketlenmiş pigmentli nano partikülleri ile kafadan görüntülenen adaptif renk dinamik aralığını taklit etmek üzere tasarlanmış sistemler bilgilendirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).
