Introduction
हृदय रोग के अध्ययन के लिए, इस तरह के स्ट्रोक के रूप में, इन विवो मॉडल के उपयोग पर निर्भर करता है। ischemia, दवा विषाक्तता, और / या उपचार के संभावित निहितार्थ समझने के लिए, वहाँ रोग है, जो उपचार समूहों के बीच तुलनात्मक अध्ययन के लिए सक्षम बनाता का एक उपयुक्त मानकीकृत, विश्वसनीय, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल का उपयोग करने की आवश्यकता है। इस पांडुलिपि में, हम चूहों का उपयोग कर रहे हैं, ट्रांसजेनिक चूहों और मानकीकृत मूल्यांकन मॉडल की एक बड़ी संख्या की उपलब्धता को देखते हुए। प्रयोगात्मक इस्कीमिक स्ट्रोक और निम्न बरामद होने के बाद मोटर और व्यवहार घाटे का आकलन करने के लिए स्कोर raking, 2 1 विकसित किया गया है।
कई इस्कीमिक स्ट्रोक मॉडल ऐसे पूरा वैश्विक मस्तिष्क ischemia, अपूर्ण वैश्विक ischemia, मल्टीफोकल मस्तिष्क ischemia और फोकल मस्तिष्क ischemia के रूप में उपलब्ध हैं। बाद समूह भी रोगियों में सबसे अधिक प्रचलित स्ट्रोक की श्रेणी में है। पूर्व संध्या के बहुमतएनटीएस में या मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के पास एक एम्बोलिक या थ्रोम्बोटिक रोड़ा के गठन की ओर से शुरू कर रहे हैं। इन मानकों को देखते हुए, मॉडल बारीकी से प्रस्तुत मानव स्ट्रोक की बीमारी एटियलजि mimics और अत्यधिक प्रासंगिक 3 प्राप्त परिणामों में आता है। फिर भी, मनुष्यों में रोग के इलाज के लिए पशु मॉडल से खोजों का अनुवाद चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है। अब तक, केवल थ्रांबोलिटिक ऊतक plasminogen उत्प्रेरक का उपयोग तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक 4 के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया है।
माउस में फोकल मस्तिष्क ischemia, पीछे मस्तिष्क परिसंचरण स्ट्रोक मॉडल और मस्तिष्क शिरापरक घनास्त्रता मॉडल के मॉडल के बीच बेहद आक्रामक हैं, उनके प्रयोज्यता ह्रासमान और विश्लेषण करती है कि प्रदर्शन किया जा सकता है की सीमा को सीमित। हालांकि, इस तरह एम्बोलिक मॉडल, photothrombosis मॉडल, endothelin -1 प्रेरित स्ट्रोक मॉडल, और intraluminal सिवनी मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (एम के रूप में अन्य तकनीकों,सीएओ) मॉडल, ऐसी सीमाओं के बिना उपयोग के लिए उपलब्ध हैं। MCAO मॉडल एक तकनीक इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। यह फोकल मस्तिष्क ischemia है कि आसानी से reperfused जा सकता है और एक उच्च throughput ढंग से प्रदर्शन किया उत्प्रेरण का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। इस मॉडल, अर्थात्, Zea-Longa और कोइज़ुमी के तरीकों के लिए दो दृष्टिकोण हैं। वे जिस तरह से रोड़ा सिवनी वाहिका में डाला जाता है में से थोड़ा भिन्न होते हैं। Zea-Longa तकनीक में, सिवनी बाहरी मन्या धमनी के माध्यम से 5 डाला जाता है। यहाँ प्रस्तुत तकनीक कोइज़ुमी विधि है जिसमें occluding सीवन आम मन्या धमनी 6 के माध्यम से डाला जाता है से संशोधित किया गया है।
MCAO मॉडल को सफलतापूर्वक इस्कीमिक स्ट्रोक के दौरान होने वाली विभिन्न घटनाओं का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया गया है। reperfusion के बाद, मस्तिष्क शोफ रक्त मस्तिष्क बाधा के टूटने के साथ-साथ देखा जा सकता है। पीक neuronal मौत आमतौर पर 24 घंटे में मनाया जाता है; हालांकि, यह फिर से7 दिन के बाद 7 आधारभूत स्तर पर बदल जाता है। मनुष्यों में, लिंग और उम्र महत्वपूर्ण चर जब स्ट्रोक परिणाम को निर्धारित है, यह भी चूहों और चूहों 8, 9, 10 में मनाया जाता है। कई प्रकाशनों उपचार दक्षता 11, 12, 13, 14 प्रदर्शित करने के लिए MCAO मॉडल का इस्तेमाल किया है।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं स्वास्थ्य (एनआईएच) के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार मियामी में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया। बाँझ उपकरण और सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने की आवश्यकता है।
1. आड़ सिवनी तैयारी
- 25 ग्राम और 25 के बीच चूहों के लिए 0.23 मिमी - - शरीर के वजन के 35 ग्राम 20 के बीच चूहों के लिए 0.21 मिमी व्यास की एक सीवन का प्रयोग करें। MCAO प्रक्रिया के लिए टांके के प्रकार के चुनाव पशु वजन पर निर्भर करता है।
- एक रजत कलम का प्रयोग, 9 मिमी सिलिकॉन लेपित सिरे से शुरू करने पर सिवनी निशान। इस प्रविष्टि लंबाई के लिए एक गाइड के रूप में काम करेगा।
2. सर्जरी के लिए तैयारी
- ऑक्सीजन के साथ मिश्रित isoflurane के साथ माउस anesthetize, एक प्रयोगशाला संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग करते हुए। वाणिज्यिक मशीन पर 2 से 5 और ऑक्सीजन का प्रवाह की स्थापना पर isoflurane का उपयोग करें (सामग्री तालिका देखें)। surger को जानवर स्थानांतरणY सतह और एक नाक शंकु का उपयोग कर संज्ञाहरण बनाए रखने (प्रयोग isoflurane 1.5 की स्थापना - 2 में 2.5 और ऑक्सीजन का प्रवाह)।
- सुनिश्चित करें कि माउस श्वसन दर लगभग 1 है - हांफते बिना प्रति सेकंड 2 श्वसन। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करें कि पशु मूंछ उत्तेजना प्रतिक्रिया और पेडल पलटा (पैर की अंगुली चुटकी) का प्रदर्शन नहीं करता। सर्जरी के दौरान श्वसन दर और प्रयास पर नजर रखने, कम से कम हर 5 मिनट।
- उन्हें प्रक्रिया के दौरान सुखाने से रोकने के लिए एक बाँझ झाड़ू का उपयोग हर आंख पर नेत्र स्नेहक की एक बूंद रखो। वैकल्पिक रूप से, एक बाँझ दवा ट्यूब से आंख के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं।
- अपनी पीठ पर पशु पलटें और चीरा क्षेत्र दाढ़ी। बाद में, अच्छी तरह से 70% इथेनॉल, chlorhexidine द्वारा पीछा किया, और 70% इथेनॉल के साथ अंतिम झाड़ू का उपयोग सर्जरी क्षेत्र कीटाणुरहित। एक गर्म शल्य सतह पर जानवर एक stereomicroscope के तहत रखें।
3. आम मन्या धमनी के विच्छेदन और आंतरिक / External शाखाओं में बंटी
- (- 4 सेमी लगभग 3) शल्य कैंची और संदंश का प्रयोग, एक उथले midline चीरा गर्दन में, छाती की हड्डी के ऊपर से जबड़े के नीचे प्रदर्शन करते हैं। सर्जिकल कपड़ा सर्जरी के क्षेत्र के साथ गैर बाँझ सतहों के संपर्क में आने से रोकने के लिए उपकरणों के आसपास रखा जाना चाहिए। सर्जिकल कपड़ा मौजूदा वीडियो में छोड़ा गया था फिल्माने सहायता करने के लिए।
- संदंश, ध्यान से अलग वसायुक्त और संयोजी ऊतक का उपयोग श्वासनली बेनकाब करने के लिए। ऊतक को आसानी से और स्वाभाविक रूप से दोनों पक्षों के लिए अलग होना चाहिए।
- चूहों की गर्दन की पीठ पर एक तकिया (गोल वस्तु, व्यास में लगभग 0.5 सेमी) गर्दन का विस्तार करने के लिए, आगे की शल्य चिकित्सा के लिए इस क्षेत्र को प्रकाश में लाने रखें।
- चीरा या तो एक ऊतक प्रतिकर्षक या हुक का उपयोग खोलें।
- श्वासनली के जानवर के बाईं ओर, ध्यान से बाईं आम मन्या धमनी (सीसीए) को बेनकाब करने के संयोजी ऊतक के अलावा tweeze। नसों और प्रमुख नसों सीसीए के साथ बंडल को नुकसान नहीं सावधान रहें।
- सीसीए उजागर जारी, अंतर्निहित ऊतक से अलग करने के लिए सावधान किया जा रहा है, और बेनकाब शीर्ष "वाई" आंतरिक मस्तिष्क धमनी (आईसीए) और बाहरी मस्तिष्क धमनी (ईसीए) की शाखाओं में बंटी। सीसीए detaching में सहायता करने के लिए, संयोजी ऊतक पियर्स सीसीए के तहत घुमावदार संदंश डालने और फिर धीरे धीरे उन्हें खोलने के लिए अनुमति देते हैं।
MCAO सिवनी प्रविष्टि के लिए सीसीए की तैयारी 4.
- सीसीए के तहत लंबाई में लगभग 4 सेमी की नायलॉन सीवन के 3 खंडों डालें। सुनिश्चित करें कि सीसीए मुड़ के रूप में इस तेजी से सिवनी की प्रविष्टि को मुश्किल होता नहीं है।
- निम्नतम बिंदु पर संभव, एक स्थायी गाँठ का उपयोग कर नीचे सीवन बंद करें।
- सिर्फ आईसीए नीचे शीर्ष सीवन टाई / ईसीए एक हटाये पर्ची गाँठ का उपयोग कर शाखाओं में बंटी।
- बीच सीवन एक हटाये पर्ची गाँठ बाँध का उपयोग कर, लेकिन यह खुली रखने के लिए। यह रूप में सिवनी प्रविष्टि बाधा नहीं अंतरिक्ष के बहुत सारे छोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है।
- microdissection वसंत विज्ञान का प्रयोगssors, नीचे और मध्यम टांके के बीच सीसीए में एक चीरा प्रदर्शन करते हैं। 0.2 मिमी चीरा नीचे सीवन के करीब प्रदर्शन करना।
5. मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा
- संदंश का प्रयोग, सीसीए चीरा में MCAO सिवनी डालें, शीर्ष करने के लिए इसे मार्गदर्शक। थक्के और सीसीए उद्घाटन के समापन को रोकने के लिए 4.5 कदम के बाद जल्दी से इस कदम प्रदर्शन। घटना है कि सिवनी प्रविष्टि अवरुद्ध है, चीरा को फिर से खोलने के लिए संदंश के सुझावों का उपयोग करें।
- धीरे उसके चारों ओर रक्त के प्रवाह को सीमित करने के लिए एक पर्ची गाँठ का उपयोग कर MCAO सिवनी सिलिकॉन ओर से बीच सीवन नीचे टाई, लेकिन काफी ढीला यह स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देने के लिए।
- ध्यान से शीर्ष सिवनी पूर्ववत, सुनिश्चित करें कि MCAO सिवनी बाहर पर्ची नहीं कर रही है।
- मिलीमीटर के एक दंपति द्वारा आईसीए में MCAO सिवनी डालें और फिर कदम 5.2 में वर्णित के रूप में शीर्ष सिवनी reclose, एक ही तरीके से।
- गाइड रोड़ा क्षेत्र के लिए MCAO सिवनी। सफल प्रविष्टि का संकेत हैचांदी 9 मिमी मार्क सीसीए चीरा से खून backflow की कम मात्रा से और कहा कि स्पष्ट सीसीए चीरा और आईसीए / ईसीए विभाजन के बीच स्थित है। सफल रोड़ा की आगे की पुष्टि इस तरह के एक लेजर डॉपलर रक्त के प्रवाह की निगरानी प्रणाली 15, 16 के रूप में निगरानी के तरीके का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है।
नोट: अवरोधित क्षेत्र तरफ बीच मस्तिष्क क्षेत्र में रक्त के प्रवाह के 90% में एक बूंद सफल रोड़ा इंगित करता है। - सफल रोड़ा के बाद, कसकर मध्य और शीर्ष सीवन नीचे टाई। तो दिखावा प्रविष्टि प्रदर्शन, टांके reclose नहीं है, लेकिन बजाय तुरंत कदम करने के लिए 7.3 छोड़।
6. चीरा समापन और पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल
- चीरा क्षेत्र में टांके में टक।
- प्रतिकर्षक या ऊतक हुक और तकिया निकालें।
- स्वच्छ सीवन क्षेत्र बाँझ खारा और एक कपास झाड़ू का उपयोग कर।
- चीरा नायलॉन सीवन / सुई और संदंश का उपयोग बंद कर दें। <li> प्रशासन विरोधी भड़काऊ (जैसे, Carprofen 10 मिलीग्राम / किग्रा, अनुसूचित जाति) और एनाल्जेसिक (जैसे, Buprenorphine 0.1 मिलीग्राम / किग्रा अनुसूचित जाति, दिन में दो बार) दवाओं पोस्ट ऑपरेटिव परेशानी को दूर करने के लिए। हाइपोथर्मिया को रोकने और पानी और नरम भोजन करने के लिए विज्ञापन labium पहुँच देने के लिए एक पिंजरे एक गर्म पैड पर रखा चूहों में रखें।
- (- 10 मिनट 5) और स्ट्रोक के लक्षण के लिए जानवरों की वसूली की निगरानी। वे हल्के पार्श्व पक्षाघात से भिन्न है और contralateral ओर और रोलिंग के गंभीर संकुचन के चक्कर सकते हैं। कई मूल्यांकन के अंक चर्चा में सूचीबद्ध हैं। श्वसन संकट या गंभीर दौरे के लक्षण प्रदर्शित पशु euthanized किया जाना चाहिए।
- ischemia reperfusion प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, 120 मिनट या अधिक करने के लिए 30 मिनट से जगह में MCAO सिवनी छोड़ दें। रोड़ा समय को कम मृत्यु दर से बचाता है।
- स्थायी रोड़ा के लिए, 24 घंटे के लिए जगह में MCAO सिवनी छोड़ देते हैं, हालांकि महत्वपूर्ण मृत्यु दर उम्मीद की जा रही है। इस समय व्यतीत हो जाने के बाद, STE के लिए आगे बढ़नापी 7।
- स्थायी रोड़ा मॉडल का उपयोग करते हैं, तो अंत बिंदु तक पिंजरे में चूहों रहते हैं। उस समय, सिवनी हटाने के लिए (कदम 7.8 करने के लिए 7.1)। यह प्रक्रिया भी इच्छामृत्यु के बाद किया जा सकता है।
7. Reperfusion
- पशु फिर anesthetize (2.1 में निर्देशों का पालन) और घाव बंद टांके हटा दें।
- संदंश और ऊतक विभाजक, चीरा फिर से खोलने और सीसीए का पर्दाफाश का उपयोग करना।
- ध्यान से शीर्ष सीवन को हटाने और जब तक सिलिकॉन लेपित हिस्सा बीच गाँठ पर स्थित है धीरे MCAO सीवन पर खींच।
- सिवनी पारित बह रहा है (यह एक पर्ची गाँठ होने की जरूरत नहीं है) से खून को रोकने के लिए सीवन पर शीर्ष गाँठ फिर से करें।
- ध्यान से बीच गाँठ पूर्ववत और अतीत शीर्ष गाँठ सिवनी खींच, लेकिन यह सीसीए के अंदर रखने के लिए।
- कसकर धमनी रक्त के प्रवाह को ब्लॉक करने के लिए शीर्ष गाँठ बंद करें।
- पूरी तरह से MCAO सिवनी बाहर खींचो और कसकर बीच गाँठ बंद करें।
- MCAO सिवनी हो सकता हैकई बार फिर से इस्तेमाल किया। प्रत्येक उपयोग के बाद, दूषित पदार्थों को (जैसे, रक्त या ऊतक) एक बाँझ धुंध का उपयोग कर दूर करने के लिए 70% इथेनॉल में ध्यान से सिवनी साफ। बाद में, एक अजीवाणु थैली में सिवनी जगह है और यह बाँझ।
- दोहराएँ कदम 6.1 - 6.4 और जानवरों की वसूली की निगरानी।
8. ऊतक विश्लेषण
- स्ट्रोक की मात्रा पर नजर रखने के लिए, मस्तिष्क काटना।
- एक दो कदम प्रक्रिया का उपयोग माउस euthanize। सबसे पहले, बंद हो जाता है जब तक साँस लेने में isoflurane की अधिक मात्रा के लिए पशु बेनकाब। टीटीसी धुंधला के लिए, तुरंत माउस सिर काटना और मस्तिष्क निकासी के लिए आगे बढ़ें। मस्तिष्क सेक्शनिंग (immunostaining का विश्लेषण करती है उदाहरण के लिए, के लिए) के लिए, एक हृदय पंचर शिरच्छेद से पहले के माध्यम से छिड़काव करते हैं।
- कट ऑफ खोपड़ी के आधार पर सिर और आंखों के बीच अप करने के लिए खोपड़ी के शीर्ष करने के लिए गर्दन खोलने से खोपड़ी में कटौती। साथ खोपड़ी अवगत कराया, खोपड़ी आधार खोलने से शुरू दोनों पक्षों के साथ हड्डी में कटौतीथैली पर निर्भर है। खोपड़ी के व्यापक हिस्से के साथ इस कटौती करें। कैंची मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए को रोकने के साथ भी गहरे तक पहुँचने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- बाद में, दो आँख कुर्सियां के बीच की हड्डी में कटौती।
- संदंश का प्रयोग, मस्तिष्क को बेनकाब करने की खोपड़ी के शीर्ष उठा। वहाँ केवल एक छोटे से विरोध होना चाहिए। यह आसानी से उठा नहीं है, खोपड़ी चीरों अधूरा हो सकता है। मस्तिष्क धीरे कुंद घुमावदार संदंश का उपयोग कर बाहर जिज्ञासा। मस्तिष्क अभी भी कई नसों से जुड़ी हो सकती है। धीरे-धीरे आगे बढ़ें, जिस तरह से साथ संलग्नक को हटाने।
- एक 1 मिमी मस्तिष्क मैट्रिक्स में नए सिरे से मस्तिष्क की जगह पीबीएस की बूंदों के एक जोड़े को जोड़ने, और मैट्रिक्स एक रेजर ब्लेड या cryostat ब्लेड का उपयोग कर के साथ टुकड़ा।
- एक 100 मिमी डिश के लिए मस्तिष्क स्थानांतरण और डिश के तल को कवर करने के लिए धुंधला समाधान (2% 2,3,5-triphenyltetrazolium क्लोराइड [टीटीसी] पीबीएस में भंग) जोड़ें। दो संदंश का प्रयोग, अलग सभी मस्तिष्क स्लाइस (सामने नीचे की ओर) और डिश के तल पर क्रम में उन्हें जगह है।
नोट: धुंधला व्यवहार्य ऊतक लाल, अलाभकारी ऊतक सफेद शेष के साथ बंद हो जाएगा। 37 डिग्री सेल्सियस का हल वार्मिंग धुंधला गति देगा। स्ट्रोक क्षेत्र (सफेद) के लक्षण 90 मिनट पोस्ट स्ट्रोक के रूप में के रूप में जल्दी से देखा जा सकता है और अधिक से अधिक 7 दिनों के लिए दिखाई रहेगा। इमेजिंग स्ट्रोक की मात्रा की गणना की अनुमति के लिए एक शासक के साथ किया जाना चाहिए। - सेक्शनिंग के लिए प्रक्रिया विच्छेदित दिमाग, इम्युनो-धुंधला हो जाना, प्रोटीन अलगाव, या अन्य प्रक्रियाओं 17 साल की एक किस्म है, 18, 19।
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Representative Results
रोड़ा सीवन के लिए प्रविष्टि मार्ग चित्र 1 में प्रदर्शन किया है। MCAO सिवनी आईसीए में विभाजित, रोड़ा क्षेत्र से कराई जानी है। एमसीए के सफल रोड़ा ऊतक चोट, टीटीसी धुंधला द्वारा दिखाई दे को बढ़ावा मिलेगा। चित्रा 2 (90 मिनट या 24 घंटे बाद रोड़ा, चित्रा 2 बी में धुंधला) दिखावा में इलाज पशु (2A चित्रा) और एक 60 मिनट MCAO ischemia reperfusion जानवर से से धुंधला की छवियों को प्रस्तुत करता है। स्ट्रोक की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पहले प्रत्येक अनुभाग के लिए स्ट्रोक क्षेत्र की गणना का उपयोग करते हुए शासक इमेजिंग प्रक्रिया में शामिल contralateral पक्ष के कुल क्षेत्रफल से ipsilateral पक्ष के गैर infarcted क्षेत्र को घटा कर। इस गणना वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर या खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। उसके बाद, कि स्लाइड 1 मिमी मोटी हैं प्रत्येक टुकड़ा ध्यान में लेने के लिए स्ट्रोक की मात्रा की गणना के लिए और स्ट्रोक की मात्रा योगसभी स्लाइस आर। यह प्रक्रिया प्रत्येक जानवर है, जो तब अलग जानवर समूहों और उपचार के बीच तुलना की जा सकती लिए कुल स्ट्रोक मात्रा प्रदान करेगा। औसत पर, एक 60 मिनट रोड़ा जंगली प्रकार गैर इलाज C57BL / 6J 15 सप्ताह पुराने के चूहों में के बारे में 21 ± 3 मिमी 3 में से एक स्ट्रोक की मात्रा में reperfusion परिणामों के 23 घंटा के द्वारा पीछा किया।
स्ट्रोक की मात्रा की जांच करने के अलावा, immunofluorescence astrogliosis के लिए इस तरह के microtubule जुड़े प्रोटीन -2 (MAP2) के रूप में लक्ष्य, न्यूरोनल चोट (चित्रा 3 ए) या glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के लिए की एक भीड़ (चित्रा 3 बी) के लिए किया जा सकता है। इस तरह के विश्लेषण आगे स्ट्रोक प्रगति और वसूली के विश्लेषण के साथ ही अन्य स्ट्रोक ऊतकों को नुकसान और मरम्मत में शामिल प्रक्रियाओं को सक्षम।
आकृति 1: रोंग> मस्तिष्क धमनी फिजियोलॉजी की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। आम मन्या धमनी (सीसीए) रोड़ा क्षेत्र से MCAO प्रविष्टि आय का मार्ग नीले रंग में संकेत दिया। (:;: मध्य सीवन, बी एस: नीचे सिवनी एमएस शीर्ष सिवनी टीएस) सर्जरी क्षेत्र आंकड़ा (ओवल आकार) और सिवनी प्लेसमेंट के तल पर स्थित है काले लाइनों द्वारा संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: मस्तिष्क वर्गों के टीटीसी धुंधला हो जाना। शीर्ष पैनल दिखावा प्रविष्टि निम्न ठेठ धुंधला प्रतिनिधित्व करते हैं। मध्य और नीचे पैनलों 90 मिनट या reperfusion की 24 घंटा के बाद एक 60 मिनट का MCAO बाद प्राप्त किया गया। स्केल बार 1 मिमी है।
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चित्रा 3: स्ट्रोक के बाद माउस मस्तिष्क के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। एक 60 मिनट का रोड़ा के बाद, दिमाग, 23 घंटे के लिए reperfused काटा, और cryosectioning के लिए प्रोसेस किया गया। MAP2 (ऊपर) और GFAP (नीचे) के लिए एंटीबॉडी का प्रयोग, ऊतक न्यूरोनल चोट और या तो दिखावा (बाएं पैनल) में astroglyosis या 90 मिनट ischemia reperfusion-दिमाग (सही पैनल) के लिए विश्लेषण किया गया था। प्रस्तुत चित्र confocal माइक्रोस्कोपी एक 10x उद्देश्य का उपयोग द्वारा उठाए गए कई छवियों से संयुक्त रहे हैं। स्केल बार 1 मिमी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| मूल्यांकन के मानदंड | ||||
| सामान्य अवस्था | बालों की हालत | स्व-सफाई व्यवहार (0: कोई नहीं; 2: सामान्य) | ||
| (0: सबसे बुरे, 2: सामान्य) | कान | कान स्थिति (Droopy या उठाया) | ||
| सुनवाई (प्रतिक्रियाशील या नहीं) | ||||
| नेत्र हालत | पलक स्थिति | |||
| प्रतिक्रिया | ||||
| आसन | रेंगने झुकाव, सामान्य | |||
| सहज गतिविधि | बेहोश / कोई आंदोलन, कम गतिविधि सामान्य गतिविधि | |||
| Neurodeficit | शारीरिक समरूपता | जब माउस अभी भी (कोई आंदोलन, रेंगने, चक्कर, आंशिक झुकाव, सामान्य) है | ||
| (0: सबसे बुरे, 4: सामान्य) | चाल | कोई आंदोलन, घूर्णन, चक्कर लगाना एक तरफ घूमना, नोर्माएल | ||
| चढ़ना | angled पथ पर चलना व्यवहार (चाल के रूप में एक ही मापदंड) | |||
| चक्कर व्यवहार | पूंछ से पशु भारोत्तोलन (कोई आंदोलन, घूमता, एक तरफ करने के लिए करार, दोनों पक्षों लेकिन वरीयता के साथ, सामान्य श्रेणी) | |||
| मोर्चा अंग समरूपता | सामने पंजे के व्यवहार को हथियाने को देखो (कोई सब पर हथियाने, केवल एक पक्ष पकड़ लेता है, दोनों को पकड़ो, लेकिन एक पंजा कठोर, दोनों हड़पने लेकिन एक लगातार ढीला पहले, सामान्य श्रेणी) | |||
| अनिवार्य चक्कर | सपाट सतह पर माउस रखो और पक्ष की ओर से कंधे पर धक्का (कोई प्रतिक्रिया / आंदोलन, घूर्णन एक तरफ गिरने, प्रतिरोध करने के लिए धक्का के साथ झुकाव, सामान्य श्रेणी) | |||
| गलमुच्छा प्रतिक्रिया | मूंछ समय में एक पक्ष को स्पर्श (कोई प्रतिक्रिया, मूंछ आंदोलन ही है, सिर बारी, ट्रंक बारी, सामान्य) | |||
| मिरगी व्यवहार | अचानक शोर या प्रकाश परिवर्तन (बेहोश, लगातार सामान्य टॉनिक ऐंठन, क्षणिक सामान्य टॉनिक ऐंठन, क्षणिक फोकल टॉनिक ऐंठन, सामान्य श्रेणी) के बाद व्यवहार | |||
तालिका 1. माउस स्थिति और Neurodeficit के मूल्यांकन के लिए स्केल Ischemia स्ट्रोक के बाद। 1 से 2, अनुकूलित।
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Discussion
वर्णित MCAO विधि के सफल उपयोग के मस्तिष्क में रक्त का प्रवाह शरीर रचना विज्ञान की समझ पर निर्भर है। चूंकि सिवनी का सही स्थान प्रत्यक्ष दृश्य सुराग के अभाव के कारण विचार करने के लिए कठिन है, बार-बार अभ्यास जांच के अध्ययन के लिए यह प्रयोग करने से पहले प्रक्रिया में महारत हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। स्ट्रोक की मात्रा के अनुरूप परिणाम सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए। एक लेजर डॉपलर प्रणाली के अलावा रक्त के प्रवाह के सफल रोड़ा निर्धारित करने के लिए मदद कर सकते हैं और समय समय पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि यह सुनिश्चित करने की प्रक्रिया को सही ढंग से किया जाता है। रूटिंग रोड़ा क्षेत्र के लिए MCAO सीवन धमनी से छेड़छाड़ की जा सकती है। एमसीए के लिए सिवनी मार्गदर्शक एक बार यह सिर्फ ईसीए / आईसीए शाखाओं में बंटी, आईसीए के खिलाफ प्रेस थोड़ा शाखाओं में बंटी (2-3 मिमी) संदंश के साथ ऊपर वाम / नीचे करने के लिए सिवनी मार्गदर्शन और यह करने से रोकने के पारित कर दिया गया में मदद करने के लिए pterygopalatine धमनी में जा रहा है। इसके अलावा, तकिया चलती 3.3 कदम या पु में रखाlling नीचे से ऊपर गाँठ और सही धमनी प्रविष्टि को कम करने के orienting में मदद कर सकते हैं। प्रोटोकॉल के बचे हुए चरणों stereomicroscope के तहत microsurgery शामिल है और काफी स्पष्ट हैं। 90% - विधि, वर्णित के रूप में हमारे समूह द्वारा प्राप्त की और दूसरों के द्वारा की सूचना दी, की सफलता की दर लगभग 80 की है। फिर भी, कई कारकों अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं, शरीर का तापमान नियंत्रण और सिवनी चयन 20, 21, 22 सहित। सर्जरी के दौरान पशुओं के शरीर के तापमान के रखरखाव के पशु अस्तित्व में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है।
उपयोगकर्ता के अनुभव के आधार पर, इस विधि पशुओं की एक बड़ी पलटन अध्ययन करने के लिए एक उच्च throughput ढंग से नियोजित किया जा सकता है। जानवरों के अध्ययन के सांख्यिकीय महत्व पशु विषयों के बीच आंतरिक भिन्नता के बावजूद उपचार समूहों के बीच विचार करने के लिए विषयों की पर्याप्त संख्या के उपयोग पर निर्भर करता है।प्रस्तुत प्रोटोकॉल जबकि बारीकी से रोग की प्रक्रिया के कुछ हिस्सों में इस तरह के अध्ययन पुनः सक्षम बनाता है।
MCAO तकनीक का लाभ यह है कि, जबकि यह कुछ शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं शामिल है, यह craniotomy मॉडल के रूप में अत्यधिक आक्रामक प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और reperfusion अत्यधिक चलाया हुआ है, जो endothelin -1 या एम्बोलिक स्ट्रोक मॉडल का उपयोग संभव नहीं है। तकनीक निकट एक मानव इस्कीमिक स्ट्रोक की प्रक्रिया mimics और विशेषता ऊतक चोट मानव में देखा है, जो photothrombosis मॉडल के लिए मामला नहीं है पैदा करता है। अन्य प्रकाशित तकनीकों की तुलना में, MCAO प्रक्रिया ईसीए का दाग़ना की आवश्यकता नहीं है। यह एक लाभ के बाद से यह स्ट्रोक प्रेरण 23, 24, 25 के बाद प्रभावित गोलार्द्ध के लिए चिकित्सीय एजेंट वितरित करने के लिए हमारे आईसीए अर्क मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है।
ऊतक विश्लेषण के अलावा, पशुओं के व्यवहार longitudinally स्ट्रोक गंभीरता और वसूली का आकलन करने के लिए नजर रखी जा सकती है। यह अलग उपचार समूहों के बीच वसूली की तुलना कर सकते हैं। कई दृष्टिकोण आदेश व्यवहार का मूल्यांकन करने में विकसित किया गया है। कोई व्यवहार घाटा; 1: एक सरल 5 सूत्री पैमाने न्यूरोलॉजिकल घाटा पोस्ट स्ट्रोक (0 मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है नहीं contralateral forepaw विस्तार, 2: रोधगलितांश की contralateral पक्ष पर चक्कर; 3: रोधगलितांश की contralateral पक्ष पर गिरने; 4: कम चेतना के स्तर पर और सहज आंदोलन) 5। इसके अलावा, पशु हालत और व्यवहार का गहराई से विश्लेषण में 1 टेबल 1, 2 में वर्णित के रूप में वसूली का आकलन करने के लिए आयोजित किया जा सकता है।
प्रस्तुत शल्य प्रक्रिया स्ट्रोक की प्रेरण, जो स्ट्रोक संवेदनशीलता पर अध्ययन में इस तकनीक के उपयोग की सीमा के लिए एक यांत्रिक विधि का उपयोग करता है और / याप्रेरणा का एजेंट। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का विश्लेषण स्ट्रोक गंभीरता, निवारक या कम करने की रणनीतियों, उत्तेजक कारकों और संभव चिकित्सीय में उल्लेखनीय उपयोगी हो सकता है दृष्टिकोण के बाद स्ट्रोक। उपचार समूहों के बीच तुलना संभावित इलाज है कि स्ट्रोक नुकसान को कम या वसूली में तेजी लाने सकता है की पहचान करने में मदद कर सकते हैं। दरअसल, वसूली बढ़ाने स्ट्रोक रोगियों की मदद करने में बहुत महत्व का होगा।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCAO suture 0.23 mm | Doccol | 702345PK5Re | |
| MCAO suture 0.21 mm | Doccol | 702145PK5Re | |
| Silver pen | staples | 503205 | |
| Anesthesia machine | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine science tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine science tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine science tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine science tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree scintific | SUT-S 104 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherSci | 50-121-8005 | |
| Brain block | Braintree scintific | BS-A 5000C | |
| Cryostat blade | VWR | 89202-606 | |
| Optional: | |||
| Periflux Laser doppler system | Perimed | Periflux 5000 | |
| Monitoring unit | Perimed | PF 5010 - LDPM |
References
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