Introduction
O estudo de doenças cardiovasculares, tais como acidente vascular cerebral, baseia-se na utilização de modelos in vivo. Para compreender a possível implicação de isquemia, toxicidade da droga, e / ou de tratamento, existe a necessidade de usar um modelo adequado, padronizada, fiável e reprodutível da doença, o que permite estudos comparativos entre os grupos de tratamento. Neste artigo, nós estamos usando ratos, dada a disponibilidade de um grande número de ratos transgénicos e modelos de avaliação padronizados. Raking pontuação para avaliar comportamento motor e déficits seguintes AVC isquêmico experimental ea seguinte de recuperação foram desenvolvidos 1, 2.
Vários modelos de acidente vascular cerebral isquêmico estão disponíveis, tais como isquemia cerebral global, completa, isquemia global incompleta, isquemia cerebral multifocal e isquemia cerebral focal. O último grupo é também a categoria de acidente vascular cerebral em pacientes mais prevalente. A maioria dos eveNTS é iniciada pela formação de uma oclusão embólica ou trombótica na ou perto da artéria cerebral média (MCA). Tendo em conta estes parâmetros, o modelo apresentado imita a etiologia da doença de acidente vascular cerebral humano e faz com que os resultados obtidos altamente relevantes 3. No entanto, a tradução de descobertas a partir de modelos animais para o tratamento da doença em seres humanos tem provado ser um desafio. Até agora, apenas a utilização de tecido trombolítica activador do plasminogénio tem sido aprovado para o tratamento de acidente vascular cerebral isquémico agudo 4.
Entre os modelos de isquemia cerebral focal no rato, o modelo de circulação derrame cerebral posterior e modelo de trombose venosa cerebral são altamente invasivo, diminuindo a sua aplicabilidade e restringir a gama de análises que podem ser realizadas. No entanto, outras técnicas, tais como o modelo de embolia, modelo fototrombose, modelo de acidente vascular cerebral de endotelina-1 induzida, e a oclusão da artéria cerebral média sutura intraluminal (Hmodelo CAO), estão disponíveis para utilização sem estas limitações. O modelo MCAO é uma técnica descrita neste protocolo. Ela oferece um método de confiança de indução de isquemia cerebral focal que pode ser prontamente reperfundidos e realizada de um modo de alto rendimento. Existem duas abordagens para este modelo, ou seja, os métodos Zea-Longa e Koizumi. Eles diferem ligeiramente na forma como a sutura oclusão é inserido na vasculatura. Na técnica de Zea Longa-, a sutura é inserida através da artéria carótida externa 5. A técnica aqui apresentada é modificado a partir do método Koizumi, em que o fio de sutura de oclus é inserida através da artéria carótida comum 6.
O modelo MCAO foi aplicado com sucesso para avaliar diferentes eventos que ocorrem durante o acidente vascular cerebral isquêmico. Após reperfusão, edema cerebral pode ser observada juntamente com a ruptura da barreira sangue-cérebro. Pico da morte neuronal é geralmente observada em 24 h; No entanto, ele revolta-se para os níveis basais após 7 dias 7. Nos seres humanos, o sexo ea idade são variáveis importantes na determinação do resultado do curso, o que também é observado em camundongos e ratos 8, 9, 10. Várias publicações têm utilizado o modelo MCAO para demonstrar a eficácia do tratamento 11, 12, 13, 14.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade de Miami Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC), de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de Saúde (NIH). É necessária a utilização de equipamento estéril e técnicas assépticas.
1. Preparar o Oclusão Sutura
- Utilize uma sutura de 0,21 mm de diâmetro para os ratos entre 20-25 g e 0,23 mm para os ratos entre 25 - 35 g de peso corporal. A escolha do tipo de sutura para o procedimento MCAO depende do peso do animal.
- Usando uma caneta de prata, marque a sutura em 9 mm a partir da ponta de silicone revestido. Isto irá servir como um guia para o comprimento da inserção.
2. preparação para a cirurgia
- Anestesiar rato com isoflurano misturado com o oxigênio, usando um sistema de anestesia laboratório. Use isoflurano na posição 5 e fluxo de oxigênio a 2 na máquina comercial (Veja a Tabela de Materiais). Transferir o animal ao surgery superfície e manter a anestesia utilizando um cone de nariz (use a configuração 1.5 isoflurano - 2,5 e fluxo de oxigênio a 2).
- Certifique-se de que a taxa respiratória do rato é de cerca de 1-2 respiração por segundo, sem ofegante. Além disso, garantir que o animal não apresenta reação estimulação bigodes e reflexo pedal (toe pitada). Monitorar a taxa de respiração e esforço durante a cirurgia, pelo menos a cada 5 min.
- Colocar uma gota de lubrificante oftálmica em cada olho utilizando uma zaragatoa estéril para evitar que sequem durante o procedimento. Em alternativa, aplicar pomada oftálmica para o olho a partir de um tubo farmacêutica estéril.
- Virar o animal à sua volta e fazer a barba área da incisão. Depois, desinfectar completamente a área da cirurgia utilizando 70% de etanol, seguido de cloro-hexidina, e o cotonete final com 70% de etanol. Colocar o animal em uma superfície cirúrgica quente sob um microscópio estereoscópico.
3. A dissecção da artéria carótida comum e interna / External Ramificação
- Utilizando uma tesoura cirúrgica e uma pinça, executar uma incisão na linha média raso no pescoço, por cima do osso do peito para abaixo da mandíbula (cerca de 3-4 cm). campo cirúrgico deve ser colocada em torno da área da cirurgia para impedir que os instrumentos de entrar em contacto com superfícies não-estéreis. O campo cirúrgico foi omitido no vídeo atual para ajudar as filmagens.
- Utilizando uma pinça, gordo cuidadosamente separados e do tecido conjuntivo para expor a traqueia. Tissue deve facilmente e naturalmente separar a ambos os lados.
- Coloque um travesseiro (objeto redondo, cerca de 0,5 cm de diâmetro) na parte de trás do pescoço dos ratos para estender o pescoço, expondo ainda mais a área de cirurgia.
- Abra a incisão utilizando um afastador de tecido ou ganchos.
- No lado esquerdo do animal, da traqueia, cuidadosamente pinça para além do tecido conjuntivo para expor a artéria carótida comum esquerda (CCA). Tenha cuidado para não danificar os nervos e veias principais empacotados com o CCA.
- Continue expondo a CCA, tomando cuidado para separar o tecido subjacente, e expor o topo de "Y" de ramificação da artéria cerebral interna (ICA) e da artéria cerebral externa (ECA). Para ajudar no descolamento da CCA, insira as pinças curvas sob o CCA para perfurar o tecido conjuntivo e depois, lentamente, permitir-lhes abrir.
4. Preparação do CCA MCAO para a inserção da sutura
- Insira 3 segmentos de fio de náilon de cerca de 4 cm de comprimento no âmbito do CCA. Certifique-se de que o CCA não é distorcido tal como esta iria complicar drasticamente a inserção do fio de sutura.
- No ponto mais baixo possível, feche a sutura inferior usando um nó permanente.
- Amarre a sutura superior, logo abaixo do ICA / ECA ramificação usando um nó corrediço removível.
- Amarre a sutura meio usando um nó corrediço removível, mas mantê-lo aberto. É importante deixar bastante espaço, para não dificultar a inserção de sutura.
- Usando microdissection primavera scissors, realizar uma incisão no CCA entre o fundo e as suturas média. Realizar a incisão 0,2 milímetros, próximo à sutura inferior.
5. Oriente oclusão da artéria cerebral
- Utilizando uma pinça, coloque a sutura MCAO na incisão CCA, guiando-a até o topo. Execute esta etapa rapidamente após o passo 4.5 para prevenir a coagulação e fechamento da abertura CCA. No caso em que a inserção de fio de sutura é bloqueado, usar as pontas de pinça para reabrir a incisão.
- Gentilmente amarrar a sutura meio da parte de sutura silicone MCAO usando um nó corrediço para restringir o fluxo de sangue em torno dele, mas solta o suficiente para permitir que ele se mova livremente.
- Cuidadosamente desfazer a sutura superior, certificando-se que a sutura MCAO não escorregar para fora.
- Inserir o fio de sutura MCAO na ICA por um par de milímetros e, em seguida, voltar a fechar a parte superior de sutura, do mesmo modo como descrito no passo 5.2.
- Orientar a sutura MCAO para a área de oclusão. Indicação de inserção bem sucedida éevidente pela baixa quantidade de refluxo de sangue a partir da incisão CCA e que a marca de prata 9 milímetros está situado entre a incisão e a bifurcação CCA ACI / CEA. A confirmação adicional de oclusão bem sucedida pode ser obtido utilizando métodos de controlo, tais como um sistema de monitorização de fluxo de sangue a laser Doppler 15, 16.
NOTA: Uma gota de 90% do fluxo sanguíneo para a área do cérebro do meio no lado área ocluída indica oclusão bem sucedida. - Após a oclusão bem sucedida, amarrar a sutura médio e superior com força. Se realizar a inserção farsa, não religamento suturas mas pule em vez de imediato para o passo 7.3.
6. Incisão Encerramento e cuidados pós-operatórios
- Tuck nas suturas para a área da incisão.
- Remover afastador ou tecido ganchos e travesseiro.
- área de sutura limpa utilizando solução salina estéril e um cotonete.
- Fechar a incisão usando nylon sutura / agulha e fórceps. <li> Administrar anti-inflamatória (por exemplo, carprofeno 10 mg / kg, sc) e analgésicos (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg / kg sc, duas vezes por dia) medicamentos para aliviar o desconforto pós-operatório. Colocar os ratinhos em uma gaiola colocada sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia e dar acesso ad lábio de água e comida amolecida.
- Monitorizar a recuperação de animais (5-10 min) e para os sinais de acidente vascular cerebral. Eles podem variar de paralisia lateral, leve e circulando a severa contração do flanco contralateral e rolamento. Vários pontos de avaliação são listadas na discussão. Animais que apresentam sinais de dificuldade respiratória ou convulsões graves devem ser sacrificados.
- Dependendo do protocolo de reperfusão de isquemia, deixar o fio de sutura MCAO em lugar de 30 min a 120 min ou mais. Reduzindo o tempo de oclusão previne a mortalidade.
- Para a oclusão permanente, deixar a MCAO sutura no lugar, durante 24 horas, no entanto a taxa de mortalidade significativa é que se espera. Após esse intervalo de tempo, proceder à step 7.
- Se usando o modelo de oclusão permanente, manter os ratos na gaiola até o ponto final. Naquele tempo, retire sutura (passos 7,1-7,8). Este procedimento também pode ser realizada após a eutanásia.
7. A reperfusão
- Anestesiar o animal novamente (siga as instruções em 2.1) e remover suturas de fechamento da ferida.
- Utilizando uma pinça e separadores de tecidos, re-abrir a incisão e expõem a CCA.
- Remova cuidadosamente a sutura superior e puxe na sutura MCAO até que a parte de silicone revestido situa-se no nó meio.
- Refazer o nó no topo da sutura para evitar que o sangue flua passar a sutura (não tem que ser um nó corrediço).
- Cuidadosamente desfazer o nó meio e puxar a sutura após o alto nó, mas mantê-lo dentro do CCA.
- Feche bem o nó superior para bloquear o fluxo de sangue arterial.
- Retire completamente a sutura MCAO e fechar firmemente o nó meio.
- A sutura pode ser MCAOre-utilizada várias vezes. Depois de cada utilização, limpar a sutura com cuidado em 70% de etanol para remover os contaminantes (por exemplo, de sangue ou de tecido), utilizando um gaze estéril. Em seguida, coloque a sutura em uma bolsa de esterilização e esterilizá-lo.
- Repita os passos de 6,1-6,4 e monitorar a recuperação dos animais.
Análise 8. Tissue
- Para monitorar o volume de curso, dissecar o cérebro.
- Eutanásia do rato utilizando um processo de duas etapas. Em primeiro lugar, expor o animal a uma overdose de isoflurano até parar de respirar. Para a coloração TTC, decapitar o mouse imediatamente e proceder à extracção do cérebro. Para o cérebro de corte (por exemplo, para as análises imuno), realização de perfusão através de uma punção cardíaca antes da decapitação.
- Cut-off da cabeça na base do crânio e cortar o couro cabeludo da abertura em gargalo para o topo do crânio até entre os olhos. Com a cabeça exposta, cortar o osso ao longo de ambos os lados a partir da abertura da base do crânioaté a cavidade ocular. Faça este corte ao longo da vasta parte do crânio. Tenha cuidado para não chegar muito profundo com uma tesoura para evitar danos ao cérebro.
- Em seguida, corte o osso entre as duas órbitas.
- Utilizando uma pinça, levante a parte superior do crânio para expor o cérebro. Deve haver apenas uma pequena resistência. Se não levantar facilmente, incisões crânio pode estar incompleta. Retire o cérebro suavemente com uma pinça curva sem corte. O cérebro ainda pode ser anexado por vários nervos. Proceder-se lentamente, removendo anexos ao longo do caminho.
- Colocar o cérebro fresco em uma matriz de cérebro de 1 mm, adicionar um par de gotas de PBS, e o corte ao longo da matriz, utilizando uma lâmina de barbear ou lâmina de criostato.
- Transferir o cérebro para uma placa de 100 mm e adicionar solução de coloração (2% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio [TTC] dissolvidos em PBS) para cobrir o fundo do prato. Utilizando duas pinças, separada de todas as fatias do cérebro (parte da frente virada para baixo) e colocá-los em ordem, na parte inferior do prato.
NOTA: A coloração vai virar tecido viável vermelho, com o tecido não viável restante branco. Aquecer a solução a 37 ° C irá acelerar coloração. Sinais de área de acidente vascular cerebral (branco) pode ser visto como o mais rapidamente 90 min após acidente vascular cerebral e permanecem visíveis durante mais de 7 dias. Imagem deve ser feito juntamente com uma régua para permitir o cálculo do volume de derrame. - Cérebros processam dissecados para seccionamento, imuno-coloração, isolamento de proteínas, ou uma variedade de outros procedimentos de 17, 18, 19.
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Representative Results
O percurso de inserção do fio de sutura oclusão é demonstrado na Figura 1. A sutura MCAO é para ser encaminhado para a área de oclusão, bifurcando na ICA. oclusão bem sucedida do MCA vai levar à lesão tecidual, visível por coloração TTC. A Figura 2 apresenta imagens de manchas de animais com tratamento simulado (Figura 2A) e de um 60 min de reperfusão de isquemia MCAO animais (coloração em 90 minutos ou 24 horas após a oclusão, a Figura 2B). Para determinar o volume de curso, em primeiro lugar calcular a área de derrame para cada secção, usando a régua incluída no procedimento de imagem, subtraindo-se a área não enfartada do lado ipsilateral da área total do lado contralateral. Este cálculo pode ser realizada utilizando software comercial ou software de fonte aberta. Depois, calcular o volume de ejeção para cada fatia levando em consideração que as lâminas são 1 mm de espessura e somar os volumes de AVC for todas as fatias. Este procedimento irá proporcionar o volume total do curso para cada animal, o que pode, então, ser comparadas entre os diferentes grupos de animais e tratamentos. Em média, a 60 min de oclusão seguido de 23 horas de reperfusão, resulta em um volume de curso de cerca de 21 ± 3 mm 3 no tipo selvagem C57BL 6J não tratada / de 15 semanas de idade.
Além de investigar o volume sistólico, imunofluorescência pode ser realizada por uma variedade de alvos, tais como a associada a microtúbulos proteína-2 (MAP2) para danos neuronais (Figura 3A) ou proteína glial fibrilar ácida (GFAP) para astrogliose (Figura 3B). Tais análises permitir ainda mais a análise de progressão e recuperação de acidente vascular cerebral, bem como outros processos envolvidos em danos nos tecidos e reparação de acidente vascular cerebral.
Figura 1: rong> Representação esquemática do cérebro Arterial Physiology. Rota da inserção prossegue MCAO da artéria carótida comum (ACC) para a área de oclusão indicada a azul. A área da cirurgia está localizado na parte inferior da figura (forma oval) e colocação de fio de sutura é indicado por linhas pretas (TS: Topo de sutura para suturas, EM: Média; BS: sutura inferior). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Coloração de secções de cérebro TTC. Painel superior representam coloração típica após a inserção farsa. painéis de média e na baixa foram obtidos após a 60 minutos de MCAO, seguido por 90 minutos ou 24 horas de reperfusão. barra de escala é de 1 mm.
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Figura 3: Imunofluorescência Coloração de rato cérebro após AVC. Na sequência de uma oclusão de 60 minutos, os cérebros foram reperfundidos durante 23 horas, colhidas e processadas para cryosectioning. Utilizando anticorpos para MAP2 (topo) e GFAP (inferior), o tecido foi analisado quanto a lesões neuronais e em qualquer astroglyosis (painéis da esquerda) ou 90 min sham cérebros isquemia-reperfusão (painéis da direita). Imagens apresentadas são combinados de múltiplas imagens feitas por microscopia confocal usando uma objetiva de 10X. barra de escala é de 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Critérios de Avaliação | ||||
| Condição geral | condição do cabelo | comportamento auto-limpeza (0: Nenhum, 2: normal) | ||
| (0: Pior; 2: Normal) | Orelhas | posição ouvidos (Droopy ou elevado) | ||
| Ouvindo (Reactive ou não) | ||||
| condição de olho | posicionamento da pálpebra | |||
| Resposta | ||||
| Postura | Rastejando, inclinando-se, o normal | |||
| actividade espontânea | Inconsciente / nenhum movimento, baixa atividade, a atividade normal | |||
| Neurodeficit | simetria corporal | Quando o mouse é ainda (Nenhum movimento, rastejando, Circular, inclinada parcial, normal) | ||
| (0: Pior; 4: Normal) | Marcha | Nenhum movimento, girando, circulando, andando de um lado, normaeu | ||
| Escalada | comportamento que andam no trajeto angular (critério Mesmas Gait) | |||
| comportamento Circular | Levantamento de animais pela cauda (nenhum movimento, roda, a contratação de um lado, ambos os lados, mas com preferência, normal) | |||
| simetria membro dianteiro | Olhe para agarrar comportamento das patas dianteiras (Sem agarrando em tudo, apenas uma agarra laterais, tanto da garra, mas uma pata rígida, tanto grab mas continuamente solto em primeiro lugar, normal) | |||
| circulando obrigatória | Coloque o mouse em uma superfície plana e empurre no ombro do lado (Sem resposta / movimento, girando, caindo para um lado, inclinando-se com a resistência de empurrar, normal) | |||
| resposta Bigode | Toque suiças um lado no momento (Nenhum movimento de resposta, bigodes somente, virar a cabeça, vire tronco, normal) | |||
| comportamento epiléptica | Comportamento após a súbita ruído ou mudança de luz (Inconsciente, espasmo tônico geral consistente, transitória espasmo tônico geral, transitória espasmo tônico focal, normal) | |||
Tabela 1. Escala de Avaliação dos Rato Estado e Neurodeficit após acidente vascular cerebral isquemia. Adaptado a partir de 1, 2.
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Discussion
A utilização com sucesso do método descrito MCAO é altamente dependente de uma compreensão da anatomia do fluxo sanguíneo cerebral. Desde o posicionamento correto da sutura é difícil discernir devido à falta de pistas visuais diretos, a prática repetida é importante dominar o procedimento antes de usá-lo para estudos de investigação. volume de curso devem ser analisados para garantir resultados consistentes. A adição de um sistema de laser Doppler pode ajudar a determinar o sucesso da oclusão do fluxo de sangue e deve ser utilizado periodicamente para assegurar que o procedimento é feito correctamente. O encaminhamento do fio de sutura a MCAO para a área de oclusão pode ser facilitada através da manipulação da artéria. Para ajudar na orientação a sutura com o MCA, uma vez que acaba de passar o ECA / ICA ramificação, pressione contra a ICA ligeiramente acima da ramificação (2-3 mm) com uma pinça para orientar a sutura para a esquerda / para baixo e impedi-lo de indo na artéria pterigopalatina. Além disso, mover a almofada colocada no passo 3.3 ou PUlling parte inferior nó para cima e para a direita pode ajudar a orientar a artéria para facilitar a inserção. As etapas restantes do protocolo envolver microcirurgia sob lupa e são bastante simples. A taxa de sucesso do método descrito, tal como obtida pelo nosso grupo e relatados por outros, é de cerca de 80 - 90%. No entanto, diversos factores podem influenciar a sobrevivência, incluindo o controlo da temperatura corporal e selecção de sutura 20, 21, 22. A manutenção da sanidade animal a temperatura do corpo durante a cirurgia é importante para melhorar a sobrevivência animal.
Dependendo da experiência do utilizador, este método pode ser empregue de um modo de elevado rendimento para estudar um grande grupo de animais. A significância estatística dos estudos em animais depende do uso de um número suficiente de indivíduos para discernir entre os grupos de tratamento, apesar de variação intrínseca entre sujeitos animais. oprotocolo apresentado permite que tais estudos enquanto recria perto partes do processo da doença.
A vantagem da técnica MCAO é que, ao mesmo tempo que envolve alguns procedimentos cirúrgicos, que não requerem procedimentos altamente invasivos como no modelo craniotomia. Além disso, é altamente reprodutível e a reperfusão é altamente controlável, o que não é possível utilizando os modelos do acidente vascular cerebral embólico endotelina-1 ou. A técnica imita de perto o processo de um acidente vascular cerebral isquémico e humano produz lesão tecidual característica observada nos seres humanos, o que não é o caso para o modelo fototrombose. Em comparação com outras técnicas publicadas, o procedimento MCAO não exige a cauterização da ECA. Isto é uma vantagem uma vez que pode ser combinado com o nosso modelo de AIC de infusão para administrar agentes terapêuticos para o hemisfério afectado após a indução acidente vascular cerebral 23, 24, 25.
Para além da análise de tecido, o comportamento animal pode ser monitorizada para avaliar a gravidade longitudinalmente e recuperação de acidente vascular cerebral. Isso pode ajudar a comparar a recuperação entre os diferentes grupos de tratamento. Várias abordagens têm sido desenvolvidas a fim de avaliar o comportamento. A escala de 5 pontos simples pode ser usado para avaliar déficit neurológico pós acidente vascular cerebral (0: Sem déficit comportamento; 1: Não extensão pata contralateral; 2: Circulando no lado contralateral de infarto; 3: Queda no lado contralateral de infarto; 4: baixo nível de consciência e movimento espontâneo) 5. Além disso, a análise mais detalhada da condição e o comportamento animal pode ser realizado para avaliar a recuperação, conforme descrito na Tabela 1 1, 2.
O procedimento cirúrgico apresentada utiliza um método mecânico para a indução de acidente vascular cerebral, o que limita a utilização desta técnica em estudos sobre a susceptibilidade acidente vascular cerebral e / ouagentes causadores. No entanto, este protocolo pode ser extremamente útil na análise gravidade do AVC, estratégias preventivas ou atenuantes, agravantes e possíveis abordagens terapêuticas pós-acidente vascular cerebral. Comparação entre os grupos de tratamento pode ajudar a identificar o tratamento potencial que pode minimizar os danos acidente vascular cerebral ou acelerar a recuperação. Na verdade, aumentar a recuperação seria de grande importância para ajudar pacientes com AVC.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCAO suture 0.23 mm | Doccol | 702345PK5Re | |
| MCAO suture 0.21 mm | Doccol | 702145PK5Re | |
| Silver pen | staples | 503205 | |
| Anesthesia machine | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine science tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine science tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine science tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine science tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree scintific | SUT-S 104 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherSci | 50-121-8005 | |
| Brain block | Braintree scintific | BS-A 5000C | |
| Cryostat blade | VWR | 89202-606 | |
| Optional: | |||
| Periflux Laser doppler system | Perimed | Periflux 5000 | |
| Monitoring unit | Perimed | PF 5010 - LDPM |
References
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