Introduction
Die Studie von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Schlaganfall, beruht auf der Verwendung von in vivo - Modellen. Um die möglichen Auswirkungen von Ischämie, Arzneimitteltoxizität zu verstehen und / oder Behandlung, besteht ein Bedarf, einen geeigneten, standardisiert, zuverlässig zu verwenden und reproduzierbares Modell der Krankheit, die zwischen den Behandlungsgruppen vergleichende Untersuchungen ermöglicht. In diesem Manuskript, verwenden wir Mäuse, da die Verfügbarkeit einer großen Anzahl von transgenen Mäusen und standardisierte Bewertungsmodelle. Raking Partituren Motor und Verhaltensdefiziten folgenden experimentellen ischämischen Schlaganfall und der folgenden Erholung wurden 1 zu beurteilen , entwickelt, 2.
Mehrere ischämischen Schlaganfall-Modelle stehen zur Verfügung, wie zum Beispiel komplette globale zerebrale Ischämie, unvollständige globale Ischämie, multifokale zerebrale Ischämie und fokaler zerebraler Ischämie. Die letztere Gruppe ist auch die Kategorie des Schlaganfalls am häufigsten bei Patienten. Die Mehrheit der Vorabendnts werden durch die Bildung eines embolischen oder thrombotischen Okklusion an oder nahe der mittleren zerebralen Arterie (MCA) initiiert. Vor dem Hintergrund dieser Parameter präsentierte das Modell ahmt Krankheitsätiologie des menschlichen Schlaganfall und macht erhaltenen Ergebnisse höchst relevant 3. Dennoch hat sich die Übersetzung von Entdeckungen aus Tiermodellen auf die Behandlung von Krankheiten beim Menschen erwiesen schwierig. Bisher ist nur die Verwendung der Thrombolyse Gewebe - Plasminogen - Aktivator wurde für die Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls 4 zugelassen.
Unter Modellen von fokaler zerebraler Ischämie in der Maus, sind cerebri posterior Zirkulation Hubmodell und Hirnvenenthrombose-Modell sehr invasiv, deren Anwendbarkeit verringern und die Bandbreite der Analysen zu beschränken, die durchgeführt werden können. Jedoch können auch andere Techniken, wie zum Beispiel die embolischen Modell, photothrombosis Modell, Endothelin-1-induzierten Schlaganfall-Modell und intraluminalen Naht Arteria cerebri media Okklusion (MCAO) Modell sind für den Einsatz ohne solche Einschränkungen zur Verfügung. Das MCAO-Modell ist eine Technik, die in diesem Protokoll beschrieben. Es bietet eine zuverlässige Methode der fokaler zerebraler Ischämie zu induzieren, die leicht Reperfusion und in einem Hochdurchsatz-Art und Weise durchgeführt werden kann. Es gibt zwei Ansätze für dieses Modell, nämlich die Zea-Longa und Koizumi Methoden. Sie unterscheiden sich etwas in der Art und Weise der Okklusion Naht in das Gefäßsystem eingeführt wird. In der Zea Longa-Technik wird der Faden über die Arteria carotis externa 5 eingesetzt. Die Technik , die hier präsentiert wird vom Koizumi Verfahren modifiziert , in der die okkludierende Naht über die Arteria carotis communis 6 eingesetzt ist.
Das MCAO-Modell wurde erfolgreich verschiedene Ereignisse, die während ischämischen Schlaganfall zu bewerten angewendet. Nach Reperfusion kann Hirnödem mit dem Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke beobachtet entlang werden. Peak-neuronalen Tod wird in der Regel bei 24 Stunden beobachtet; Es können jedoch wiederdreht sich auf das Ausgangsniveau nach 7 Tagen 7. Bei Menschen, Geschlecht und Alter sind wichtige Variablen bei Schlaganfall Ergebnis der Bestimmung, dies auch bei Mäusen und Ratten beobachtet 8, 9, 10. Mehrere Veröffentlichungen haben die MCAO - Modell zu zeigen , die Behandlungseffizienz 11, 12, 13, 14 verwendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren wurden von der University of Miami Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health (NIH) Richtlinien zugelassen. Die Verwendung in sterile Geräte und aseptischer Techniken erforderlich ist.
1. Vorbereiten der Occlusion Suture
- Verwenden einer Naht von 0,21 mm Durchmesser für Mäuse zwischen 20 bis 25 g und 0,23 mm für Mäuse zwischen 25 - 35 g Körpergewicht. Die Wahl der Art von Nähten für die MCAO Verfahrens beruht auf Tiergewicht.
- Mit einem silbernen Stift, markieren Sie die Naht auf 9 mm von der silikonbeschichteten Spitze beginnen. Dies wird als Leitfaden für die Einbaulänge dienen.
2. Vorbereitung für Chirurgie
- Anesthetize Maus mit Isofluran mit Sauerstoff gemischt, ein Labor, Anästhesie-System. Verwenden Sie Isofluran bei Einstellung 5 und Sauerstoffstrom bei 2 auf der kommerziellen Maschine (siehe Werkstoff - Tabelle). Übertragen Sie das Tier auf dem Weg surgery Oberfläche und Aufrechterhaltung der Anästhesie einen Nasenkegel mit (Verwendung von Isofluran Einstellung 1,5-2,5 und Sauerstoffstrom bei 2).
- Stellen Sie sicher, dass die Maus Atemfrequenz liegt bei etwa 1 bis 2 Atmung pro Sekunde ohne Keuchen. Darüber hinaus gewährleisten, dass das Tier nicht Whiskers Stimulation nicht aufweist Reaktion und Pedal Reflex (toe Prise). Überwachen Sie die Atemfrequenz und Aufwand während der Operation, mindestens alle 5 Minuten.
- Geben Sie einen Tropfen ophthalmische Schmiermittel auf jedes Auge einen sterilen Tupfer, sie zu verhindern, dass während des Verfahrens zu trocknen. Alternativ gelten ophthalmischen Salbe in das Auge aus einer sterilen pharmazeutischen Röhre.
- Flip das Tier auf den Rücken und rasieren den Schnittbereich. Anschließend desinfizieren gründlich den OP-Bereich 70% Ethanol, gefolgt von Chlorhexidin, und die endgültige Tupfer mit 70% Ethanol. Legen Sie das Tier an einem warmen chirurgischen Oberfläche unter einem Stereomikroskop.
3. Dissektion der Arteria carotis communis und interne / External Branching
- Mit chirurgische Schere und Pinzette, führen Sie einen flachen Mittelschnitt im Nacken, von oberhalb des Brustbeins bis unterhalb des Kiefers (ca. 3-4 cm). Operationstuch sollte rund um den OP-Bereich platziert werden Instrumente zu verhindern, dass in Kontakt mit nicht sterilen Oberflächen kommen. Das Operationstuch wurde in der aktuellen Video weggelassen Filmen zu unterstützen.
- Mit einer Pinzette vorsichtig getrennte Fett- und Bindegewebe, um die Luftröhre aus. Gewebe sollte leicht und natürlich auf beiden Seiten zu trennen.
- Legen Sie ein Kissen (rundes Objekt, etwa 0,5 cm im Durchmesser) auf der Rückseite des Halses der Mäuse den Hals zu verlängern, das weiterhin den Bereich für die Operation auszusetzen.
- Öffnen Sie den Einschnitt entweder mit einem Geweberetraktor oder Haken.
- Auf der linken Seite der Trachea des Tieres, tweeze sorgfältig das Bindegewebe neben der linken Arteria carotis communis (CCA) zu belichten. Achten Sie darauf, nicht die Nerven zu schädigen und die wichtigsten mit dem CCA gebündelten Adern.
- Fortsetzung der CCA aussetzt, vorsichtig von darunterliegenden Gewebe zu lösen, und setzen die oben "Y" Verzweigung der inneren Hirnarterie (ICA) und externe Arteria cerebri (ECA). Zur Unterstützung des CCA in Abnehmen, legen Sie die gebogenen Pinzette unter der CCA das Bindegewebe zu durchdringen und dann langsam erlauben , sie zu öffnen.
4. Vorbereitung der CCA für die MCAO Suture Insertion
- Legen Sie drei Segmente von Nylonfaden von etwa 4 cm in der Länge unter der CCA. Stellen Sie sicher, dass der CCA nicht verdreht ist, da dies drastisch um das Einsetzen des Naht erschweren würde.
- Am tiefsten Punkt möglich, schließen Sie die untere Naht einen permanenten Knoten.
- Binden Sie die obere Naht knapp unter dem ICA / ECA Verzweigung einen herausnehmbaren Schlupf Knoten.
- Binden Sie die mittlere Naht einen abnehmbaren Laufknoten verwenden, aber halten Sie es weit offen. Es ist wichtig, viel Platz zu verlassen, da nicht Naht Einsetzen zu verhindern.
- Mit microdissection Frühjahr scissors, führen Sie einen Einschnitt in der CCA zwischen dem unteren und mittleren Nähten. Führen Sie die 0,2 mm Einschnitt nahe dem Boden Naht.
5. Middle Cerebral Artery Occlusion
- Mit einer Pinzette, legen Sie die MCAO Naht in die CCA Einschnitt, Führungs es bis an die Spitze. Führen Sie diesen Schritt schnell nach dem Schritt 4,5 bis Blutgerinnung und Schließen der CCA Öffnung verhindern. Für den Fall, dass Naht Einsetzen blockiert ist, verwenden Sie die Spitzen der Zange den Schnitt wieder zu öffnen.
- binden vorsichtig die mittlere Naht auf der MCAO Nahtsilikonteil einen Belegknoten mit den Blutfluss um es zu beschränken, aber locker genug, um es zu ermöglichen, sich frei zu bewegen.
- Vorsichtig lösen Sie die obere Naht, um sicherzustellen, dass die MCAO Naht nicht herausrutschen.
- Legen Sie die MCAO Naht in der ICA um ein paar Millimeter und dann die obere Naht wieder geschlossen, in der gleichen Weise wie in Schritt 5.2 beschrieben.
- Führen Sie die MCAO Naht an der Okklusion Bereich. Anzeige der erfolgreichen Insertionoffensichtlich durch die geringe Menge an Blutrückfluss aus dem CCA Schnitt und dass die Silber-9-mm-Markierung wird zwischen dem CCA Einschnitt und der ICA / ECA Bifurkation entfernt. Eine weitere Bestätigung der erfolgreichen Okklusion kann Überwachungsverfahren unter Verwendung von beispielsweise einem Laser - Doppler - Blutströmungsüberwachungssystem 15, 16 erhalten werden.
HINWEIS: Ein Tropfen in 90% der den Blutfluss zum Gehirn mittleren Bereich auf der okkludierte Bereich Seite zeigt die erfolgreiche Okklusion. - Nach dem erfolgreichen Verschluss, binden Sie die mittlere und obere Naht fest nach unten. Wenn Schein Einfügung ausgeführt werden, dürfen nicht Nähte wieder zu verschließen, sondern sofort überspringen 7.3 zu treten.
6. Incision Closing und postoperative Pflege
- Tuck in den Nähten in den Schnittbereich.
- Entfernen Aufroller oder Gewebehaken und Kissen.
- Saubere Nahtbereich mit einer sterilen Kochsalzlösung und mit einem Wattestäbchen.
- Schließen Sie den Schnitt mit Nylonfaden / Nadel und Pinzette. <li> Verwalten entzündungshemmende (zB Carprofen 10 mg / kg, sc) und analgetische ( zum Beispiel Buprenorphin 0,1 mg / kg sc, zweimal täglich) Drogen postoperative Beschwerden zu lindern. Legen Sie die Mäuse in einem Käfig auf einem Heizkissen platziert Hypothermie zu verhindern und ad labium Zugang zu Wasser und erweicht Nahrung geben.
- Überwachen Sie die Wiederherstellung von Tieren (5 - 10 min) und auf Anzeichen von Schlaganfall. Sie können von einer leichten seitlichen Lähmung variieren und kreisen zu starken Kontraktion der Gegenflanke und Rollen. Mehrere Bewertungspunkte werden in der Diskussion aufgeführt. Tiere Anzeichen von Atemnot oder schwere Anfälle Anzeige sollte eingeschläfert werden.
- Je nach Ischämie Reperfusion Protokoll, lassen Sie die MCAO Naht anstelle von 30 min bis 120 min oder mehr. Okklusionszeit Reduzierung verhindert Mortalität.
- Für einen dauerhaften Verschluss, lassen Sie die MCAO Naht an Ort und Stelle für 24 Stunden, jedoch signifikante Mortalitätsrate zu erwarten ist. Nach dieser Zeit außer Kraft treten, gehen steS. 7.
- Bei der Verwendung von permanenten Okklusion Modell, halten Mäuse im Käfig bis Endpunkt. Zu diesem Zeitpunkt entfernen Naht (Schritte 7,1-7,8). Dieses Verfahren kann auch nach der Euthanasie durchgeführt werden.
7. Reperfusion
- Anesthetize das Tier wieder (folgen Sie den Anweisungen in 2.1) und Wundverschluss Nähte entfernen.
- Mit einer Pinzette und Gewebe-Separatoren, die Inzision wieder öffnen und die CCA aussetzen.
- Sie vorsichtig die obere Naht entfernen und vorsichtig auf die MCAO Naht ziehen, bis das Silikon beschichtete Teil in der Mitte Knoten befindet.
- Wiederholen Sie die oben Knoten auf der Naht Blut zu verhindern, dass das Fließen des Naht passieren (es muss nicht ein Belegknoten sein).
- Vorsichtig den mittleren Knoten lösen und die Naht nach dem oberen Knoten ziehen, aber es innerhalb des CCA halten.
- Dicht schließen Sie die obere Knoten Arterie den Blutfluss zu blockieren.
- Ziehen Sie vollständig die MCAO Naht und schließen dicht den mittleren Knoten.
- Die MCAO Naht kannwiederverwendet mehrmals. Nach jedem Gebrauch reinigen Sie die Naht vorsichtig in 70% Ethanol Verunreinigungen (zB Blut oder Gewebe) mit einer sterilen Gaze zu entfernen. Danach legen Sie die Naht in einem Sterilisator Beutel und sterilisieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,4 und Tier Erholung zu überwachen.
8. Gewebeanalyse
- Zur Überwachung des Schlagvolumens, sezieren aus dem Gehirn.
- Euthanize die Maus einen zweistufigen Prozess. Zunächst aussetzen, das Tier zu einer Überdosierung von Isofluran bis Atemstillstand. Für TTC-Färbung, enthaupten die Maus sofort und fahren Sie mit Gehirn-Extraktion. Für Hirnschnitt (zB für Immunofärbung Analysen), die Perfusion über eine Herzpunktion vor der Enthauptung zuführen.
- den Kopf an der Basis des Schädels und schneiden Sie die Kopfhaut von der Halsöffnung an der Oberseite des Schädels bis zwischen den Augen Cut-off. Mit dem Schädel ausgesetzt, schneiden Sie den Knochen auf beiden Seiten von der Schädelbasis Öffnung beginnenbis zur Augenhöhle. Machen Sie diesen Schnitt entlang der breiten Teil des Schädels. Seien Sie vorsichtig, nicht zu tief zu erreichen mit einer Schere zu schädigen das Gehirn zu verhindern.
- Danach schneiden Sie den Knochen zwischen den beiden Augenhöhlen.
- Mit einer Pinzette, heben Sie die Oberseite des Schädels bis das Gehirn aus. Es sollte nur ein geringer Widerstand sein. Wenn es nicht leicht anheben, Schädel Einschnitte unvollständig sein kann. Hebeln Sie das Gehirn sanft stumpf gebogenen Pinzette. Das Gehirn kann noch durch mehrere Nerven angebracht werden. Fahren Sie langsam, Anlagen auf dem Weg zu entfernen.
- Legen Sie die frische Gehirn in einem 1 mm Gehirn Matrix, fügen Sie ein paar Tropfen PBS, und in Scheiben schneiden entlang der Matrix mit einer Rasierklinge oder Kryostaten Klinge.
- Übertragen Sie das Gehirn auf eine 100-mm-Schale und fügen Färbelösung (2% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid [TTC], gelöst in PBS), um den Boden der Schale zu bedecken. Mit Hilfe von zwei Zangen, trennen Sie alle Gehirnscheiben (vorne nach unten) und legen Sie sie an der Unterseite der Schale um.
HINWEIS: Die Färbung wird sich lebensfähiges Gewebe rot, mit nicht lebensfähiges Gewebe verbleibenden weißen. Erwärmen der Lösung auf 37 ° C beschleunigt Färbung. Anzeichen für einen Schlaganfall Bereich (weiß) so schnell wie 90 Minuten nach Schlaganfall und bleiben für mehr als 7 Tage sichtbar zu sehen ist. Imaging sollte zusammen mit einem Lineal erfolgen Berechnung des Schlagvolumens zu ermöglichen. - Prozess seziert Gehirne für das Schneiden, Immunfärbung, Proteinisolierung oder eine Vielzahl von anderen Verfahren 17, 18, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Einfügungs Route für die Okklusion Naht wird in Abbildung 1 gezeigt. Die MCAO Naht ist in die Okklusion Bereich geführt werden, in der ICA-gegabelt. Erfolgreiche Verschluss der MCA wird auf Gewebeverletzung, sichtbar durch TTC-Färbung führen. Abbildung 2 zeigt Bilder der Färbung von Schein - behandelten Tier (2A) und von einer 60 min MCAO Ischämie Reperfusion Tier (Färbung bei 90 min oder 24 Stunden nach der Okklusion, 2B). Um das Schlagvolumen zu bestimmen, berechnen zuerst den Hubbereich für jeden Abschnitt, mit dem Lineal in dem Bildgebungsverfahren einbezogen, durch die Nicht-Infarkt-Bereich der ipsilateralen Seite von der Gesamtfläche der Gegenseite abgezogen wird. Diese Berechnung kann unter Verwendung von kommerzieller Software oder Open-Source-Software durchgeführt werden. Danach Schlagvolumen für jede Scheibe unter Berücksichtigung berechnen, dass Dias 1 mm dick sind und fassen die Hubvolumen for alle Scheiben. Durch dieses Verfahren wird das gesamte Hubvolumen für jedes Tier zur Verfügung stellen, die dann zwischen den verschiedenen Tiergruppen und Behandlungen verglichen werden. Im Durchschnitt eine 60 min Okklusion nach 23 h Reperfusion resultiert in einem Hubvolumen von etwa 21 ± 3 mm 3 in Wildtyp nicht-behandelten C57BL / 6J - Mäuse 15 Wochen alt gefolgt.
Neben Hubvolumen untersuchen kann Immunofluoreszenz für eine Vielzahl von Zielen durchgeführt werden, wie Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2 (MAP2) für neuronale Schädigung (3A) oder glial fibrillary acidic protein (GFAP) für Astrogliose (3B). Solche Analysen weiter die Analyse von Schlaganfall Progression und Erholung sowie andere Prozesse in der Schlaganfall-Gewebeschäden und Reparatur beteiligt ermöglichen.
Abbildung 1: rong> Schematische Darstellung der Gehirn Arterielle Physiologie. Route der MCAO Insertion Erlös aus der Arteria carotis communis (CCA) an die Okklusion Bereich in blau angegeben. (:;: Mittelnaht; BS: Bodennaht MS Top Naht TS) Der OP-Bereich befindet sich am unteren Ende der Figur (ovale Form) und Nahtplatzierung befindet sich durch schwarze Linien angedeutet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: TTC - Färbung von Gehirnschnitten. Top-Panel stellen typische Färbung folgende Schein Insertion. um 90 Minuten oder 24 Stunden Reperfusion mittleren und unteren Platten wurden nach einer 60-minütigen MCAO, gefolgt erhalten. Maßstabsbalken beträgt 1 mm.
3 "src =" / files / ftp_upload / 54805 / 54805fig3.jpg "/>
Abbildung 3: Immunfluoreszenzanfärbung von Mäusehirn nach Schlaganfall. Nach einer 60-minütigen Okklusion wurden Gehirne für 23 Stunden, geerntet und verarbeitet für Kryoschneiden Reperfusion. Mit Antikörpern gegen MAP2 (oben) und GFAP (unten) wurde das Gewebe für die neuronale Verletzungen analysiert und astroglyosis entweder Schein (linke Felder) oder 90 min Ischämie-Reperfusion Gehirne (rechte Felder). Bilder präsentiert werden aus mehreren Bildern kombiniert durch konfokale Mikroskopie genommen ein 10X-Objektiv verwendet wird. Maßstabsbalken beträgt 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Bewertungskriterien | ||||
| Allgemeinzustand | Haar Zustand | Selbstreinigungsverhalten (0: keine; 2: normal) | ||
| (0: Worst; 2: Normal) | Ohren | Ears Position (Droopy oder angehoben) | ||
| Hearing (Reactive oder nicht) | ||||
| Augenzustand | Augenlid Position | |||
| Antwort | ||||
| Haltung | Krabbeln, stützte sich, normal | |||
| Spontane Aktivität | Bewusstlos / keine Bewegung, niedrige Aktivität, normale Aktivität | |||
| Neurodeficit | Körpersymmetrie | Wenn die Maus ist immer noch (keine Bewegung, kriechen, Umkreisen, teilweise schiefe, normal) | ||
| (0: Worst; 4: Normal) | Gangart | Keine Bewegung, drehen, kreisen, auf der einen Seite zu Fuß, normal | ||
| Kletterei | Wanderverhalten auf angewinkelt Pfad (Kriterien wie Gait) | |||
| Umkreisen Verhalten | Lifting Tier am Schwanz (keine Bewegung, wirbelnden, Contracting auf der einen Seite, beide Seiten aber bevorzugt, normal) | |||
| Vorderschenkel Symmetrie | Schauen Sie sich Grabbing Verhalten von Vorderpfoten (No greifen überhaupt, nur eine Seite gewinnen, beide greifen aber eine Pfote starr, beide greifen aber ein ständig lose erste, normal) | |||
| Pflicht Umkreisen | Setzen Sie die Maus auf eine ebene Fläche und drücken Sie auf die Schulter von der Seite (keine Antwort / Bewegung, drehen, fallen auf der einen Seite, stützte sich mit Widerstand zu drücken, normal) | |||
| Whisker Antwort | Berühren Sie Whiskers der einen Seite zu der Zeit (keine Antwort, Whiskers Bewegung nur, drehen Sie den Kopf, drehen Stamm, normal) | |||
| Epileptische Verhalten | Verhalten nach plötzlichen Lärm oder Lichtwechsel (Bewusstlos, konsistente allgemeines Tonikum Krampf, vorübergehende allgemeines Tonikum Krampf, transienter fokaler Tonikum Krampf, normal) | |||
Tabelle 1. Maßstab für die Beurteilung von Maus - Zustand und Neurodeficit Nach Ischemia Stroke. Angepasst von 1, 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die erfolgreiche Anwendung des beschriebenen Verfahrens MCAO ist stark abhängig von einem Verständnis der Hirndurchblutung Anatomie. Da die korrekte Platzierung der Naht ist schwer aufgrund des fehlenden direkten visuelle Hinweise zu erkennen, wird wiederholt der Praxis wichtig, das Verfahren zu meistern, bevor es für den Untersuchungen verwendet. Hubvolumen sollten konsistente Ergebnisse zu gewährleisten, werden analysiert. Die Zugabe eines Laser-Doppler-System kann dazu beitragen, die erfolgreiche Okklusion des Blutflusses zu bestimmen, und sollte periodisch verwendet werden, um sicherzustellen, daß das Verfahren korrekt durchgeführt wird. Verlegung des MCAO Naht an der Okklusion Bereich kann durch Manipulation der Arterie erleichtert werden. Um die Naht zu dem MCA in Führungs, sobald es hat gerade die ECA / ICA Verzweigungs, drücken gegen die ICA geringfügig oberhalb der Verzweigung (2-3 mm) mit einer Zange um die Naht nach links zu lenken / unten und verhindern, dass es geht in die pterygopalatinum Arterie. Darüber hinaus das Kissen in Schritt 3.3 oder PU platziert bewegenBefüllungs Knoten die von unten nach oben und nach rechts kann bei der Ausrichtung der Arterie helfen, das Einführen zu erleichtern. Die verbleibenden Schritte des Protokolls umfassen Mikrochirurgie unter Stereomikroskop und sind relativ einfach. Die Erfolgsrate der Methode beschrieben, wie unsere Gruppe und berichtet von anderen erhalten, ist von rund 80 bis 90%. Dennoch können mehrere Faktoren das Überleben beeinflussen, einschließlich der Kontrolle der Körpertemperatur und der Fadenauswahl 20, 21, 22. Die Erhaltung der Tierkörpertemperatur während der Operation ist wichtig, das Überleben der Tiere zu verbessern.
In Abhängigkeit von der Erfahrung des Benutzers kann dieses Verfahren in einem Hochdurchsatz Weise eingesetzt werden, um eine große Gruppe von Tieren zu untersuchen. Die statistische Signifikanz von tierexperimentellen Studien hängt von der Verwendung von ausreichenden Anzahl von Probanden zwischen den Behandlungsgruppen trotz intrinsischen Unterschiede zwischen den Versuchstieren zu erkennen. DasProtokoll vorgestellt ermöglicht solche Studien, während eng Teile des Krankheitsprozesses neu zu erstellen.
Der Vorteil der MCAO Technik ist, dass, während es einige chirurgische Verfahren beinhaltet, ist es nicht sehr invasive Verfahren erfordert, wie in der Kraniotomie Modell. Darüber hinaus ist es in hohem Maße reproduzierbar und der Reperfusion ist höchst kontrollierbar, was nicht möglich ist, die Endothelin-1 oder der embolischen Schlaganfall Modelle. Die Technik ahmt den Prozess eines menschlichen ischämischem Schlaganfall und produziert Verletzungen charakteristische Gewebe beim Menschen gesehen, was nicht der Fall für die photothrombosis Modell. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Techniken, wird der MCAO Verfahren nicht die Kauterisation des ECA erfordern. Dies ist ein Vorteil , da sie mit unserer ICA Infusionsmodell kombiniert werden können therapeutische Mittel an den betroffenen Hemisphäre nach Schlaganfall Induktions 23, 24, 25 zu liefern.
Zusätzlich zur Gewebeanalyse kann das Verhalten der Tiere in Längsrichtung der Schlaganfallschwere und Erholung zu bewerten überwacht werden. Dies kann helfen, Erholung zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen zu vergleichen. Mehrere Ansätze wurden, um zu bewerten Verhalten entwickelt. Eine einfache 5-Punkte-Skala kann verwendet werden, um neurologische Defizit nach Schlaganfall (0 bewerten: Nein Verhalten Defizit; 1: Keine kontralateralen forepaw Erweiterung; 2: Einkreisen auf der Gegenseite des Infarkts, 3: Fallen auf der Gegenseite der Infarkt; 4: Niedrige Bewusstseinsniveau und spontane Bewegung) 5. Darüber hinaus kann in eingehenden Analyse der Tier Zustand und das Verhalten durchgeführt werden Erholung zu bewerten als 2 in Tabelle 1 1 beschrieben.
Das chirurgische Verfahren vorgestellt verwendet ein mechanisches Verfahren zur Induktion von Schlaganfall, die in Studien über Schlaganfall Suszeptibilität Nutzung dieser Technik begrenzt und / oderErreger. Allerdings kann dieses Protokoll bemerkenswert nützlich sein bei der Analyse Schlaganfall Schwere, deren Vermeidung oder Begrenzung Strategien, erschwerende Faktoren und mögliche Therapieansätze nach Schlaganfall. Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen können bei der Identifizierung von potenziellen Behandlung helfen, die Schlaganfall Schaden minimieren können oder Erholung zu beschleunigen. Tatsächlich Erholung verbessern helfen Schlaganfall-Patienten von großer Bedeutung wäre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCAO suture 0.23 mm | Doccol | 702345PK5Re | |
| MCAO suture 0.21 mm | Doccol | 702145PK5Re | |
| Silver pen | staples | 503205 | |
| Anesthesia machine | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine science tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine science tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine science tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine science tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree scintific | SUT-S 104 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherSci | 50-121-8005 | |
| Brain block | Braintree scintific | BS-A 5000C | |
| Cryostat blade | VWR | 89202-606 | |
| Optional: | |||
| Periflux Laser doppler system | Perimed | Periflux 5000 | |
| Monitoring unit | Perimed | PF 5010 - LDPM |
References
- Cuomo, O., et al. Antithrombin reduces ischemic volume, ameliorates neurologic deficits, and prolongs animal survival in both transient and permanent focal ischemia. Stroke. 38 (12), 3272-3279 (2007).
- Wauquier, A., Melis, W., Janssen, P. A. Long-term neurological assessment of the post-resuscitative effects of flunarizine, verapamil and nimodipine in a new model of global complete ischaemia. Neuropharmacology. 28 (8), 837-846 (1989).
- Liu, F., McCullough, L. D. Middle cerebral artery occlusion model in rodents: methods and potential pitfalls. J Biomed Biotechnol. 2011, 464701 (2011).
- Chiu, D., et al. Intravenous tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke: feasibility, safety, and efficacy in the first year of clinical practice. Stroke. 29 (1), 18-22 (1998).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. TTC, fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
- Liu, F., Yuan, R., Benashski, S. E., McCullough, L. D. Changes in experimental stroke outcome across the life span. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (4), 792-802 (2009).
- Wang, R. Y., Wang, P. S., Yang, Y. R. Effect of age in rats following middle cerebral artery occlusion. Gerontology. 49 (1), 27-32 (2003).
- Baskerville, T. A., Macrae, I. M., Holmes, W. M., McCabe, C. The influence of gender on 'tissue at risk' in acute stroke: A diffusion-weighted magnetic resonance imaging study in a rat model of focal cerebral ischaemia. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (2), 381-386 (2016).
- Cai, Q., et al. Co-transplantation of hippocampal neural stem cells and astrocytes and microvascular endothelial cells improve the memory in ischemic stroke rat. Int J Clin Exp Med. 8 (8), 13109-13117 (2015).
- Cheng, Y., et al. Intravenously delivered neural stem cells migrate into ischemic brain, differentiate and improve functional recovery after transient ischemic stroke in adult rats. Int J Clin Exp Pathol. 8 (3), 2928-2936 (2015).
- Nagai, N., et al. Intravenous Administration of Cilostazol Nanoparticles Ameliorates Acute Ischemic Stroke in a Cerebral Ischemia/Reperfusion-Induced Injury Model. Int J Mol Sci. 16 (12), 29329-29344 (2015).
- Liu, Y., et al. Intravenous PEP-1-GDNF is protective after focal cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 617, 150-155 (2016).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. J Vasc Interv Neurol. 8 (3), 74-82 (2015).
- Tajima, Y., et al. Reproducibility of measuring cerebral blood flow by laser-Doppler flowmetry in mice. Front Biosci (Elite Ed). 6, 62-68 (2014).
- Fang, M., et al. Scutellarin regulates microglia-mediated TNC1 astrocytic reaction and astrogliosis in cerebral ischemia in the adult rats. BMC Neurosci. 16, 84 (2015).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. J Vis Exp. (99), e52293 (2015).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. J Neurosci Methods. 187 (1), 84-89 (2010).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: the role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Res Bull. 101, 12-17 (2014).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J Exp Stroke Transl Med. 2 (2), 2-27 (2009).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970 (1-2), 131-139 (2003).
- Wolff, G., Davidson, S. J., Wrobel, J. K., Toborek, M. Exercise maintains blood-brain barrier integrity during early stages of brain metastasis formation. Biochem Biophys Res Commun. 463 (4), 811-817 (2015).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
