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Developmental Biology

Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

doi: 10.3791/54811 Published: December 3, 2016

Introduction

Finite - Elemente (FE) Modellierung ist ein Engineering - Technik , die rechnerisch berechnen kann und ordnen Sie die Größe und Lage der Stämme auf einer Struktur wirken 1. Das Modell besteht aus der 3D-Struktur, die von einem Netz von "Finite Elemente" dargestellt, und das Endergebnis der Analyse wird durch eine Anzahl von Faktoren ab, einschließlich der Struktur und der Anzahl der Elemente in dem Gitter, die Größe und die Position der mechanischen geregelt Lasten und die Materialeigenschaften. Materialeigenschaften beschreiben bestimmte Aspekte des Verhaltens eines Materials unter einer bestimmten Art der Last; Elastizitätsmodul (E) beschreibt die Elastizität des Materials, während das Poisson-Verhältnis des proportionalen Abnahme der Breite des Materials zu seiner Länge beschreibt, wenn eine Probe gestreckt wird. FE-Modellierung verwendet werden, um eine Vielzahl von Variablen auf dem Modell unter Berücksichtigung der einzigartigen Eingangsdaten über die Struktur einschließlich Verschiebung, Stress, Druck und Dehnung wirkend zu berechnen '; S Form, Lage und Größe der Lasten und die spezifischen Materialeigenschaften.

FE - Modellierung wird in der Technik 2 und zunehmend auch für orthopädische 3 und paläontologische Anwendungen 4 weit verbreitet. In der Entwicklung sind als Anregung in vielen Zellen zu biomechanischen Kräfte bekannt wirken zu aktivieren Zellantworten 5-8 und es ist nützlich , sowohl die relativen Positionen und Grßen der mechanische Reize innerhalb der Entwicklungsorgansysteme vorherzusagen, wurde jedoch noch FE Modellierung wenig gebraucht für Zebrabärblingentwicklung.

Sowohl Knorpel und Knochen wurden mechanosensitive Materialien erwiesen. Beispielsweise in vitro Kompression gefunden wurde chondrogene Wege zu aktivieren, während die Spannung für die Knochenbildung 9 notwendig erwiesen hat. FE-Analyse (FEA) wurde ausgebeutet Stämme wirken auf biologische Proben zu modellieren, einschließlich derjenigen, auf die Skelettelemente während Knochen wirkenden formationen 10. Andere Entwicklungsanwendungen umfassen seine Verwendung die Form eines gemeinsamen vorherzusagen , nachdem es 11,12 theoretischen biomechanischen Kräften ausgesetzt wurde und das Muster der Stämme 8 vorhanden während Küken Kniegelenk Morphogenese zu zeigen.

Dieses Protokoll wird auf die gemeinsame Nutzung der Erfahrungen soll der Erzeugung von 3-dimensionalen Oberflächen, Netze und Finite-Elemente-Modelle von konfokalen Bildern, mit denen die Mechanik der Entwicklung von Geweben zu verstehen. Wir zeigen Ihnen auch Möglichkeiten, die FE - Modelle Validierung obwohl echte gemeinsame Verschiebungsinformation in vivo zu erfassen. Während wir die Zebrabärbling Kiefer als ein Beispiel die gleichen Techniken verwenden könnte auf jedem kleinen biologischen System verwendet werden, für die 3D-Informationen über die Struktur des Muskel-Skelett-System kann durch konfokale oder Multiphotonen-Imaging erhalten werden.

Protocol

Alle Schritte innerhalb des Protokolls folgen der University of Bristol Tierpflege und Tierschutz-Richtlinien und die des britischen Innenministeriums.

1. Visualisierung von Muskel-Skelett-Anatomie

HINWEIS: Um die Form der Skelettelemente visualisieren, Muskel zu quantifizieren und die genaue Platzierung der Muskelansätze, immunostain (Abschnitt 1.1) Fisch im entsprechenden Alter für Skelett-Myosin (die Muskel zeigt) zu identifizieren und Typ-II-Kollagen (zu visualisieren Knorpel). Alternativ visualisieren die Muskel - Skelett - Anatomie transgenen fluoreszierenden Reporterlinien wie die Kollagen a1 Reporter COL2A1 mit: mCherry 13,14 Knorpel und die langsame Myosin schwere Kette Reporter smyhc sichtbar zu machen: 15 GFP die Position der Muskelansätze (Abschnitt 1.2) zu visualisieren.

Alternative Linien, die Knorpel und Muskeln markieren könnte genauso gut funktionieren.

  1. Fluoreszierende Immunostaining
    1. Fix Larve in überschüssigem 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 Stunde. Waschen in PBS mit 0,1% Tween 20 (PBT) und entwässern jeweils in 50% Methanol (MeOH) in PBT und 100% MeOH für 5 min.
      Achtung: PFA ist giftig und sollte in Übereinstimmung mit dem Material Sicherheitsdatenblatt behandelt werden.
      HINWEIS: Larve kann in 100% Methanol gelagert werden, bis sie benötigt.
    2. Rehydrate Larve in 50% MeOH in PBT für 5 min. Waschen in PBT für 5 min.
    3. Permeabilisierung Larve in 0,25% Trypsin in PBT auf Eis für 5-6 min. in 4x PBT Waschen für jeweils 5 Minuten.
    4. Block für 2-3 h in 5% Serum in PBT.
    5. Inkubieren Larve in der empfohlenen Verdünnung von Kaninchen-Anti-Typ-2-Kollagen und Maus-anti-Myosin-Antikörper in 5% Serum in PBT für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
      HINWEIS: Die empfohlene Verdünnungsbereich ist in der Regel auf dem Blatt Antikörper Daten. Wählen Antikörper, die gegen verschiedene Arten angehoben sind miteinander und auch diffemieten, um das Gewebe.
    6. Waschen Sie Larve 6x für 15 Minuten in PBT.
    7. Block für 1-2 h in 5% Serum in PBT.
    8. Inkubieren in Sekundärantikörper im Dunkeln. Verwenden fluoreszenzmarkierten Anti-Maus (550) und Anti-Kaninchen (488) Sekundärantikörper bei einer geeigneten Verdünnung in 5% Serum und PBT für den spezifischen Antikörper.
    9. Wasch 6X für jeweils 10 Minuten in PBT und Bild auf einem Mikroskop 10X konfokalen so schnell wie möglich.
  2. Imaging Muskel - Skelett - Geometrie
    1. Montieren Sie die Larven ventral auf einem Deckglas in lauwarmem 0,3-0,5% mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose in Danieau-Lösung 16.
      HINWEIS: Transgene Fische müssen in 0,02% MS222 (Tricaine Methansulfonat, pH 7) vor der Montage und während der Bildgebung sediert werden.
    2. Nehmen Sie eine konfokale Bildstapel aus der Region von Interesse mit dem 10fach Objektivlinse und das etwa 2,5-fache Digitalzoom. Bereiten Sie Bilder des grünen und roten Kanal mit der 488 nm und 561 nm-Laser sind. Bild mit einer 512 x 512 Pixel Auflösung mit einem Intervall zwischen z-Ebene von 1,3 um und 3 Linie Durchschnitt. Der resultierende Stapel wird von etwa 100 z Scheiben umfassen.
    3. Exportieren Sie die Daten als TIFF-Serie. Maximale Projektionen der Muskel und des Knorpels Elemente aus einer 5dpf Zebrabärbling Larven sind in Abbildung 1 dargestellt.

2. Erstellen eines 3D-Oberflächen

  1. Wählen Sie einen repräsentativen Datensatz für jeden Zeitpunkt auf 3, 4 und 5 dpf (wählen Sie nach Visualisierung mehrerer Proben).
  2. Öffnen Sie 3-dimensionalen TIFF-Stapel und wählen Sie alle Kanäle in der Analyse-Software. Rechtsklick auf den Knorpel Kanal und wählen Sie die Bildfilter und Glättung: Gaussian (2B).
  3. In Projektansicht rechts auf gefilterte Bild klicken und wählen Sie "Bildsegmentierung" und dann "bearbeiten neues Label '. Erstellen Sie ein neues Etikett für jedes Material, das heißt, Knorpel und junkt. Wählen Sie den Knorpelbereich des Bildes (2C, weißes Signal, lila Umriss) mit dem Zauberstab - Werkzeug. Verwenden Sie das Pinsel-Werkzeug Lärm von den Umrissen zu entfernen.
    HINWEIS: Wenn Zauberstab-Werkzeug, klicken Sie auf "Alle Scheiben '.
  4. Wählen Sie den Verbindungsbereich mit dem Pinsel - Werkzeug und weisen auf eine gemeinsame Komponente (2C, blau umrandet)
  5. Glatte mehrere Scheiben auf einmal durch die Segmentierung im oberen Menü und glatt Auswahl von Etiketten. Rechtsklick auf das Bild und wählen Sie erzeugen Oberfläche eine 3D - Oberfläche des Bauteils (2D) machen zu erzeugen.
  6. Klicken Sie auf die Oberfläche und Speichern von Daten als hmascii Datei für den Import in kämmenden Software.

3. Berechnung der Muskelkräfte zu sein, in dem FE-Modell

  1. Zählen Sie die Anzahl der Muskelfasern von konfokalen Bildern von smyhc: GFP transgenen Zebrabärbling (1A, Pfeilspitze, 1C) und messen Sie den Durchmessereter der Fasern ihre Querschnittsfläche (& pgr; r 2) zu berechnen.
  2. Identifizieren geeigneter Kraft pro Flächeneinheit Muskel aus der Literatur. Die maximale Muskelkraft erzeugt pro Flächeneinheit für Larven Zebrabärbling Skelettmuskulatur (40 nN / & mgr; m 2) wurden 17 verwendet.
  3. Berechnen der Kräfte für jeden anatomischen Muskelgruppe durch die Anzahl der Fasern und deren Multiplikation Fläche durch die Kraft pro Flächeneinheit. Siehe Tabelle 1.

4. Erstellen eines Netz

  1. Importieren Sie das 3D-Modell erzeugt in Abschnitt 2 (siehe oben) in ein Softwarepaket der Lage, eine Finite-Elemente-Netz zu erzeugen.
  2. Generieren A2D Maschen des Knorpel- und Gelenkoberflächen durch die Schrumpffolie Werkzeug unter dem 2D-Menü. Wählen Sie eine entsprechende Elementgröße.
    Hinweis: Verwenden Sie eine Elementgröße zwischen 1,5-2,5. Falls erforderlich, erzeugen eine Reihe von unterschiedlich großen 2D-Oberflächennetze 3D-Mesh-Optimierung durchzuführen (§ 4.4).
  3. Führen Sie Mesh Qualitätskontrollen unter den gefundenen '2D> Tools> Überprüfen Sie Elemente' Panel für duplizierte Elemente, Einfügungen und Durchdringungen im Netz zu überprüfen. Fix Diederwinkeln durch das Dienstprogramm Registerkarte in Modellbaum verwenden.
  4. Generieren Sie ein 3D-Netz aus den 2D-Oberflächennetzen unterschiedlicher Elementgröße mit Hilfe der 3D> Tetramesh subpanel.
    HINWEIS: Vergleichen Sie die Ergebnisse verschiedener Maschengrößen und wählen Sie das FE-Modell mit der Größe niedrigsten Netz, das nach einer weiteren Simulationen konvergiert und keine Funktionsdefinition beeinträchtigen. Das Beispiel in Figur 3 enthält 1.500.000 tetraedrischen Elemente für den Unterkiefer Knorpeln und hatte eine 2D Elementgröße von 2,0.
  5. Verwandeln Sie das Netz so Kiefermodell nach konfokalen Stapel zu skalieren ist mit der Geometrie> Entfernung subpanel.
    HINWEIS: Sicherstellen, dass die Knorpel und Gelenkkomponenten sind in dem Modell verbunden durch ein Mischmodell zu exportieren oder durch Bindern.

5. Finite-Elemente-Model Baumaschinen

  1. Mit kommerziellen Finite-Elemente (FE) Software eine FE-Modell. Mit Hilfe der 3D-Muskeln und Knorpel markierte konfokalen Stapel erzeugt in Abschnitt 1 als Leitfaden, weisen Knoten, die zu Muskelansatzpunkte entsprechen. Erstellen Sie einen Vektor zwischen zwei Knoten , die den Ursprung und die Einfügung eines jeden Muskel (Abbildung 3).
  2. Erstellen Sie eine Last Sammler des Typs 'Geschichte' a 'C-Last' zu gelten für jeden Muskel. Geben Sie den Betrag in Newton (berechnet in Schritt 3.3) und weisen Sie den zugehörigen Vektor. 3 sind die Befestigungspunkte für die Adduktoren mandibulae (AM) zeigt, Winkelmesser hyoideus (PH) und intermandibularis (IM).
    HINWEIS: Für diese Kiefermuskeln, Kraft maximale Kontraktions zwischen Ursprung und Ansatz so, dass nur 50% der jeweiligen Last verteilt wird an jedem Standort angewendet wird.
  3. Weisen Sie entsprechende elastische isotropen Materialeigenschaften, wie durch die Literatur bestimmt. Young-Modul für die Knorpelund die Interzone in diesem Modell waren 1,1 MPa und 0,25 MPa bzw. und das Poisson-Verhältnis betrug 0,25 für beide 18,19.
  4. Erstellen Sie eine Last Sammler des Typs 'Grenze' anfänglichen Beschränkungen für das Modell anzuwenden. Gehen Sie auf die Registerkarte Analyse> Constraints und im schaffen subpanel, wählen Sie die Knoten auf dem Modell, das Sie möchten, zu beschränken. Wählen Sie die Freiheitsgrade (DOF) diese Grenze Bewegung des Modells auf die beste Annäherung seiner natürlichen Bewegungsbereich.
    HINWEIS: Das Modell in Figur 3 wurde in allen Bewegungsachsen begrenzt (DOF: 1, 2, 3 für x, y und z, jeweils) am ceratohyal es im Raum zu verankern , an einem mittleren Punkt in dem Modell und in der Achse y und z an dem Punkt , wo die palatoquadrate zum Rest des Schädels Zebrabärbling verbindet (Abbildung 3, Tabelle 1). Das Modell muss in allen drei DOF in mindestens einem Knoten eingeschränkt werden.
  5. Erstellen Sie ein 'Load Schritt', für jede Art von Bewegung, die Sie möchten simulaßen ( das heißt, Öffnen, Schließen), unter der Analysemenü und wählen Sie alle relevanten Lasten (hergestellt in Abschnitt 5.2) und Beschränkungen (hergestellt in Abschnitt 5.4) , um diese Bewegung zu simulieren. Wählen Sie 'Static' aus dem Dropdown-Menü, wenn es erscheint.
  6. Exportmodell einschließlich der Masche, Lasten, Randbedingungen und Materialeigenschaften in einem geeigneten Dateiformat, in diesem Fall ".inp" Format.
  7. Lastmodell in FE-Analyse-Software. Erstellen Sie einen Job für das Modell ausführen mit dem Job-Modul.
  8. Analysieren Ausgang für Spannung, Dehnung, Verschiebung usw. in der Ergebnisse Tab und Visualisierung Menü (Abbildung 4 und 5).

6. Validierung von Jaw Deformation / Displacement Entfernungen

  1. Wählen Sie 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) transgenen Zebrafisch.
  2. betäuben leicht die Larven mit 0,02% MS222, bis sie nicht mehr zu reagieren, aber ihre Herzen zu berühren schlagen immer noch.
  3. Montierendie Larven seitlich (während narkotisierten) auf Deckgläsern in lauwarmem 1% LMP-Agarose (hergestellt in Danieau-Lösung).
  4. Entfernen Sie die Agarose aus um den Kopf und Kiefer mit einer Pinzette.
  5. Spülen Sie frische Danieau-Lösung (ohne MS222) über den Kopf der Larve zu entfernen Anästhesie mit einer Pasteur-Pipette, bis die normale Mundbewegungen wieder aufnehmen.
  6. Verwenden Sie Film-Capture-Software Hellfeld High-Speed-Videos von Mundbewegungen zu nehmen. Nehmen Sie Filme von rund einer Minute Dauer auf dem höchsten Framerate, oder ausreichend mehrere Zyklen von Maulöffnung aufzunehmen.
  7. Wählen Sie Frames, die den Kiefer offen zu seiner maximalen Verschiebung zeigen. Messen Sie den Abstand zwischen der vorderen Spitze des Meckel-Knorpel und Oberkiefer (Spitze des ethmoid Platte) in & mgr; m.
  8. Berechnen Sie die mittlere Verschiebung von mehreren Fischlarven.
  9. Auszug Verschiebungsdaten aus dem Modell. Verwenden Sie die mittlere Verschiebung in 6.8 berechneten Modell Verschiebung Verhalten zu überprüfen (

Representative Results

Immunofärbung für Muskel (1A) und des Knorpels (1B) bzw. Abbildungs transgener Reportern (1C) kann die 3D - Struktur des Kiefers visualisiert werden, zusammen mit der zugeordneten Muskulatur. Durch Bildgebung mit einer hohen Auflösung war es möglich , ein Modell zu erstellen , die sowohl die dreidimensionale Form des Kiefers (Abbildung 2) und die Lage und Anordnung der Lasten (3) erfasst. Unter Verwendung in vivo Verschiebungen hoher Geschwindigkeit Video - Capture (Abbildung 4) durch verifiziert wir , dass der Bereich der Bewegung in dem Modell in einem realistischen Bereich war.

Die FE - Modelle einmal laufen können eine Reihe von Daten anzuzeigen, wie Stress (5A), minimale und maximale Hauptdehnung (- K 5B) verwendet werden. Diese Ergebnisse sind drei-dim ensional so kann das Modell feine Muster Detail (5E, 5I) zu sehen , der vergrößert werden soll relevante Ansichten (5F, 5G, 5J, 5K) und digital geschnitten (5E ', 5E' ', 5I', 5I zu erhalten gedreht '') zu zeigen , wie die Muster von Spannung, Dehnung oder Druckänderung während des gesamten Modells. Es ist auch möglich, quantitative Daten aus dem Modell zu extrahieren (nicht gezeigt). Durch das Modell zu überprüfen und mit den genauesten Materialeigenschaften, Lasten und Netz Form der FE-Modell verwendet werden, um die bestmögliche Schätzung der mechanischen Umgebung zu erkunden, indem Zellen in diesem Fenster der Entwicklung erlebt. Die Ergebnisse des Modells kann direkt auf Veränderungen in Zellverhalten und die Genexpression 20 verglichen werden.

re 1 "src =" / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg "/>
Abb . 1: Repräsentative Bilder der Muskel - Skelett - Elemente der Zebrabärbling Unterkiefer bei 5 dpf Repräsentative konfokalen Stapel des Unterkiefers von 5dpf Larven alle mit vorderen gezeigt nach oben (A) Immunostaining für A4.1025 die alle Skelett-Myosin Flecken (B) Immunostaining für Typ - II - Kollagen , das alle Knorpel (C) Stapel von einer Live - Larve markiert die transgenen Reporter COL2A1 ausdrücken: mCherry Knorpel Markierung (rot) und smyhc: GFP langsam Muskel (grün). IA: intermandibularis anterioren, PH: Winkelmesser hyoideus, AM: Adduktoren mandibulae, HALLO: hyoideus minderwertig, HALLO: hyoideus überlegen, CH: sternohyoideus, MC: Meckel-Knorpel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal Bitte klicken Sie hier eine größere Version zu sehen dieser Figur.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Abbildung 2: Erzeugung einer 3D - Oberfläche von konfokalen Daten Bilder den Übergang von der konfokalen Daten in eine 3D - Oberfläche für den Zebrabärbling Unterkiefer mit höherer Vergrößerung des Verbindungsbereichs zeigt.. (A) Rohdaten konfokalen; (B) Datensatz nach der Anwendung eines Gaußschen Filters; (C) Gefiltert Kontur; (D) 3D - Oberfläche. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Repräsentative Maschen Zwänge und Kraftvektoren Repräsentative Maschen für eine 5 dpf Larve für (A) Mund Schließung zeigt und.(B) Mundöffnung. Weiße Punkte bezeichnen Stellen , wo das Modell beschränkt ist , und in dem Maße (beispielsweise x und y oder x, y und z). Weiße Linien bezeichnen Muskel Positionen, die mit dem Vektor der Muskelkraft durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Rot zeigt Knorpel und Gelb die interzone. Diese Zahl wurde von ergänzendem Material modifiziert zuvor in Brunt veröffentlicht et al. 15. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Sensibilitätsprüfung FE-Modell Backenbewegung in 5dpf Zebrabärbling für verschiedene Knorpel und Interzonen Young-Module simulieren. Backenbewegung (offen in & mgr; m geschlossen) auf der Backe markiert; mit der Farbtaste aufgezeichnet. Jedes Modell (A - L) eine unterschiedliche Kombination von Knorpel (c = 1,1, 3,1 bzw. 6,1 MPa) oder Interzonen (i = von 0,25, 0,5, 0,75 oder 1 MPa) Eigenschaften aufweisen . Horizontal schwarzer Pfeil hebt den Wert der Backenbewegung an der Spitze der Meckel-Knorpel (durch den vertikalen schwarzen Pfeil dargestellt). M und N Standbilder aus Videos von 5 dpf Larven zeigt Minimum, das heißt, Kiefer geschlossen (M) und Maximum, das heißt, Kiefer vollständig geöffnet (N) mit den beiden überlagerten (O) - weiße Linie auf O steht für die Verschiebung (von 43 & mgr; m). In diesem Fall sind relativ Knorpel Eigenschaften von 1,1 mit einem Interzone von 0,25 (A) am besten entsprechen die Verschiebungen in lebenden Fischen gesehen (O). Panels AL dieser Figur wurden zuvor in Brunt et al. 15. Bitte klicken Sie hier um einen größeren vers anzuzeigenIon dieser Figur.

Abbildung 5
Abbildung 5: Repräsentative Daten aus den FE - Modelle FE-Modell Simulation aller in einem 5 dpf Larve angewendet Muskeln (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) Mindesthauptdehnung (E Min. P, μɛ) (C) Maximaler Hauptdehnung (E Max. P., μɛ). FE-Modell-Simulation der maximalen und minimalen Hauptstämme bei Kieferöffnung. (D - K): Die maximale Hauptdehnung (. E Max P., μɛ) in (D) ventralen Kiefer Sicht und (E) ventralen Gelenkansicht (E) zeigt Lage von proximal-distalen Abschnitte durch den Knorpel Meckel Gelenk und das Interzonen in (E ') und (E' '), respectively. (F): seitlichKiefer-Ansicht. (G): Lateralgelenk Ansicht. (H - K): minimale Hauptstamm (. E Min P, μɛ) in (H) ventralen Kiefer Sicht und (I) ventralen gemeinsamen Ansicht. (I) zeigt Lage der proximal-distalen Abschnitte durch den Knorpel Gelenk Meckel und interzone in (I ') und (I' ') bzw. (J): seitliche Kieferansicht. (K): Lateralgelenk Ansicht. Diese Zahl wurde veröffentlicht früher al in Brunt et. 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Anzahl der Muskelfasern Muskelfaserbereich (um 2) Muskelgruppe Bereich (& mgr; m2) Force (N)
5 dpf intermandibularis anterioren 5 23.8 119 4.76e-6
5 dpf Winkelmesser hyoideus 6 23.8 142,8 5.71e-6
5 dpf Adduktoren mandibulae 9 23.8 214,2 8.57e-6

Tabelle 1: Muskel - Quantifizierung. Durchschnittliche Muskelkräfte für die Intermandibularis Anterior, Adduktoren mandibulae und Protractor Hyoideus bei 5 dpf unter Verwendung von 40 nN / & mgr; m 2 (Wert pro Flächeneinheit von Referenz 17 genommen) berechnet. (Lorga et al., 2011) (n = 3).

Discussion

Finite - Elemente - Modelle wurden verwendet , um die Bereiche der Skelettelemente zu beziehen , die unter Belastung mit denen unterzieht die Knochenbildung sind 10, sowie die Bereiche unter Belastung während endochondral Verknöcherung und Joint Morphogenese 8,12,21 abzubilden. Andere Studien konnten auch theoretische Wachstumsmodelle anwenden Veränderungen 11,12 während die gemeinsame Entwicklung zu replizieren. Hier zeigen wir das Protokoll für den Aufbau von FE - Modellen für ein relativ einfaches System, der Zebrabärbling Backe 20. Im Gegensatz zu alternativen Methoden der Rohbilder für die FE - Modelle sammeln, wie beispielsweise CT - Abtastung 22, konfokale Bildgebung transgener Linien oder immunhistochemisch Zebrabärbling ermöglicht mehrere Gewebe untersucht werden. Es kann daher liefern direkte Informationen über Muskelbefestigungspunkte in Bezug auf Knorpel. Unter wirbel Modelle sind Zebrabärbling besonders zugänglich für genetische und pharmakologische Manipulation. Die Erzeugung von FE-Modellen für Zebrabärblingcraniofacial Knorpel eröffnet nun die Möglichkeit einer weiteren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Biomechanik und Genetik in gemeinsamen Morphogenese auf.

Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in den Prozess ein FE-Modell erzeugt wird; Die erste ist eine genaue dreidimensionale Darstellung des Systems zu erzeugen. Dies erfordert Bildgebung bei ausreichend hoher Auflösung zu deutlich Grenzen definieren. Beachten Sie, dass auch bei Bildgebung mit hoher Auflösung eine gute Oberfläche zu machen, muss dieser einige Regionen glätten kann. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Definition, die korrekte Platzierung der Last und korrekte Einschränkungen. Ein unzureichend eingeschränkt Modell scheitern wird und eine falsche Platzierung der Lasten zu lösen abnorme Bewegung verursachen.

Einige Verarbeitung der Rohdaten (Figur 2) ist notwendig , da eine Oberfläche aus den Rohdaten erzeugt würde schwierig sein Mesh (2B). Wir gefiltert , um die Daten , die ein Gauß - Filter (Abbildung 2C

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass es immer Einschränkungen auf ein hypothetisches Modell und einssumptions gemacht FE-Modelle laufen. Wenn nur eine oder eine kleine Anzahl von Proben Modellierung ist es wichtig, sicherzustellen, dass eine repräsentative Probe, wie es gewählt wird, sind wahrscheinlich kleine Variationen zwischen Individuen. Da nur enthalten waren einige der Backenelemente und Muskeln, das Modell ist eine vereinfachte Version des Zebrabärbling craniofacial Muskel-Skelett-Systems. Daher mussten Einschränkungen positioniert werden, um zu erklären, wo die modellierten Backenelemente mit dem Rest des Schädels in Verbindung bringen würde und das Modell wurde künstlich im Zentrum gezwungen es in "Raum" zu beheben. Diese künstliche Einschränkung Auswirkungen nicht auf die Interpretation aus den Modellen als ceratohyal gezogen selbst nicht analysiert. Die Einbeziehung von mehr der kraniofazialen Struktur, vor allem andere Maulöffnung Muskeln wie die sternohyals und der ihr beigefügten Knorpel 23, könnte zum Modell hinzugefügt, aber Einschränkungen umfassen die Fähigkeit der größeren Modelle in der Finite - Elemente - Software auszuführen.

s = "jove_content"> Eine weitere Einschränkung besteht darin , dass wir nicht Bandinsertion modelliert, obwohl dies durch die Insertion von Federn 8 erreicht werden konnten. Eine andere Annahme in diesem Fall war, dass das Modell linear verhalten würde. Die Größen der Stämme auf die Modelle waren vergleichbar mit denen , die in der veröffentlichten Modelle und auf in - vitro - Zellen 10,24, mit Stämmen unter 3500 und über -5.000 μɛ abgesehen von Zwang und Muskelansatzpunkte sein. Daher wurden die Stämme in den jeweiligen Regionen des Modells innerhalb eines Bereichs akzeptabel für ein lineares Modell angesehen. Cartilage verhält sich nicht ganz als lineares Material und hat zuvor als poroelastischer Material modelliert, die 25 Analyse des Fluid Verhalten im Modell aktiviert. Verbreiten der Muskelansatzpunkte unter einer Gruppe von lokalen Knoten würde die Spitzenkräfte verteilen und genauer den Muskelansatz für bestimmte Muskeln darstellen.

ent "> Verwendung von FE ermöglicht eine Bewertung der auf einer Struktur wirkenden Dehnungen und Spannungen. Als Technik häufig in vielen biowissenschaftlichen Disziplinen einschließlich der Orthopädie, Paläontologie und in jüngerer Zeit die Entwicklungsbiologie verwendet wird. Hier beschreiben wir, wie FES für die Zebrabärbling bauen Unterkiefer. in Zukunft könnten diese Modelle auf der ganzen Kiefer aussehen erweitert werden, einschließlich des Gaumens. Ähnliche Techniken verwendet werden könnten, spinal Biomechanik in Fischen, die bisher meist durch kinematische Mittel untersucht worden sind, zu modellieren.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Einige Daten in den 3-5 wurde von J.Biomech nachgedruckt, 48 (12), Brunt et al., Finite - Elemente - Modellierung prognostiziert Veränderungen in gemeinsamen Form und das Verhalten der Zelle durch den Verlust von Muskelzerrung in Kieferentwicklung, 3112-22. 2015 mit Genehmigung von Elsevier 15.

Acknowledgments

LHB wurde von der Wellcome Trust Dynamische Zell PhD-Programm finanziert werden; KAR wurde von MRC Projektförderung MR / L002566 / 1 (vergeben EJR und CLH) gefördert und CLH wurde von ARUK Zuschuss 19479. finanziert Wir würden auch die Wolfson Bioimaging Einrichtung für die Bildgebung Beratung danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coll2 Abcam ab34712 Type II collagen antibody - stains all cartilage
A4.1025 / MF20 Developmental studies hybridoma bank A4.1025 Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle 
Low melt agarose Sigma  A9414-5G For mounting zebrafish
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate ) Sigma E10521-10G To make anesthetic
Trypsin Fisher T/3760/48 sample permeablilisation
Dylight 488 Mouse IgG Thermofisher 35502 Secondary antibody
Dylight 550 Rabbit IgG Thermofisher  84541 Secondary antibody
SP8/SP5 or SPE confocal Leica  For imaging 
LAS Leica capture software Leica Imaging software
Aviso (version 7.0.0) FEI Visualization Science Group 3D image analysis software (Section 2)
Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10) Altair Engineering FE model generating software (Section 4-5)
Abaqus (version 6.14) SIMULIA FE analysis software (Section 5.7-5.8)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rayfield, E. J. Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).
  2. Rao, S. S. The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. (2010).
  3. Taylor, M., Prendergast, P. J. Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities. J Biomech. 48, 767-778 (2015).
  4. Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments. Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).
  5. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).
  6. Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension. Dev biol. 370, 154-163 (2012).
  7. Rolfe, R. A., et al. Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways. BMC genomics. 15, 48 (2014).
  8. Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint. J Biomech. 44, 143-149 (2011).
  9. Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli. Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).
  10. Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones. J Biomech. 41, 249-258 (2008).
  11. Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis. J Biomech. 47, 989-995 (2014).
  12. Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis. J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).
  13. Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling. Development. 136, 3991-4000 (2009).
  14. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).
  15. Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity. Development. 135, 2115-2126 (2008).
  16. Danieau's solution (30×). Cold Spring Harb Prot. pdb.rec12467 (2011).
  17. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).
  18. Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse. J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).
  19. Tanck, E., et al. The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone. Bone. 35, 186-190 (2004).
  20. Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development. J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).
  21. Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos. PloS one. 6, e17526 (2011).
  22. Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium. Peer J. 3, 1294 (2015).
  23. Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo. Development. 124, 2945-2960 (1997).
  24. Dowthwaite, G. P., et al. A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation. Matrix biol. 22, 311-322 (2003).
  25. Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. Poroelasticity of cartilage at the nanoscale. Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).
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Brunt, L. H., Roddy, K. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics. J. Vis. Exp. (118), e54811, doi:10.3791/54811 (2016).More

Brunt, L. H., Roddy, K. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics. J. Vis. Exp. (118), e54811, doi:10.3791/54811 (2016).

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