Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.
Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller ‘finite elements’, FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a ‘heat map’ showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.
Finita Element (FE) modellering är en ingenjörsteknik som beräknings kan beräkna och kartlägga omfattningen och lokaliseringen av stammar som verkar på en struktur 1. Modellen består av 3D-strukturen, som representeras av ett nät av "Finite Element", och slutresultatet av analysen regleras av ett antal faktorer, inklusive strukturen och antalet element i maskorna, storleken och lokaliseringen av den mekaniska laster och materialegenskaper. Materialegenskaper beskriva vissa aspekter av ett materials beteende under en viss typ av last; Youngs modul (E) beskriver elasticiteten hos materialet medan Poissons tal beskriver den proportionella minskningen i bredd hos ett material att dess längd när ett prov sträcks. FE modellering kan användas för att beräkna en mängd olika variabler, inklusive förskjutning, stress, tryck och påfrestningar som verkar på modellen genom att ta hänsyn till de unika indata om strukturen '; S form, placering och storlek av laster och de specifika materialegenskaper.
FE modellering används ofta inom teknik 2 och alltmer för ortopediska 3 och paleontologiska tillämpningar 4. I utvecklingen biomekaniska krafter är kända för att fungera som en stimulans i många celler för att aktivera cellsvar 5-8 och det är lämpligt att förutsäga både de relativa positionerna och storlekarna av mekaniska stimuli inom utveckling av organsystem, men för närvarande FE modellering har använts i liten utsträckning för zebrafisk utveckling.
Både brosk och ben har visats vara mechanosensitive material. Till exempel har in vitro-kompression befunnits aktivera kondrogena vägar, medan spänningen har visat sig vara nödvändigt för benbildning 9. FE-analys (FEA) har utnyttjats för att modellera stammar som verkar på biologiska prover, inklusive de som agerar på skelettelementen under ben formation 10. Andra utvecklings applikationer inkluderar dess användning för att förutsäga formen av en fog efter att den har utsatts för teoretiska biomekaniska krafter 11,12 och för att visa mönstret av stammar närvarande under chick knäleden morfogenes 8.
Detta protokoll syftar till att dela erfarenheter att generera 3-dimensionella ytor, maskor och finita elementmodeller från konfokala bilder i syfte att förstå mekaniken i utvecklings vävnader. Vi visar också metoder för att validera FE modellerna även fånga verklig gemensam förskjutningsinformation in vivo. Samtidigt som vi använder zebrafisk käken som en förebild samma teknik kan användas på alla små biologiskt system som 3D-information om strukturen i muskuloskeletala systemet kan erhållas genom konfokala eller multifoton avbildning.
Finita elementmodeller har använts för att relatera områdena skelett element som är under press med de som genomgår benbildning 10, samt att kartlägga de områden som påfrestningar under endokondral benbildning och gemensam morfogenes 8,12,21. Andra studier har också kunnat tillämpa teoretiska tillväxtmodeller att replikera förändringar under gemensam utveckling 11,12. Här visar vi protokollet för att bygga FE-modeller för ett relativt enkelt system, zebrafisk käften 20. Till skillnad från alternativa metoder för att samla in råbilder för FE-modeller, såsom CT-scanning 22, konfokal avbildning av transgena linjer eller immunzebrafisk möjliggör för flera vävnader som skall studeras. Det kan därför ge direkt information om muskel fästpunkter i förhållande till brosk. Bland ryggradsdjur modeller zebrafisk är särskilt mottagliga för genetisk och farmakologisk manipulation. Genereringen av FE-modeller för zebrafiskkraniofaciala brosk öppnar nu upp möjligheten att ytterligare studier av samspelet mellan biomekanik och genetik i joint morfogenes.
Det finns ett antal kritiska steg i processen för att skapa en FE modell; den första är att generera en exakt tredimensionell representation av systemet. Detta kräver avbildning vid tillräckligt hög upplösning för att tydligt definiera gränser. Observera att även med hög upplösning avbildning för att göra en bra yta man kan ha för att jämna ut vissa regioner. Ett annat kritiskt steg är att definiera den korrekta placeringen av lasten och korrigera begränsningar. En otillräckligt begränsad modell kommer inte att lösa och felaktig placering av lasterna kommer att orsaka onormala rörelser.
Viss bearbetning av de rådata (figur 2) är nödvändig som en yta genererad från rådata skulle vara svårt att mesh (Figur 2B). Vi filtrerade data med hjälp av en Gaussfiltret (Figur 2C </sTrong>) och vi genomförde någon manuell utjämning av kurvor för att producera en uppsättning rena konturer som kan omvandlas till en 3D-yta. För mycket utjämning kan producera en "smält" yta som har förlorat många av dess funktioner. Att välja rätt elementstorleken är en iterativ process som att välja en alltför liten del storlek skapar alltför stor mask som är beräkningsintensiv. Dock kommer att välja en för stor elementstorlek producera ett nät som underlåter att rekapitulera den korrekta formen av strukturen. Den korrekta mesh hade det minsta elementet storlek som fångade den korrekta formen av käken och konvergerade på en riktig lösning, kontrolleras med hjälp av käken deplacement. Det kan också vara nödvändigt att ändra materialegenskaper eller belastnings beräkningar för att bättre efterlikna den korrekta förskjutningen som olika åldrar och arter kommer att ha väsentligt olika egenskaper.
Det är viktigt att komma ihåg att det alltid finns begränsningar för en hypotetisk modell och enssumptions gjorde att köra FE modeller. När endast modellering en eller ett litet antal prover är det viktigt att se till att ett representativt urval väljs som det kommer sannolikt att vara små variationer mellan individer. Eftersom endast en del av klämskänkelelementen och muskler ingick, är modellen en förenklad version av zebrafisk kraniofaciala muskuloskeletala systemet. Därför måste begränsningar som ska positionerat för att redogöra för var de modellerade klämskänkelelementen skulle ansluta med resten av skallen och modellen artificiellt begränsas i mitten för att fixa det i "utrymme". Denna artificiella restriktion inte påverka tolkningen dras från modeller som ceratohyal själv inte analyserades. Införandet av flera av de kraniofaciala struktur, kan i synnerhet andra käken öppna muskler såsom sternohyals och dess anslutna brosk 23, har lagt till modellen, men begränsningar inkluderar möjligheten av större modeller köras i finita element program.
<p clas s = "jove_content"> En annan begränsning är att vi inte har modellerade ligament insertion, även om detta skulle kunna uppnås genom införande av fjädrar 8. En annan antagande i detta fall var att modellen skulle bete sig linjärt. Storlekarna på påfrestningar på modellerna var jämförbara med dem i publicerade modeller och tillämpas in vitro celler 10,24, med stammar som under 3500 och över -5000 μɛ bortsett från tvång och muskel fästpunkter. Därför var stammarna på de relevanta områdena av modellen bedöms inom ett område acceptabelt för en linjär modell. Brosk inte beter sig helt som en linjär material och har tidigare modelleras som en poroelastic material, vilket möjliggjorde analys av vätskan beteende i modellen 25. Sprida muskel fästpunkter bland ett kluster av lokala noder skulle fördela toppkrafter och mer exakt representera muskel isättning för vissa muskler. ent "> Användning av FE tillåter en bedömning av stammarna och spänningar som verkar på en struktur. Som en teknik det ofta används i många biovetenskap discipliner, inklusive ortopedi, paleontologi och mer nyligen utvecklingsbiologi. Här beskriver vi hur man bygger stiftelser för zebrafisk käken. i framtiden dessa modeller skulle kunna utvidgas för att titta på hela käken, inklusive gommen. Liknande tekniker kan användas för att modellera spinal biomekanik i fisk, som hittills har mestadels studerats genom kinematiska medel.The authors have nothing to disclose.
LHB har finansierats av Wellcome Trust Dynamic Cell forskarutbildningen; KAR har finansierats av MRC projektbidrag MR / L002566 / 1 (tilldelas Ejr och CLH) och CLH finansierades av Aruk bidrag 19479. Vi vill också tacka Wolfson Bioimaging anläggning för avbildning råd.
Coll2 | Abcam | ab34712 | Type II collagen antibody – stains all cartilage |
A4.1025 / MF20 | Developmental studies hybridoma bank | A4.1025 | Skeletal mysoin antibody – marks all skeletal muscle |
Low melt agarose | Sigma | A9414-5G | For mounting zebrafish |
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate ) | Sigma | E10521-10G | To make anaesthetic |
Trypsin | Fisher | T/3760/48 | sample permeablilisation |
Dylight 488Mouse IgG | Thermofisher | 35502 | Secondary antibody |
Dylight 550 Rabbit IgG | Thermofisher | 84541 | Secondary antibody |
SP8/SP5 or SPE confocal | Leica | For imaging | |
LAS Leica capture software | Leica | Imaging software | |
Aviso (version 7.0.0) | FEI Visualization Science Group | 3D image analysis software (Section 2) | |
Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10) | Altair Engineering | FE model generating software (Section 4-5) | |
Abaqus (version 6.14) | SIMULIA | FE analysis software (Section 5.7-5.8) |