Summary
Wir beschreiben hier ein Verfahren zum Erhalt und eine neu charakterisierte Subpopulation von Neutrophilen stammRiesenFressZellen zu identifizieren. Diese Zellen entwickeln sich in Kultur aus frischem menschlichem Blut Neutrophilen und werden durch Phagozytose, Autophagie, ungeheuer groß, und längere Lebensdauer aus. Diese Methode ist wesentlich zur Weiterentwicklung dieses einzigartigen Neutrophilen stamm Subpopulation untersuchen.
Abstract
Neutrophile (PMN) sind am besten für ihre phagozytischen Funktionen bekannt gegen Krankheitserreger und Mikroorganismen eindringen. Sie haben die kürzeste Halbwertszeit zwischen Leukozyten und in ihrer nicht aktivierten Zustand sind die Apoptose konstitutiv begangen. Wenn zu Entzündungsstellen rekrutiert Entzündung zu lösen, die sie produzieren eine Reihe von zytotoxischen Molekülen mit potenten antimikrobiellen Tötung. Doch wenn diese starken zytotoxischen Moleküle in unkontrolliert freigesetzt werden, können sie das umgebende Gewebe beschädigen. In den letzten Jahren ist jedoch Neutrophilen Vielseitigkeit zunehmend bewiesen, durch Funktionen Plastizität und immunregulierende demonstrieren. Wir haben kürzlich ein neues Neutrophilen abgeleitete Subpopulation identifiziert, die ohne Zugabe von Zytokinen / Wachstumsfaktoren, wie Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) / Interleukin (IL) -4 spontan in Standardkulturbedingungen entwickelt. Ihre phagozytischen Fähigkeiten der Neutrophilen Reste weitgehend bringen ihr zu erhöhenGröße enorm; deshalb wurden sie genannt Riese Phagozyten (Gφ). Im Gegensatz zu Neutrophilen, sind Gφ lange in Kultur gelebt. Sie drücken den Cluster der Differenzierung (CD) neutrophile Marker CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / Myeloperoxidase (MPO) / neutrophile Elastase (NE) und sind frei von der monozytären Linie Marker CD14 / CD16 / CD163 und die dendritischen CD1c / CD141 Marker . Sie nehmen-up auch Latex und Zymosan und reagieren durch oxidative Burst Stimulation mit opsonisierter-Zymosan und PMA. Gφ auch Ausdruck der Scavenger-Rezeptoren CD68 / CD36, und im Gegensatz zu Neutrophilen, internalisieren oxidierten Low Density Lipoprotein (oxLDL). Außerdem, im Gegensatz zu frischen Neutrophile oder Monozyten kultiviert, reagieren sie durch erhöhte reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Produktion oxLDL-Aufnahme. Zusätzlich enthalten diese Phagozyten Mikrotubuli-assoziierten Protein-1 leichte Kette 3B (LC3B) beschichtet Vakuolen, welche die Aktivierung von Autophagie. Verwendung spezifischer Inhibitoren ist ersichtlich, dass sowohl die Phagozytose und autophagy sind prerequisites für ihre Entwicklung und wahrscheinlich NADPH-Oxidase-abhängige ROS. Wir beschreiben hier ein Verfahren zur Herstellung dieses neuen Subpopulation von langlebigen, Neutrophilen stamm phagozytischen Zellen in Kultur, die Kennzeichnung und die derzeit bekannten Eigenschaften. Dieses Protokoll ist von wesentlicher Bedeutung für den Erhalt und die Charakterisierung Gφ, um ihre Bedeutung und Funktionen weiter zu untersuchen.
Introduction
Neutrophilen Granulozyten (PMN) bilden die größte Population von Leukozyten im Blut, wie die erste Linie der Verteidigung dient, gegen Krankheitserreger durch die Erzeugung einer Vielzahl von zytotoxischen Moleküle eindringen. Die traditionelle Auffassung ist, dass der Blut zirkulierenden, kurzlebig, professionelle Phagozyten lang gewesen, das sind die ersten akuten Entzündungsstellen zu kommen Infektionen und Hilfe bei der Clearance von Krankheitserregern und schädlichen Partikel zu bekämpfen. 1 In ihrer nicht-aktivierten Zustand sind Neutrophile konstitutiv verpflichtet Apoptose. Wenn aus dem Blut zu Entzündungsstellen der Migration unterziehen Neutrophilen-Aktivierung Entzündung zu lösen. Sie phagozytieren und töten Mikroorganismen eindringen, durch eine Reihe von zytotoxischen Molekülen als reaktive Sauerstoffspezies produzieren (ROS), lytischen Enzymen wie neutrophile Elastase (NE) und Cathepsin mit starke mikrobizide Wirkung. Um zu stoppen Pathogene, lassen Neutrophilen auch extrazelluläre Fallen (NETs), Die von Kernchromatin Fäden enthält antibakterielle Peptide und verschiedenen lytischen Enzymen bestehen. Allerdings unkontrollierte Freisetzung dieser zytotoxischen Moleküle von Neutrophilen kann auch Entzündungsreaktionen aufrechterhalten und dabei Schäden am umgebenden Gewebe zu induzieren. Daher 2 eine wirksame Clearance von apoptotischen Neutrophilen durch Makrophagen (M & phi;) und dendritischen Zellen (DC) ist entscheidend , um Entzündungen zu lösen. 3, 4, 5, 6
aber in den letzten Jahren hat sich immer deutlicher, dass Neutrophile sind vielseitig einsetzbar Zellen, deren Funktionen weit über die Phagozytose und Abtötung Erreger. 6, 7 durch Auffrischen oder Aktivierung erfährt, gewinnt Neutrophilen Plastizität allmählich Aufmerksamkeit. So wurden herausgefordert Bakterien und Mykobakterien Neutrophilen gezeigtsekretieren Interleukin (IL) -10 und Kontrolle der Entzündungsreaktion, die Anwesenheit von immunregulatorischen Antworten hindeutet. 8 postmitotischen Neutrophile wurden zu transdifferenzieren sich in M & phi; artigen Zellen oder DC-ähnlichen Zellen durch Verdauen und Präsentieren Antigenfragmente gezeigt , wenn mit Zytokinen und Wachstumsfaktoren behandelt, 9, 10 somit eine kritische Rolle dient bei der Integration von angeborenen und erworbenen Antworten. 3, 6 Aktivierung von Wachstumsfaktoren gefördert engulfment von apoptotischen Neutrophilen oder Zelltrümmer, wodurch die Clearance von Ablagerungen an Entzündungsstellen und die Auflösung der Entzündung, 3, erleichtert 9 insbesondere dann , wenn die M & phi; / DC - Clearance System ist unzureichend oder überfordert, 11, 12 Potential "Selbstregulierung" was darauf hindeutet, zu helfen, relösen die Entzündungsreaktion. Dies, da Apoptose ist eine Form des geregelten Selbst Tod, die die extrazelluläre Freisetzung von zytotoxischen Verbindungen hemmen können und so Verletzungen des umgebenden Gewebes verhindern. 6
Verlängertes Überleben ist ein weiteres Merkmal der Neutrophilen-Aktivierung und wurde durch Behandlung mit verschiedenen Host-abgeleitete Faktoren, wie Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), inflammatorische Zytokine wie Interferon nachgewiesen ( IFN) -γ, Tumornekrosefaktor (TNF) -α und / oder Pathogen-abgeleiteten Produkten, wodurch ermöglicht Neutrophilen ihr Überleben Antwort zu modulieren. 6 Tatsächlich neutrophil Überleben ist eine Voraussetzung für ihre Plastizität und mit seiner Fähigkeit assoziiert Phagozytose durchzuführen. 6, 13 Demgemäß wurde auch mit phänotypischen und funktionellen Veränderungen zu assoziieren gezeigt , die DEPENin Neutrophilen Lebensdauer Erweiterung beteiligt sind, und verminderte Apoptose ded auf hochregulierten Genexpression durch Beginn der Synthese neuer Proteine zu induzieren. 10
Im Gegensatz zu Neutrophilen, die kurzlebig sind und konstitutiv Apoptose in Kultur oder die Cytokine / Wachstumsfaktoren-aktivierte Neutrophile, wie oben beschrieben, die Lebensdauer verlängert haben, haben wir vor kurzem eine neue, kleine Subpopulation von Neutrophilen identifiziert, die spontan in längeren Standardkultur entwickelt Bedingungen von frisch isolierten menschlichen Blut Neutrophilen ohne extern Zytokine oder Wachstumsfaktoren addieren. 14 Diese Neutrophilen stammenden Zellen, die vorher nicht in der Literatur beschrieben wurden , wurden genannt giant Phagozyten (Gφ). Die Gφ haben Lebensdauer in Kultur erweitert, werden sie innerhalb von 5-7 Tagen voll entwickelt und zeichnen sich durch einzigartige morphologische Merkmale, die Expression des Phänotyps und Funktionen aus. Sie sind in beträchtlichem Ausmaß vergrößert aufgrund autophagotose von toten Neutrophilen Reste, Vakuolen und enthalten Phagolysosome. Die Gφ Ausdruck der spezifischen neutrophilen Granula Marker - Cluster der Differenzierung (CD) 66b, die Azurgranula Marker - CD63 und Myeloperoxidase (MPO) und zusätzliche Neutrophilen Marker wie CD11b, NE, CD15, Untereinheiten der NADPH - Oxidase - gp91- phox und p22- phox und der Autophagie Marker -LC3BII. 14, 15 Funktionell, sie nehmen aktiv-up Latexkügelchen und Zymosan Partikel und erzeugen ROS in Reaktion auf Zymosan und Phorbol - 12-Myristat 13-Acetat (PMA) Stimulation. Interessanterweise im Gegensatz zu frischen Neutrophilen, Gφ auch intensiv mit den Scavenger-Rezeptoren CD68 und CD36 exprimieren, take-up oxidierte Low Density Lipoprotein (oxLDL) und ROS mit oxLDL in Reaktion auf die Stimulation erzeugen. Darüber hinaus sind Gφ frei von den Monozyten-Linie Marker CD14, CD16 und CD163 oder die dendritischen Marker CD1c und CD141. Außerdem phagocytosis und Autophagie und wahrscheinlich funktionelle NADPH-Oxidase sind die Voraussetzungen für ihre Entwicklung. Dies, da der Phagozytose-Inhibitor cytochalsin B, die Autophagie-Inhibitoren 3-methyladenine (3-MA) und Bafilomycin (BafA1) und der NADPH-Oxidase-Hemmer - Diphenylen Iodonium (DPI) - verhindert deren Entwicklung. Zusätzlich Monozyten / Neutrophilen Co-Kulturen sowie Exposition gegenüber intermittierenden Hypoxie ihre Entwicklung behindert, während neutrophile Anpassung an nachhaltige Hypoxie war offensichtlich. 14,15 Die vorgeschlagene Entwicklung in der Kultur ist in Abbildung 1 .Das Protokoll in der vorliegenden Arbeit dargestellt beschreibt Schritt für Schritt die Herstellung von Gφ von frisch isolierten menschlichen Blut Neutrophilen zirkuliert, deren Entwicklung, Identifizierung und einige grundlegende Eigenschaften. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um weiter zu untersuchen und zeigen das breite Spektrum und die Rolle dieser neu beschrieben und faszinierende Neutrophilen stamm Gφ um characterize ihre Bedeutung und ihre möglichen Funktionen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung von Riesenzellen Entwicklung in 7 - Tage - Neutrophilen - Kulturen. Es wird vorgeschlagen , dass an Entzündungsstellen (1) Neutrophile apoptotischen Zelltod unterziehen, und (2) Freisetzung membran eingekreist Fragmente Kern Schutt, Granulate (grüne und rote Punkte) und andere subzelluläre Bestandteile enthalten , die die Autophagie Mechanismen auslösen. (3) Riesenfresszellen (Gφ) entwickeln sich in langfristigen Neutrophilen Kulturen frei von Zytokinen oder Wachstumsfaktoren von apoptotischen Körpern und Neutrophilen Trümmer internalisieren, unter Beibehaltung funktionellen NADPH oxidase.They durch verschiedene neutrophilen CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b gekennzeichnet sind + / NE-Marker, große phagosomes Granulat und Zelltrümmer und Scavenger-Rezeptoren CD36 und CD68 umschließt. Gb1; sind meist einkernigen Zellen, in der Lage auch verschiedene Partikel von Internalisierung und oxidiertem LDL und erzeugen ROS. Die Membranen der Vakuolen Füllung Gφ enthalten LC3B (dunkelblau markiert), einem Marker der autophagosomalen Membran, eine strenge Assoziation zwischen Autophagie und Riesen Phagozyten Bildung hindeutet. Gφ entwickeln sich nicht in Medium, das GM-CSF / IL-4. Auch Inhibitoren wie die NADPH-Oxidase-Hemmer - Diphenylen Iodonium (DPI), die Autophagie-Inhibitoren 3-methyladenine (3-MA) und Bafilomycin (BafA1) und der Phagozytose Inhibitor Cytochalasin B (. Cyto B) abschaffen ihre Bildung. (4) Mögliche Gφ Funktionen in vivo kann anti- oder pro-inflammatorische Eigenschaften und die Teilnahme an atherosklerotische Prozesse (diese Zahl basiert auf unseren Erkenntnissen 14, 15 und wurde aus dem begleitenden Editorial von B geändertErton 20). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Protocol
Das Protokoll wurde von der lokalen Menschenrechtsausschuss genehmigt gemäß der Erklärung von Helsinki, und alle Teilnehmer unterzeichnet eine Einwilligungserklärung.
1. Neutrophilen-Isolierung und Entwicklung von Gφ in Kultur
HINWEIS: Alle Schritte sollten sterile Gewebe Grad Lipopolysaccharid (LPS) -freien Lösungen in einem Bio-Safety Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Fügen Sie keine Antibiotika, Cytokine oder Wachstumsfaktoren zur Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 Medium.
- Erhalten Sie mindestens 40 ml venöses Blut von gesunden jungen Erwachsenen eine sterile Perfusionsbesteck Satz verwenden. Zeichnen Sie Blut in Vacutainer - Röhrchen , die Ethylendiamintetra Essigsäure K 3 Salz (K 3 EDTA) und vorsichtig mischen. Halten Sie das Blut bei Raumtemperatur.
- Isolieren die Neutrophilen durch zweistufigen diskontinuierlichen Dichtegradienten unter Verwendung Polysaccharose bei 1,119 und 1,077 g / ml. Bringen Sie Lösungen auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch.
HINWEIS: Während der Zentrifugation roten BlutZellen (RBZ) werden von der Polysucrose und Sediment schnell aggregiert. Die mononukleären Zellen (Monozyten / Lymphozyten) zwischen dem oberen Plasma gefunden / Polysaccharose -1077 - Schnittstelle, während die Neutrophilen knapp oberhalb der RBCs, am Polysaccharose -1077 / 1119 - Schnittstelle (siehe Figur 2) zu finden sind. Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Trennung von einkernigen Zellen und Neutrophile von demselben Individuum.
Abbildung 2: Neutrophile Isolierung aus humanem Vollblut. Polysucrose bei einer 1,077 g / ml wird sorgfältig oben auf Polysucrose-1.119 geschichtet g / ml bis zu einem diskontinuierlichen Gradienten zu bilden. Die verdünnte Vollblut wird dann auf der Oberseite des Polysucrose-1,077 geschichtet. Die Röhrchen werden sofort unterzogen, für 30 Minuten bei 700 xg zentrifugiert, bei Raumtemperatur ohne Bremse. Drei verschiedene Bands werden zur Kenntnis genommen. (A) Mononukleäre Zellen, (B) polymorphkernige Zellen (PMN),und (C) die roten Blutzellen (RBC) am Boden des Röhrchens. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Hinzufügen 12 ml Polysaccharose-1119 auf den Boden eines 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen konisch.
- Schicht vorsichtig 12 ml Polysucrose-1077 auf den Polysucrose -1119.
- Verdünne 10 bis 12 ml Vollblut auf ein Endvolumen von 24 ml Blut mit ionenfreien Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 2% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (HALLO-FCS). Schicht vorsichtig 24 ml der verdünnten Vollblut auf die obere Gradienten des Rohres.
- Zentrifuge bei 700 × g für 30 min bei Raumtemperatur (20 bis 24 ° C) ohne Bremse.
HINWEIS: Die Zentrifugation bei niedrigeren Temperaturen in Zelle Verklumpung und schlechte Erholung führen kann. - Entfernen Sie vorsichtig die Röhrchen aus der Zentrifuge without Störung des Gradienten. Zwei lichtundurchlässigen Schichten sollte (A: Mononukleäre Zellen und B: PMN, dargestellt in Figur 2) beobachtet werden.
- Absaugen und die A. Zahlen Flüssigkeit bis zu 0,5 cm über der Schicht (oder Discard) die Zellen aus dieser Schicht abwerfen, um ein Rohr "Einkernige" gekennzeichnet.
- Absaugen und verwerfen die restliche Flüssigkeit bis zu 0,5 cm über der Schicht B. Übertragen Sie die Zellen, die aus dieser Schicht in ein Röhrchen mit "PMN".
- Pool PMN aus jeweils zwei Gradienten Rohre und wasche mit PBS, enthaltend 2% HALLO-FCS auf ein Endvolumen von 30 ml. Zentrifuge für 12 min bei 200 · g, entfernen Sie den Überstand und entsorgen.
- Um loszuwerden der roten Blutkörperchen (RBC) verunreinigen, 3 ml hypotone 0,2% eiskalter steriler NaCl während das Pellet Resuspendieren von in und mit einer 1 ml sterilen Pipettenspitze sanft zu ziehen. Halten Sie sich auf Eis für 30 sec.
- Nach 30 s wieder her Isotonie durch Zugabe von 3 ml steriler 1,6% eiskaltes NaCl auf das Rohr.
- Zu den 6 ml isotonischer Kochsalzlösung, fügen Sie 6 ml vorgewärmtes (37 ° C) RPMI-1640-Medium mit 2% FCS und HALLO-Zentrifuge für 12 min bei 250 xg ergänzt. Überstand verwerfen. Die PMN-Pellet sollte sauber von RBC Kontamination sein.
HINWEIS: Wenn von RBC kontaminiert, das PMN Pellet rötlich erscheint. - Wenn einige verunreinigende RBC bleiben, wiederholen Sie die Schritte 9 und 10 noch einmal.
- Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml RPMI-1640, ergänzt mit 10% FCS und HALLO-Zellen zählen, um ihre Konzentration und die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt werden.
- Einstellen um die Konzentration auf 1,25 bis 1,5 x 10 6 PMN / ml ( in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen), und die Platte 1,0 ml / Vertiefung in eine 24 - Well - Platte.
HINWEIS: Die Reinheit der Neutrophilen in der Granulozytenpopulation überschritten immer 95%, wie von Grunewald-Giemsa Mai bewertet Färbung und Lichtmikroskopie. - Nach dem Aussäen Platzieren der Zellen in ein befeuchteten 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C.
- Ersetzen Sie alle 3 Tage Medium durch leichtes Ansaugen Hälftedas Medium und Zugabe des gleichen Volumen an frischem RPMI-1640-Medium mit 10% FCS supplementiert HALLO-. Verwenden LPS freie Lösungen und Verbindungen und niedrige LPS Ebenen in HALLO-FCS (0,05 ng / ml oder weniger).
HINWEIS: Eine sanfte Mediumwechsel ist zwingend notwendig, da die Gφ, die in der Kultur entwickeln, um der Kulturschale und kräftiges Waschen nicht fest anbringen kann auch die Entwicklung von Zellen auszuwaschen. Das Auftreten von Gφ fällt bei 3 - 4 Tage nach dem Kultivieren PMN in Abhängigkeit von dem Blutspender. 7 Tage in der Kultur, wenn Gφ in der Größe sehr groß sind - die meisten der Analysen und Assays hier beschrieben sind zwischen 6 ausgeführt. Es sollte beachtet werden, dass die Zugabe von 1 - 10 ng / ml LPS mit dem RPMI-1640-Medium nicht Gφ Entwicklung in der Kultur nicht beeinträchtigte. 14
2. konfokale Laser Scanning Mikroskopie
- Bereiten Cytospins 16 aus frisch isolierten Neutrophilen und aus den 7 Tage entwickelt Gφ Kulturen(Hergestellt in Abschnitt 1).
Hinweis: Um die Konzentration von Gφ in der Schale für verschiedene Analysen erhöhen, sanft die Hälfte des Mediums zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass Gφ nicht in dem entfernten Medium detektiert werden, indem das Medium unter einem Lichtmikroskop untersucht. Dann intensiv pipettieren das restliche Medium leicht haftenden Gφ zu entfernen. Zentrifugieren Sie das Medium für 10 Minuten bei 200 · g, und das Pellet in 100-120 ul Medium.- Verwenden 100-120 ul des Mediums Zellen für jede Folie enthält. Bereiten Sie doppelt oder dreifach Folien aus jeder Behandlung. Spin für 7 min bei 84 x g.
- Trocknen Sie die gesponnenen Zellen und fixieren die Zellen mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 10 Minuten unter einer chemischen Abzugshaube. Wasch 3x mit PBS (~ 100 & mgr; l für einige Sekunden pro Waschung). Für die intrazelluläre Färbung, permeabilisieren Zellen mit 0,5% Triton X-100 in PBS bei Raumtemperatur für 10 min und wasche 5x mit PBS.
HINWEIS: In allen Phasen, entsprechende Puffer / Lösung Volumir den Umfang der Zellen auf dem Objektträger zu bedecken. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift für Zellen Umfang zu bestimmen.
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. - Block-Zellen mit 10% normalem Ziegenserum in RPMI-1640-Medium, und Inkubation über Nacht bei 4 ºC oder bei Raumtemperatur für 40 min. Waschen mit PBS.
- Inkubieren mit einzelnen Antikörper (Ab) oder einer Kombination aus Maus und Kaninchen primären Antikörpern (Abs) bei einer 1: 100 Verdünnung (~ 100 & mgr; l). Inkubieren über Nacht (18 bis 20 h) bei 4 ° C.
HINWEIS: Hier monoklonalen Maus - Abs enthalten: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b, anti-CD1c, anti- CD15 und Anti-Cytochrom - b-245 - Leichtkette (p22- phox identification). Kaninchen polyklonales Abs enthalten: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B, anti-Myeloperoxidase, anti-Neutrophilen - Elastase (NE) und anti-Nox2 / gp91- phox Abs. Isotypkontrollen enthalten gereinigtes Maus-IgG1 und IgG2 und Kaninchen-IgG. prepare die ABS-Anweisungen des Herstellers und nach Anwendung einer geeigneten Volumen (ungefähr 100 & mgr; l), um den Umfang der Zellen abzudecken. - Waschen Sie die Zellen und Inkubation mit 1/400 Sekundärantikörper Cy2-CF (488A) -konjugierte Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (grün) und / oder Cy5 (CF 647) -konjugierte Ziege-anti-Maus-IgG (rot) bei Raumtemperatur für 40 Minute
HINWEIS: Verdünnen und bereiten Abs gemäß den Anweisungen des Herstellers. - Nach dem Waschen montieren Folien mit einem Tropfen Eindeckmedium, mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) für die Kernfärbung, dann sofort den Deckel Schein legen.
- Analysieren Sie die Folien mit einem konfokalen Laser-Scanning-System unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop und Plan Apo 40X Sionsöl Ziel. Führen Sie die Analyse innerhalb von 30 min bis 2 h nach der Herstellung der Folien oder halten bei 4 ° C über Nacht.
- Berechnen Sie den Zellbereich und die Fluoreszenzintensität unter Verwendung einer Imaging - Software (zB Bild J). Für die Co-Lokalisierung, quantify unter Verwendung von Software Manders Overlap Koeffizient (MOC) 17.
HINWEIS: Nur Zellen mit MOC> 0,6 kann als Zellen mit signifikanten Co-Lokalisierung in Betracht gezogen werden.
- Berechnen Sie den Zellbereich und die Fluoreszenzintensität unter Verwendung einer Imaging - Software (zB Bild J). Für die Co-Lokalisierung, quantify unter Verwendung von Software Manders Overlap Koeffizient (MOC) 17.
3. Transmigration von PMN Über Endothelial Cells: Auswirkungen von IL-8 auf Riesen Phagocyte (Gφ) Bildung
HINWEIS: Die Verwendung von 24-Well-durchlässige Zellkultur-Einsätze für die Zelltransmigrationsassay.
- Bestreichen Sie die obere Kammer des Einsatzes mit 150 & mgr; l Fibronektin mit einer Konzentration von 50 ug / ml, und halten bei Raumtemperatur für 30 min.
- In der oberen Kammer 5 x 10 4 EA.hy926 endothelialen Zellen / Vertiefung, resuspendiert in 150 ul formuliert Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (vollständige Wachstumsmedium).
Stellen Sie sicher, dass die endotheliale Monoschicht konfluent vor: Anmerkung. - Um die untere Kammer, fügen Sie 700 ul des gesamten Wachstumsmedium.
- Legen Sie die durchlässigeZellkultureinsätze in Clusterschalen und die Kultur EA.hy926 Endothelzellen für 2 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2.
HINWEIS: Parallel dazu am zweiten Tag frisch zubereiten PMN (wie in Abschnitt 1 beschrieben). - Nach 2 Tagen das Medium in den unteren und oberen Kammern der Einsätze ersetzen.
- In die untere Kammer, fügen RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% FCS-IH und Interleukin (IL) -8 in einer Endkonzentration von 50 nM / ml. Fügen Sie nicht IL-8 an der unteren Kammer zu steuern.
- Zu jeder oberen Kammer, mit 10 6 frische PMN in 100 ul RPMI-1640 - Medium mit 10% IH-FCS ergänzt.
- Inkubieren der Clusterschalen bei 37 ° C in 5% CO 2 für 90 min.
- Nach 90 min Inkubation, entfernen Sie die Zellen aus dem oberen und unteren Kammern getrennt und jede Subpopulation zählen. Express-Zellen in jeder Kammer als Prozentsatz der gesamten Zellen zugegeben.
HINWEIS: Entfernen Sie vorsichtig Zellen aus dem oberen chamber durch vorsichtiges Pipettieren, um Endothelzellen Entfernung zu vermeiden und in ein steriles Röhrchen übertragen. Entfernen der Zellen aus der unteren Kammer durch Pipettieren und wäscht die untere Kammer mit 500 & mgr; l und in ein zweites steriles Röhrchen. - Pool 10 6 Zellen aus mehreren Vertiefungen transmigrating (untere Kammer) und nicht-migrierenden (obere Kammer) PMN - Fraktionen und Kultur jeder für 7 Tage ohne Wachstumsfaktoren wie in den Schritten angegebenen 14 bis 16 (Absatz 1).
- Spin - Zellen auf Objektträger 16 und zu analysieren , um die entwickelten Zellen in jeder Kultur Zustand durch konfokale Mikroskopie , wie in Kapitel 2 beschrieben.
Representative Results
Neutrophile Autophagozytose und Entwicklung in Kultur
Neutrophil autophagocytosis und deren Entwicklung in Gφ innerhalb von 7 Tagen in Kultur ist in den 3 und 4 gezeigt. Nach Tagen 4 bis 7, war ihre Größe stark vergrößerte, 15 und autophagosytosis war offensichtlich schon 90 Minuten nach der Co-Kultivierung der neutrophilen Granulozyten mit fluoreszierenden Membranflecken (PKH-26, rot; PKH-67, grün). 14 Als Kontrolle dieser neutrophilen Subpopulation wurden einige Neutrophilen Kulturen auch mit GM-CSF / IL-4 behandelt. Die Cytokin-behandelten Zellen erhöht in Größe innerhalb von 7 bis 14 Tagen in Kultur, wie vorstehend beschrieben. 18, 19 aber kleiner waren als Gφ und hatte zytoplasmatische Projektionen ähnlich DC-ähnliche Zellen (Abbildung 5), wie zuvor berichtet b y Oehler et al. 19 Auch die GM-CSF / IL-4 behandelten Zellen waren negativ oder einen niedrigen CD66b Ausdruck hatte, 15 deutlich zeigt , morphologische und potenziell funktionelle Unterschiede.
Abbildung 3: Autophagozytose in der Entwicklung von Riesenfresszellen (Gφ) in Kultur. Frisch isolierte gereinigte Neutrophile wurden zum Zeitpunkt Null mit PKH-67 (grün) oder PKH-26 (rot) -Membran Fluoreszenzfarbstoffen markiert, und dann co-kultiviert und zu sieben Tagen verfolgt. Die Zellen wurden auf Glasobjektträger versponnen, Kerne wurden mit DAPI gefärbt und die Proben wurden durch konfokale Mikroskopie analysiert. Autophagozytose ist bereits spürbar nach 90 min von Co-Kultur. Zusammenführen von Rot und Grün in Gelb und Orange ist in der Entwicklung von Gφ deutlich zu erkennen.files / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Entwicklung der Riesen Phagozyten (Gφ) in Kultur. Frisch isolierte gereinigte Neutrophile wurden zu 7 Tage in Kultur weiterverfolgt. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitintervallen auf Glasobjektträger gesponnen, gefärbt mit Mai Grunewald-Giemsa, und mit einem hellen Feldmikroskopie analysiert. Eine Person mit wenigen Eosinophilen ist zum Vergleich dargestellt. Man beachte, dass die Größe von Eosinophilen in Kultur unverändert bleibt. Vergrößerung 100X Öl. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Vergleich zwischen der Entwicklung von Riesenfresszellen (G φ) und GM-CSF / IL behandelten Neutrophilen in Kultur. (A) May Grunwald-Giemsa gefärbten Neutrophilen , kultiviert ohne (Gφ) und mit GM-CSF / IL-4 für 7 Tage. Die Proben wurden mit einer Hellfeldmikroskopie analysiert. Vergrößerung, X40. Die Zellen in Kulturen mit Medium mit GM-CSF / IL-4 zeigen weit verbreitete zytoplasmatische Projektionen ergänzt entwickelt, sind aber kleiner als Gφ. (B) Frisch isolierte Neutrophilen wurden mit PKH-26 (rot) Farbstoff und kultiviert in Cytokin-freiem Medium markiert für 7 Tage oder markiert mit PKH-67 (grün) Farbstoff und kultiviert in Medium , das mit GM-CSF / IL-4 für 7 Tage. für 2 h 1-Verhältnis und co-kultiviert: Dann wurden die entwickelten Zellen in einem Verhältnis von 1. Zellen wurden durch konfokale MICR fixiert und analysiert,oscopy. Diese Zahl wurde von Referenz modifiziert. 15 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Um den Verlauf der Gφ Entwicklung zu untersuchen, ihre morphologischen Veränderungen wurden auch von Zeitraffer-Mikroskopie gefolgt. Video-1 (Tag 3 bis Tag 4) und Video-2 (Tag 4 bis Tag 5) zeigen ihre Entwicklung in gereinigten Neutrophilen-Kulturen. Diese Gφ sind nicht haftenden oder leicht haft mit begrenzten Bewegungskapazität und aktiv aufnehmen umgebenden Neutrophilen Reste und Schmutz. In Video-3, die Bewegung von Monozyten abgeleiteten M & phi; und Gφ wird in einer gemischten Monocyten / Neutrophilen Kultur verglichen. Die M & phi; kriecht aktiv (links, unmarkierten Zelle). Die Gφ (rechts), ist hell PKH-26 markierten Zelle.
Video-1: Demonstriert die Entwicklung von Riesen Phagozyten in Gereinigte PMN Kulturen an den Tagen 3-4 von Zeitraffer-Mikroskopie. Neutrophile wurden Follow-up in der Kultur von Tag 3 bis Tag 4 durch Zeitraffermikroskopie Zeitraffer-Mikroskopiesystem wird von invertierten motorisierten Fluoreszenzmikroskop zusammengesetzt und eine hohe Auflösung B / W CCD-Kamera, mit einem auf der Bühne Inkubator. Bildaufnahme Erwerb von Zeitraffer wurde alle 10 Minuten genommen. Ursprünglich in Bezug veröffentlicht am 14. Bitte hier klicken , um dieses Video anzusehen.
Video-2: Demonstriert die Entwicklung von Riesen Phagozyten in Purified PMN Kultur an den Tagen 4 - 5 von Time-lapse Mikroskopie. Neutrophile wurden in der Kultur von Tag 4 bis Tag 5 von Zeitraffer-Mikroskopie nachgegangen. Die Zeitraffer-Mikroskopiesystem wird von invertierten motorisierten Fluoreszenzmikroskop zusammengesetzt und eine hohe Auflösung B / W CCD-Kamera, mit einem auf der Bühne Inkubator. Bildaufnahme Erwerb von Zeitraffer wurde alle 10 Minuten genommen. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen.
Video-3: Ein Riesen - Phagozyten und Makrophagen Entwickelt in Co-Kultur. Monozyten / Neutrophilen Co-Kultur wurde von Tag 4 bis Tag 5 von Zeitraffer-Mikroskopie nachgegangen. Monozyten abgeleiteten Makrophagen (links); hell (PKH-26 gefärbte Zelle) Neutrophilen stamm Riese Phagozyten (rechts). Die Zeitraffer-Mikroskopiesystem für Video wird von invertierten motorisierten fluoreszierenden micr zusammengesetztOscope und eine hohe Auflösung B / W CCD-Kamera, mit einem auf der Bühne Inkubator. Bildaufnahme Erwerb von Zeitraffer wurde alle 10 Minuten genommen. Ursprünglich in Bezug veröffentlicht am 14. Bitte hier klicken , um dieses Video anzusehen.
Expression von Markern im Riesen Phagozyten
Die neutrophilen Ursprung Gφ wurde durch positive Expression der folgenden Marker neutrophil CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (Abbildung 6) verifiziert. Die Gφ äußerte auch NADPH - Oxidase, die oxLDL Scavenger - Rezeptoren - CD68 und CD36 und enthielt LC3B beschichteten Vakuolen und Aggregate (identifiziert durch Western - Blot als LC3BII 15), um das Vorhandensein eines Autophagie Markierung zeigt. Allerdings waren sie negativ für monozytären Linie (CD14, CD16 und CD163) und dendritic-Zellen (CD1c und CD141) Marker, was darauf hindeutet, dass Gφ nicht verunreinigen Monozyten entstanden sind.
Abbildung 6: Expression verschiedener Marker für Neutrophile, Monozyten und Dendritischen Zellen im Riesenfresszellen (Gφ) nach 7 Tagen in Kultur. Positive Ausdruck der neutrophilen spezifischen Granulat Marker CD66b, die azurophile Granulat Marker CD63 und MPO, neutrophile Elastase und CD15. Negative Ausdruck für die dendritischen CD1c und CD141-Markern und monozytären Linie Marker CD14, CD16 und CD163. Zusätzlich Gφ die Autophagie Marker LC3B ausgedrückt, die Scavenger-Rezeptoren CD68 und CD36 und die NADPH-Oxidase-Untereinheiten gp91-phox / p22-phox Untereinheiten. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt, und die Proben wurden durch konfokale Mikroskopie analysiert. Diese Zahl wurde von Referenzen geändert. 14 15 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Funktionen von Gφ - NADPH-Oxidase-Aktivierung, ROS-Produktion und Phagozytose:
Die Phagozytose von Latexkügelchen und opsonisierter zymosan war offensichtlich in Gφ. Gφ auch basal ROS (7A) erzeugt und reagierte auf Zymosan und PMA - Stimulation durch oxidative burst (7B-D). Jedoch anders als Monozyten oder Neutrophile, erzeugt Gφ ROS auch als Reaktion auf oxLDL Stimulation und wurden von Oil Red O (7B, F) gefärbt. Zu beachten ist, Behandlung von frischen Neutrophilen mit der NADPH-Oxidase-Hemmer - DPI hemmte nicht nur ROS-Produktion, sondern auch prevented Gφ Bildung in Kultur, was darauf hindeutet, dass ROS Signalisierung für Gφ Bildung von wesentlicher Bedeutung ist. 14, 15
Abbildung 7: Oxidativer Burst, Phagozytose und oxLDL Uptake von Giant Phagozyten (Gφ). (A) Basal ROS - Produktion zeigt sich in den Lysosomen von Gφ. (B) ROS - Produktion in Reaktion auf oxidiertem LDL (oxLDL), PMA und Zymosan (Zymosan Teilchen sind deutlich vermerkt). (C) Nitroblautetrazolium (NBT) Test in Gφ respiratorischen Burst - Aktivität zeigt , ohne und mit PMA (Folien sind ungefärbt, aber die Einsätze sind gefärbt mit May Grunwald-Giemsa). (D) NBT - Test und Mai Grunewald-Giemsa gefärbt Gφ mit PMA und PMA / DPI , die NADPH - Oxidase und ROS gehemmt. (E) Phagozytose von LATEX- und IgG-opsonisierter Zymosan in PKH-26 (rot) gefärbten Zellen. (F) Oil Red - O - Färbung in unbehandeltem und oxLDL behandelten Gφ. Diese Zahl wurde von Referenzen geändert. 14, 15 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Auswanderungs von PMN Über Endothelial Cells
Um potenzielle Neutrophilen Subpopulationen zu identifizieren , die in Gφ entwickeln könnte, wurde die Migration von Neutrophilen durch endotheliale Zellmonolayern bestimmt (8A). Nach 90 min, 62,3 ± 12,2% der Neutrophilen transmigrierten durch Endothelzellen gegenüber IL-8 in der unteren Kammer. Zu beachten ist , Gφ positiv für CD66b / CD15 / LC3B nur von der transmigrierten Population von Neutrophilen , während die Zellen entwickelt , die aus dem nicht-migrierenden Neutrophilen Fraktion entwickelt waren kleiner und negativ für die neutrophile Marker CD66b / CD15 (8B, 8C) .
Abbildung 8: Auswirkungen von IL-8-abhängigen PMN Auswanderungs Durch Endothelial Cells auf Riesen Phagocyte (Gφ) Bildung. (A) Ein Schema zeigt , Neutrophilen Trans Assay über endotheliale Zellmonolayern (ECs) in Richtung IL-8. Dieser Test kann als Modell für die Neutrophilen Rekrutierung zu akuten Entzündungsstellen in Betracht gezogen werden. (B - C) in der Zellmigration Test (angegeben in Protokoll 3), transmigrating (B) und nicht migrierende (C) Neutrophile Fracgen wurden ohne Wachstumsfaktoren für sieben Tage kultiviert (wie in Protokoll 1). Dann wurden die Zellen auf Glasobjektträger gesponnen und durch konfokale Mikroskopie analysiert. Die fixierten Zellen wurden für CD66b (rot) gefärbt, LC3B (grün) und CD15 (rot). Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Riesen Phagozyten (Gφ) sind eine neu definierte Subpopulation von Neutrophilen stammenden Zellen, die grundlegenden und spezifischen neutrophilen Marker wie CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Diese Art von Neutrophilen stamm Phagozyten wurde vorher nicht in der Literatur beschrieben. Im Gegensatz zu Neutrophilen, die von kurzer Dauer sind und Apoptose, Gφ sind Annexin-V-negativ und erweiterte Lebensdauer angezeigt. Doch wie Neutrophile, Gφ auch Partikel internalisieren und NADPH-Oxidase-abhängige ROS in Reaktion auf diese Partikel und PMA erzeugen. Doch ihre Fähigkeiten OxLDL- zu internalisieren und damit ROS sind einzigartige Eigenschaften von Gφ herzustellen. 14
Eine Anzahl von Faktoren wurde gezeigt, ihre Entwicklung in der Kultur zu beeinflussen. Das Fehlen von externen Cytokine oder Wachstumsfaktoren in das Wachstumsmedium ist wesentlich (insbesondere GM-CSF / IL-4). Allerdings Neutrophilen Migration zu IL-8 erwies sich als ein Unterscheidungsfaktor zwischen denen, die developed in Gφ und diejenigen, die dies nicht taten. Auch Internalisierung von Schmutz von apoptotischen Neutrophilen ergeben, die Expression von Proteinen autophagy (LC3B) und funktionellen NADPH - Oxidase, wurden alle für ihre Entwicklung zu sein , zwingend notwendig gezeigt, da ihre Hemmung Gφ Bildung (Figur 1) verhindert. Offensichtlich unterscheidet sich von der Charakterisierung Riesenzellenbildung in der Monozyten / Makrophagen-Linie die Entwicklung dieser Riesenzellen von Neutrophilen ergeben. Die letztere Form mehrkernige Riesenzellen mit verschiedenen chronischen entzündlichen Erkrankungen, 20, 21 , während die neutrophilen Gφ hier beschriebenen via autophagocytosis entwickeln, durch Zellresten verschlingt und bleiben meist mono nukleiert während ihrer Entwicklung, 14 (selten jedoch manchmal ein zweiter Kern beobachtet werden kann). Darüber hinaus wird eine Reihe von Prozessen zur Kontrolle ihrer neutrophilen Herkunft: (1) expression der spezifischen neutropilic Marker und Abwesenheit von dendritischen und monozytären Linie Marker, (2) ihre behindert Entwicklung in Monozyten / PMN Kokulturen, (3) die unterschiedlichen Bewegungsmustern in Kultur von Makrophagen (wie von lebenden Zellen und der Zeit belegt -lapse Mikroskopie), 14 (4) ihr Licht Einhaltung Plastikschalen und (5) , um ihre Entwicklung von der reinen CD15 + / CD14 - PMN mittels Durchflusszytometrie erworben.
Einige der Funktionen in-vitro identifiziert kann uns Hinweise auf ihre mögliche Funktionen in vivo. Zum Beispiel verbrauchen die Fähigkeiten der Gφ zu große Mengen an Neutrophilen Granulaten und Schutt, die Gegenwart von großen Vakuolen, und der Ausdruck LC3B - ein autophagy Protein , welches Entzündungen durch regulatorische Wechselwirkungen mit angeborenen Immunsignalwege zu vermindern beiträgt, 22 - von denen alle Unterstützung Fänger Fähigkeiten. So wieAuch diese Ergebnisse zeigen, dass Gφ könnten an Entzündungsstellen fungieren, wo die M & phi; / DC-System nicht ausreichend oder überfordert ist, und damit zur Auflösung der Entzündung beitragen. Dieser Begriff könnte durch die Tatsache gestützt, dass in gemischten Monozyten / Neutrophilen Kulturen Gφ Entwicklung behindert. 14 Auch da Gφ oxLDL - Scavenger - Rezeptoren exprimieren (CD36, CD68), internalisieren oxLDL und produzieren ROS in Reaktion darauf, kann darauf hindeuten , dass sie in atherosklerotischen Prozessen beteiligt sind Entzündungen zu lösen. Da Gφ nur von Neutrophilen entwickelt, die gegenüber IL-8 migriert, und Trans 'Neutrophilen über endotheliale Monolayern auf IL-8 Neutrophilen-Rekrutierung zu akuten Entzündungsstellen darstellt, kann dieser Befund auch entzündungshemmende Funktionen unterstützen. Umgekehrt könnte die Leistung Gφ in bestimmten Entzündungszuständen ermöglichen sie Granulatbestandteile und ROS zu entladen, damit zur Pro beitragEinklang Entzündung und Gewebeschädigung. 20 jedoch insgesamt ihre autophagischen Fähigkeiten zeigen , dass Gφ wahrscheinlich bei der Verminderung der Entzündungsreaktion beteiligt sind , anstatt zu verewigen es.
Interessanterweise haben wir vor kurzem die Anwesenheit von Gφ in menschlichen arteriosklerotischen Plaques identifiziert. (in Vorbereitung). Dennoch bleiben eine große Anzahl von Fragen entwirrt werden. Zum Beispiel sind Gφ pro- oder anti-inflammatory? Was sind die Faktoren , die ihre Bildung und Funktion in vitro oder in vivo zu bestimmen? Welche spezifischen neutrophilen Subpopulation ist ihre Vorläuferzelle, die ihre Entwicklung in Gφ erleichtert? Sind sie im Zusammenhang mit bestimmten Krankheiten und welche? Zusammengefasst posiert interessante Fragen nach ihrer Herkunft und mögliche Funktionen.
Allerdings kritischen Schritte und Fallen innerhalb des Protokolls sollte im Auge behalten werden. Ein entscheidender Schritt bei der Entwicklung von Gφ is die reinen Neutrophilen in Medium ohne Cytokine, Wachstumsfaktoren oder Antibiotika kultiviert werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist, um auszuschließen, dass Gφ verunreinigen Monozyten entwickeln und die neutrophile Ursprung Gφ zu ermitteln. Somit wird nach der Bluttrennung durch diskontinuierliche Gradient wurden die Neutrophilen weiter einen zusätzlichen Schritt der Reinigung durch Strom ausgesetzt cytometry Granulozyten Gating verwenden und CD15 + / CD14 - Markierungen. Das entwickelte Gφ aus Neutrophilen erhalten, die weiter durch Durchflusscytometrie Trennung gereinigt wurden nicht von denen unterscheiden, die nicht zu dieser Reinigungsschritt unterzogen wurden. Daher sind die meisten der Experimente wurden ohne die Durchflusszytometrie Schritt der Reinigung durch zusätzliche Zellverlust durchgeführt. Bemerkenswert ist, in einigen seltenen Fällen wurden einige Eosinophilen in Kultur zur Kenntnis genommen. Ihre Größe blieb unverändert in der gesamten Kulturdauer. Wir sollten auch beachten, dass, obwohl es eine Reihe von Methodenfür neutrophile Trennung von menschlichem Blut, das hier beschriebene Verfahren ist die einzige Methode, die wir verwendet, und deshalb können wir nicht Gφ Entwicklung durch andere verfügbare Methoden für die Neutrophilen-Trennung zu vergleichen.
Ein wesentlicher pitfall Gφ bei der Untersuchung ergibt sich aus der Unfähigkeit, eine ausreichende Zahl von reinen Gφ Bevölkerung geeignet für verschiedene biochemische Assays zu erhalten. Es ist im Grunde unmöglich, unter den Bedingungen unsere Experimente durchgeführt wurden. Erstens ist die Ausbeute an Gφ gering. Von 1,0 x 10 6 PMN ausgesät etwa 100-200 Gφ nach sieben Tagen in der Kultur entwickeln, in Abhängigkeit von dem Blutspender. Zweitens ist es grundsätzlich schwierig, im Moment des entwickelten Gφ in der Kultur von der übrigen Neutrophilen Trümmer in der Schale zu trennen. Diese Einschränkungen war es praktisch unmöglich, die Zellen, die durch biochemische oder molekularbiologische Verfahren zu analysieren. Daher wird dieses Protokoll zu beschreiben Gφ Identifikation und Funktion fokussiert unter Verwendung von Lichtund konfokaler Mikroskopie. Ihre morphologische Transformation von Neutrophilen in Gφ in Kultur wurde auch von Live Cell Imaging und Zeitraffer-Mikroskopie gefolgt. Offenbar 14, viel größere Blutmengen können erforderlich sein , um biochemische oder molekularbiologischen Methoden zu implementieren und die niedrige Ausbeute erhalten und das Abtrennen des tragfähigen Gφ von Neutrophilen 'Schutt in die Schüssel zu überwinden.
Zusammenfassend haben wir zum ersten Mal die Entwicklung von Gφ in Kultur, um eine Subpopulation von langlebigen Phagozyten neutrophiler Abstammung kürzlich beschrieben. Daher ist dies die einzige Methode, die derzeit verfügbar Gφ in Kultur zu erhalten, obwohl die beiden großen oben genannten Einschränkungen zu überwinden werden soll (die geringe Ausbeute des Gφ erhalten in der Kultur und die Unfähigkeit, die entwickelt Gφ aus der Neutrophilen Schmutz in der Kultur zu trennen Gericht). Noch, ihre Herstellung und Identifizierung, in diesem Protokoll dargestellt ist essential für Wissenschaftler in Entzündungsreaktionen und Neutrophilen Biologie und Plastizität interessiert, um die potenzielle Bedeutung und Funktionen von Gφ weiter zu untersuchen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Edith Suss-Toby für ihre unschätzbare Hilfe bei den konfokalen Mikroskopie Studien. Diese Studie wurde durch das Ministerium für Immigration Absorption und des Ausschusses für Planung und Budgetierung des Rates für Hochschul im Rahmen des Kamea Programm (LD und AP) unterstützt. Wir erkennen auch dankbar die Unterstützung des Research Fellow von der Lady Davis Foundation Post-Doctoral Research Fellowship (OR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile scalp vein set (21GX3/4) | Bio Diagnostics Ltd. | # 20080312 | A strile needle for venipancture |
| VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP | Greiner Bio-One | # 450263 | For securing during venipuncture |
| VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL) | Greiner Bio-One | # 455036 | Sterile tube for blood collection |
| Nunclon MultiDish (24 well x 1 ml) | Thermo Scientific | # 142475 | |
| Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml) | Greiner Bio-One | # E14103PJ | |
| Transwell-24 well (transmigration assay) | Corning | # CA-3415 | Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores) |
| RPMI-1640 medium | BioIndustries | # 01-100-1A | Do not add antibiotics |
| EA.hy926 (ATCC CRL2922) | BioIndustries | # CRL-2922 | |
| ATCC-formulated Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | BioIndustries | # 302002 | complete growth medium |
| Polysucrose - Histopaque1119 | Sigma-Aldrich | # 1119-1 | Tissue culture grade |
| Polysucrose - Histopaque1077 | Sigma-Aldrich | # 1077-1 | Tissue culture grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) - ion free | BioIndustries | # 02-023-1A | Cell biology and molecular biology grade |
| Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS) | BioIndustries | # 04-121-1B | Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS |
| NaCl | Sigma | # S3014 | Molecular biology grade, suitable for cell culture |
| Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | # 15710 | Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | # 9002-93-1 | Molecular biology grade |
| Normal Goat Serum | BioIndustries | # 04-009-1 | Cell biology and molecular biology grade |
| Trypan blue | BioIndustries | # 031021B | Tissue culture grade |
| May-Grünwald | Sigma-Aldrich | # MG500 | Cell biology grade-(procedure No GS-10) |
| Giemsa stain Kit | Sigma | # 48900 | Cell biololgy grade-(procedure No GS-10) |
| Fibronectin | BioIndustries | # 03090105 | |
| Human Interleukin-8 (CXCL8) | PeproTech | # 200-08-5 | |
| Anti-CD14 (clone 5A3B11B5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-58951 | Mouse IgG2b; expressed by monocytes |
| Anti-CD63 (clone MX-49.129.5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-5275 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
| Anti-CD66b (clone 80H3) | AbD Serotec | # MCA216 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
| Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-090-695 | Mouse IgG2a; expressed by dendritic cells |
| Anti-CD15 (clone MY-1) | Abcam | # ab754 | Mouse IgM; expressed by neutrophils |
| Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1) | BioLegend | # 650001 | Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex |
| Anti-CD68 | Protein Tech | # 16192-1-AP | Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor |
| Anti-LC3B | Sigma | # L7543 | Rabbit IgG |
| Anti-Myeloperoxidase | Abcam | # ab45977 | Rabbit IgG |
| Anti-Neutrophil elastase | Calbiochem | # 481001 | Rabbit IgG |
| Anti-NOX2 (gp91-phox) | Abcam | # ab131083 | Rabbit IgG |
| Anti-CD36 (SR-B3) | Novus Biologicals | # NB400-144 | Rabbit IgG |
| Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45) | BioLegend | # 401401 | Antibody used as isotype control |
| Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173) | BioLegend | # 400263 | Antibody used as isotype control |
| Normal rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-2027 | Antibody used as isotype control |
| CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20012 | Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A |
| CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20043 | Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647 |
| CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20010 | Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A |
| CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20040 | Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647 |
| Fluorescent Mounting Medium with DAPI | Vectashield H-1000; Vector Lab Inc. | # E19-18 | Nuclear staining |
| Confocal laser scanning microscope (LSM 700) | Carl Zeiss | Ser.# 3523000380 | Plan Apo 40X immersion oil objective |
| Zeiss CLSM software (ZEN 2010) | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 6.0 | For colocalization analysis |
| ImageJ software | Wayne Rasband, NIH, USA | version 1.49k | For determination of cell areas and fluorescence intensity |
| Light microscope (Axiovert 25) | Carl Zeiss | Ser.# 201060153 | Examination of cells in culture |
| Centrifuge (Megafuge 1.0 R) | Heraeus Instruments | # D-37520 | Cells separation from blood; cytospins preparation |
| Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1) | Carl Zeiss | Ser.# 3834001470 | Demonstration of giant phagocytes development |
| Temperature-controlled incubation system (Cube&Box) | Life Imaging Services | Temperature control system for microscopes | |
| High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm) | Carl Zeiss | Ser.# 117090279 | For capturing high-contrast image data from an examined cell objects |
| Hydrophobic barrier pen (Elite PAP Pen) | Diagnostic Biosystems | # K039 | For defining cell perimeter for immunoflourescence staining |
References
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