Abstract
Les biofilms sont considérés comme l'un des sujets les plus difficiles de la biomédecine moderne, et ils sont potentiellement responsables de plus de 80% des infections aux antibiotiques tolérantes. Les biofilms ont fait preuve d'une tolérance exceptionnelle pour la chimiothérapie, qui est considérée comme multifactorielle. Par exemple, la matrice constitue une barrière physique qui diminue la pénétration des antibiotiques dans le biofilm. En outre, les cellules au sein des biofilms sont phénotypiquement diverses. Probablement, biofilm résilience résulte d'une combinaison de ceux-ci et d'autres mécanismes, encore inconnus,. Tous les antibiotiques actuellement existants ont été mis au point contre les cellules-simples (planctoniques) bactéries. Par conséquent, jusqu'à présent, un répertoire très limité de molécules existe qui peut agir sélectivement sur les biofilms matures. Cette situation a entraîné un changement de paradigme progressiste dans la découverte de médicaments, dans laquelle rechercher les anti-biofilms a été invité à occuper une place plus importante. Un défi supplémentaire est qu'il yanombre de méthodes normalisées pour la recherche de biofilm, en particulier ceux qui peuvent être utilisés pour le criblage à grande débit de banques chimiques très limitée. Ici, une plate-forme anti-biofilm expérimentale pour le dépistage chimique est présenté. Coloration de la N - acétyl-glucosamine poly- PNAG base WGA-fluorescence , il utilise trois essais pour mesurer biofilm viabilité (avec résazurine coloration), la biomasse totale (avec coloration au cristal violet) et la matrice du film biologique ( en utilisant une agglutinine de germe de blé, , fraction). Tous les dosages ont été développés en utilisant Staphylococcus aureus que les bactéries du modèle. Des exemples de la façon dont la plate-forme peut être utilisée pour le criblage primaire, ainsi que pour la caractérisation fonctionnelle des résultats anti-biofilm identifiés sont présentés. Cette séquence expérimentale permet en outre la classification des résultats sur la base des points finaux mesurés. Il fournit également des informations sur leur mode d'action, en particulier sur le long terme par rapport aux effets chimiothérapeutiques à court terme. Par conséquent, il est très avantageous pour l'identification rapide des composés à succès de haute qualité qui peuvent servir de point de départ pour diverses applications biomédicales.
Introduction
Les bactéries peuvent basculer entre les deux modes de vie très différents, planctoniques et sessiles, dont un biofilm est l'exemple le plus commun. En biofilms, les bactéries forment des communautés structurées noyées dans une matrice auto-produit 1. Cette matrice auto-produit est une barrière entre les bactéries et leur environnement extérieur, et il protège les cellules microbiennes, en les gardant à proximité. La composition de la matrice du biofilm varie entre et au sein même espèce, mais il est principalement constitué d'un réseau serré de lipopolysaccharides, de l'ADN extracellulaire, et des protéines. La matrice sert de barrière physique , l' inhibition de l'entrée d'agents nocifs, mais protège également le biofilm de la déshydratation et empêche les nutriments de fuite de la cellule 2.
Les biofilms sont considérés comme l' un des sujets les plus difficiles de la biomédecine moderne, et ils sont prétendument responsables de plus de 80% des infections aux antibiotiques tolérantes 3. Ils DISPétablir une tolérance intrinsèquement élevée contre les menaces extérieures: l' humidité, la pression osmotique, stress mécanique 4, chaleur, rayonnement UV 5, désinfectants, agents antimicrobiens, et le système immunitaire de l' hôte 1. Par exemple, la concentration en agent antimicrobien requis nécessaire pour tuer un biofilm a été montré que jusqu'à 1000 fois plus élevée par rapport à celle requise pour tuer les bactéries planctoniques. L'explication de cette plus grande tolérance semble être multifactorielle. La matrice constitue une barrière physique qui diminue la pénétration des antibiotiques dans le biofilm. En outre, les cellules au sein des biofilms sont phénotypiquement divers; leur transition entre les différents états métaboliques dus à un gradient existant de l' oxygène, des substances nutritives et des métabolites entre les parties intérieure et extérieure du biofilm 6. Par conséquent, dans certaines régions du biofilm, comme le noyau, les bactéries sont privées d'oxygène et de nutriments et vivent dans un métaboliquement moins actif ou un état complètement dormantes
D'un méthodologperspective ical, des défis supplémentaires existent, car seul un nombre limité de méthodes de biofilm ont été développés par des organisations de normalisation, en particulier celles qui sont applicables au criblage à haut débit de banques chimiques. Tous les tests standardisés (avec une seule exception) sont basées sur des réacteurs biofilm, et ces méthodes nécessitent d' importants volumes de travail et de grandes quantités de composés à tester, qui sont généralement indisponibles pendant la phase d' investigation précoce 9-12. Le dosage de criblage standard applicable seulement existant est le soi-disant dispositif de Calgary biofilm, à partir de laquelle le système disponible dans le commerce de concentration de l' élimination du biofilm minimale (MBEC) est développé 13-15. Cependant, la limitation de ce test est que les biofilms sont cultivées sur des piquets, et non pas toutes les espèces bactériennes ou même des souches de la même espèce sont capables de former des biofilms sur cet appareil. En outre, les méthodes qui peuvent être particulièrement appliqués à l'exploration de composés naturels sontnécessaire. Les produits naturels ont été la principale source d'innovation dans la découverte de médicaments antimicrobiens au cours du siècle 16. Ils peuvent fournir des composés anti-biofilm nouveaux avec des mécanismes d'action uniques qui peuvent aussi être efficaces contre les cellules Persister. Ainsi, l'exploration des bibliothèques naturelles et d'inspiration naturelle a de fortes chances de produire des pistes anti-biofilm prometteurs et uniques.
Ici, nous présentons les détails expérimentaux d'une plate - forme d'essais qui a été développé pour le criblage chimique des composés anti-biofilm utilisant trois essais pour mesurer les effets sur la viabilité, la biomasse totale, et de la matrice de biofilms Staphylococcus aureus. Le premier essai mesure biofilm viabilité et elle est basée sur la coloration résazurine. La résazurine est un colorant d'oxydo-réduction qui est bleu et non fluorescent dans son état oxydé et se transforme en rose de la résorufine, fortement fluorescent lorsqu'il est réduit par l'activité métabolique des bactéries. Il est un m très simple et rapideéthode appropriée pour des projections primaires 17-20. Le deuxième essai, sur la base de coloration au cristal violet, mesure la masse de biofilm totale. Le cristal violet est une tache largement utilisée pour étudier les bactéries et les bactéries dans les biofilms 19,21-23. L'essai est basé sur des réactifs peu coûteux et a une lecture simple absorbance final. Enfin, le troisième test cible la substance polymérique extracellulaire (EPS) -MATRIX du biofilm au moyen d' agglutinine de germe de blé (WGA), qui se lie spécifiquement au poly- résidus de N - acétyl-glucosamine (PNAG) présents dans la matrice du biofilm 24 staphylocoques. WGA est conjugué à un fluorophore qui peut être détectée en utilisant des lecteurs d'intensité de fluorescence 25. Nous présentons ici les raisons et les détails de la plate-forme que nous avons développé, y compris des exemples d'applications.
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Protocol
1. Faire croître les bactéries
- Pré-culture les bactéries durant la nuit dans un bouillon de soja tryptique (TSB) à 37 ° C avec 220 rpm agitation (16-18 h).
- Diluer la pré-culture 100-1,000 fois ( en fonction du taux des bactéries de croissance; ici, 1000 fois est utilisé pour S. aureus) dans l' eau douce du BST et de le laisser grandir à 37 ° C et 200 tours par minute pour atteindre une croissance exponentielle (optique densité à 595 nm (DO 595) entre 0,2 et 0,6).
REMARQUE: Cette étape nécessite une optimisation spécifique à la souche.
2. Formation biofilm: pré et post-exposition
- Diluer la culture cultivés de manière exponentielle à 100 fois (ce qui équivaut à environ 10 6 unités formant des colonies par millilitre (UFC / ml)).
- Protocole pré-exposition
- Pour les échantillons témoins non traités, ajouter 200 pl de la culture bactérienne diluée dans chaque puits d'une plaque à 96 micropuits stérile.
- Ajouter 4 ul d'un composé d'essai ou un contrôleantibiotique (50x solution mère) et 196 ul de la culture bactérienne diluée par puits.
- Incuber à 37 ° C sur un agitateur de plaques à 200 tpm pendant 18 heures.
Note: Ici, nous utilisons un shaker avec une orbite de 2 mm.
- Protocole post-exposition
- Pour tous les échantillons, ajouter 200 pl de la culture bactérienne diluée dans chaque puits d'une plaque à 96 micropuits stérile.
- Incuber à 37 ° C sur un agitateur de plaques à 200 tpm pendant 18 heures.
Note: Ici, nous utilisons un shaker avec une orbite de 2 mm. - Retirer la solution planctonique attentivement tout, sans toucher le biofilm, à l'aide d'une pipette multicanaux.
- Ajouter 4 ul d'un composé d'essai ou un antibiotique de commande (50x solution mère) et 196 pi de TSB par puits.
- Incuber à 37 ° C sur un agitateur de plaques à 200 tpm pendant 24 une heure supplémentaire.
Note: Ici, nous utilisons un shaker avec une orbite de 2 mm.
3. résazurine Coloration Protocol pour l'évaluation de la viabilité des biofilms
- Préparer une solution mère de 0,1 mg / ml de résazurine (0,4 mM) dans du PBS stérile. Gardez ce stock stérile, à l'abri de l'exposition lumineuse, et à 4 ° C.
- Diluer la résazurine actions à 1:50 dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une concentration finale de 20 uM.
- Transférer la totalité de la solution planctoniques (en laissant les biofilms dans les puits) avec précaution, sans toucher les biofilms ou la création de bulles d'air, à une plaque de 96 puits séparée, propre à l'aide d'une pipette multicanaux.
- Laver les biofilms une fois avec du PBS stérile en ajoutant 200 pi par puits, et retirez-le soigneusement à l'aide d'une pipette multicanaux.
- Ajouter 200 ul de la résazurine dilué par puits de la plaque à biofilm en utilisant une pipette à canaux multiples.
- Incuber dans l'obscurité, à la température ambiante (RT), et 200 tours par minute, agitation pendant environ 20 min jusqu'à ce que les contrôles de biofilm non traitées sont uniformément rose.
- Mesurer la fluorescence àλ exc = 560 nm et λ em = 590 nm avec un lecteur de plaque ( en haut de lecture).
Protocole de coloration 4. Cristal Violet pour la biomasse Quantification des biofilms En utilisant la même plaque comme à l'étape 3
- Retirez la tache de résazurine soigneusement des puits à l'aide d'une pipette multicanaux.
- Fixer les biofilms avec 200 pi de methanol pendant 15 min.
- Laissez la plaque sécher à l'air pendant 10 minutes.
- Ajouter 190 ul de 0,02% (volume / volume, dilué dans de l'eau déminéralisée), une solution de cristal violet, soigneusement à l'aide d'une pipette multicanaux. Évitez de toucher les côtés des puits avec la tache tout en pipetage et empêcher la formation de bulles d'air en ne pressant la pipette pour terminer soufflage.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Enlever la tache soigneusement, à l'aide d'une pipette multicanaux.
- Laver deux fois avec de l'eau déminéralisée (200 pi à chaque fois).
- Laissez les puits sécher pendant 5 min à température ambiante et se dissolvent la tache restantedans 96% d'éthanol ou d'acide acétique à 33%.
- Incuber pendant 1 heure à température ambiante et de lire l'absorbance à 595 nm.
5. L'évaluation de l'effet bactéricide sur les bactéries planctoniques Utilisation de la plaque de l'échantillon même que pour les biofilms
- Mesurer la turbidité à 595 nm de la plaque avec la solution de 3,3 planctonique.
- Colorer les bactéries planctoniques avec résazurine en ajoutant 10 pi de la résazurine stocks par puits. Bien mélanger par pipetage.
- Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant environ 5 min, jusqu'à ce que les témoins non traités sont uniformément rose.
- Mesurer la fluorescence à λ exc = 560 nm et λ em = 590 nm.
6. Germe de blé agglutinine Coloration pour Matrix Quantification et Fluorescence Microscopy Imaging des biofilms
- Matrice de quantification
- Préparer une solution de la sonde WGA dans du PBS stérile / ml 5 pg.
- Utilisez un échantillon parallèle plaTe pour cette coloration. Retirer la solution planctoniques des puits et laver une fois avec PBS stérile (200 pi par puits), en utilisant soigneusement une pipette multicanaux sans toucher les biofilms.
- Ajouter 200 pi de solution WGA par puits à colorer.
- Incuber dans l'obscurité à 4 ° C pendant 2 heures.
- Enlever la tache non lié en lavant les puits avec 200 ul de PBS trois fois.
- Laissez la plaque sécher pendant 15 min à température ambiante.
- Dissoudre la tache liée dans l'acide acétique à 33%, en utilisant 200 pi par puits.
- Sceller les puits avec des bouchons de bande et sonication les utilisant un sonicateur à bain d'eau pendant 30 secondes à la température ambiante et 40 kHz.
- Incuber la plaque pendant 1 heure à température ambiante.
- Répétez l'étape de sonication. Les puits peuvent rester étanche entre les étapes de sonication.
- Mesurer la fluorescence à λ ex = 495 nm et λ em = 520 nm avec un lecteur de plaque ( en haut de lecture).
- Visualiser la matrice avecLa microscopie à fluorescence
- Utilisez le même protocole que ci-dessus jusqu'à l'étape 6.1.6.
- Après l'étape de séchage, de visualiser les échantillons avec un microscope à fluorescence, en utilisant un filtre FITC (ou un autre filtre d'excitation vert approprié).
7. Coloration cellules viables et mortes dans le biofilms pour l'imagerie avec Fluorescence Microscopy et Quantification du signal pour le ratio vert au rouge (G / R)
- L' imagerie par microscopie à fluorescence
- Préparer une solution de chaque sonde (cellules viables d'une coloration et les autres cellules mortes une coloration), selon les directives du fabricant.
- Retirer la solution planctoniques des puits et laver une fois avec du PBS stérile (200 pi par puits) à l'aide d'une pipette multicanaux.
- Ajouter 6 ul de la solution de coloration par puits.
- Incuber la plaque dans l'obscurité pendant 15 min.
- Avant la microscopie, éliminer le liquide en excès manually à l'aide d'une pipette multicanaux.
- Capturer les images en utilisant un microscope à fluorescence, en utilisant par exemple un filtre FITC (fluorescence verte, de cellules viables) ou un filtre TRITC (fluorescence rouge des cellules mortes).
- Quantification du signal en vert à fluorescence rouge rapport (G / R)
- Suivez le même protocole que dans les étapes 7.1.1 et 7.1.2.
- Ajouter 200 ul de la solution de coloration par puits et incuber pendant 15 minutes dans l'obscurité.
- Mesurer la fluorescence avec un lecteur de plaques à excitation des longueurs d'onde / d'émission 485/535 nm et 485/635 pour la fluorescence verte et rouge, respectivement (lecture supérieure).
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Representative Results
Dans la plate-forme proposée, les effets sur la viabilité, la biomasse et de la matrice du biofilm sont quantifiés. Dans la séquence de travail (figure 1), une plaque d'échantillon est coloré avec résazurine et ensuite avec du cristal violet pour évaluer simultanément les effets sur la viabilité des bactéries de biofilm et sur la biomasse totale du biofilm. Les deux tests peuvent être réalisés consécutivement dans la même plaque , car il a été démontré précédemment qu'une première coloration avec résazurine n'a eu aucun effet statistiquement significatif sur le résultat du cristal violet de coloration (p = 0,4149 pour la comparaison des maxima d' unités de signal d'absorbance entre des plaques de cristal violet coloré séparément ou après résazurine-coloration, n = 20) 26. L'effet sur les bactéries planctoniques peut être évalué simultanément.
Lorsque les coups sont identifiés soit de la viabilité ou le dosage à base de biomasse, une seconde plaque est st ained avec la sonde WGA pour quantifier l'effet des composés sur le composant de polysaccharide (PNAG) de la matrice du biofilm. Ce flux de travail peut être appliqué à la projection des bibliothèques chimiques, ainsi que des études de suivi fonctionnels pour les mesures de puissance des composés à succès, comme en témoigne ci-dessous.
Figure 1: Flux de la plate - forme de trois test. Représentation schématique du flux de travail combinant les trois essais sur des échantillons de biofilm. La plate-forme comprend une coloration pour un effet sur la viabilité, la biomasse, et la couche EPS; imagerie par microscopie de fluorescence; et en évaluant l'effet sur la phase planctonique. "A" et "NA" reposer "Active" et "Inactif", respectivement. Modifié à partir de Skogman et al. 26jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Performance de la Plateforme Trois-test à des fins de dépistage
Ici, les deux points de contrôle sont présentés comme des résultats représentatifs de la performance de la plate-forme. Dans la première campagne (figure 2A), une petite bibliothèque de dérivés alcaloïdes de quinquina a été criblée pour une activité anti-biofilm contre S. aureus biofilms 27, tandis que dans le second exemple (figure 2B), une bibliothèque naturelle et naturellement inspirée de type abiétane diterpenoids et dérivés a été exploré 28,29. Les résultats actifs ont été déterminées en utilisant les limites de vie calculées (seuils; Equation 6, tableau 1). Dans chaque étude préalable, les résultats des deux premiers essais très bien corrélés; les résultats ont tous été en mesure de réduire la viabilité et la biomasse biofilm, wien les composés inactifs n'a montré aucun effet sur l'essai. Tous les hits identifiés ont ensuite été testés sur le troisième (WGA) l'essai, mais ils avaient aucune matrice de démontage (ou dégradant la matrice) effets (résultats non montrés).
Figure 2: Les résultats représentatifs des campagnes de dépistage à l' aide de la plate - forme avec biofilms de S. aureus. Deux exemples d'écrans de validation de preuve de concept effectuées en utilisant la plate-forme d'essai. Les résultats sont présentés comme un pour cent du témoin non traité d'un biofilm, les composés de vie sont indiqués en rouge, et les lignes représentent les limites de vie calculées. (A) Le criblage d'une banque dérivée quinquina-alcaloïde identifié un composé actif. (B) Le criblage d'une banque de diterpenoids de type abiétane et dérivés identifié cinq actescomposés IVE. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Performance de la Plateforme Trois-essai pour les études de suivi
Les résultats représentatifs sont visibles dans la figure 3, où deux antibiotiques connus ont été testés à une très large gamme de concentrations (0,5 nM-5 mM) contre les biofilms de S. aureus. Les valeurs minimales concentration inhibitrice (CMI) des composés de référence contre les bactéries planctoniques (soit à partir de la littérature ou effectuées dans le laboratoire) servent de lignes directrices pour le choix des concentrations pour tester contre les biofilms de la même espèce. En outre, la connaissance des valeurs de concentration dans lesquels aucune cytotoxicité est détectée dans les cellules de mammifères peut également aider dans la sélection de la concentration pour tester anti-biofilm suivi. Idéalement,si les données antimicrobiens et la cytotoxicité d'un composé donné sont disponibles, un paramètre connu sous le nom de «indice de biocompatibilité" (BI) peut être calculée, telle que définie par Müller et Kramer 30. Ici, les valeurs de CIM contre planctoniques de S. aureus pour la pénicilline G et la ciprofloxacine ont été déterminées comme étant de 0,04 pM et 6 pM, respectivement (résultats non montrés). Ainsi, l'intervalle de concentration comprise entre environ 10 et 5 x 10 -2 MIC MIC x 10 et 3 x 10 -4 MIC x CMI pour la pénicilline et de la ciprofloxacine, respectivement. Les deux antibiotiques pourraient diminuer de manière significative la viabilité, la biomasse et la matrice du biofilm contenu PNAG quand ils ont été exposés à des bactéries unicellulaires avant le lancement du processus de formation de biofilm (Figure 3a). Cependant, en dépit de la très forte concentration d'antibiotiques testés sur préformées (18 h) biofilms, la viabilité et la biomasse ont été réduites à seulement environ 50% de ttuyau de biofilms non traités (Figure 3b). Le résultat le plus important ici est l'augmentation de la matrice du film biologique (à plus de 200%) lorsque les biofilms préformées ont été traitées avec des concentrations élevées de pénicilline G. Aucun changement dans le contenu de la matrice du biofilm ont été détectés lorsque les biofilms préformées ont été traités par la ciprofloxacine.
Figure 3: Exemple d'une étude de suivi des effets anti-biofilm utilisant deux antibiotiques modèles contre biofilms S. aureus. Les effets de la pénicilline G et la ciprofloxacine sont présentés ici: (A) avant la formation de biofilm (pré-exposition) et (B) de la formation post-biofilm (post-exposition). Pour la figure clarté, seul le concentrations les plus élevées testées le plus bas et sont affichés. Les écarts-types ne dépassent pas 20%. *** equals p <0,01. Modifié à partir de Skogman et al. 26 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'imagerie à base de fluorescence Microscopie
Il en résulte que la pénicilline G à 400 uM (ainsi que des concentrations plus élevées, comme le montre la figure 3b) tue environ 50% de la population bactérienne du biofilm de S. aureus préformé a été confirmée par un autre essai de viabilité de coloration. La moyenne des (G / R) des rapports de fluorescence verte à rouge pour les puits de biofilm non traitées était de 2,75, ce qui indique une prédominance de cellules vivantes (vertes colorées), sur les cellules mortes (rouge teinté). Cependant, dans les cellules traitées à la pénicilline le / G R a diminué à 1,54, ce qui correspond à 56% des puits de contrôle. Les cellules restantes en vie après traitement à la pénicilline produit une quantité significativement plus élevée de BPA, à en juger par l'augmentation détectée dans le vert (WGA) la fluorescence par comparaison avec les films biologiques non traités (figure 4b). Nous vous recommandons, lorsque cela est possible, d'effectuer ces expériences fondées sur l'imagerie pour confirmer davantage les résultats de la plate-forme, en particulier pendant la phase de caractérisation des candidats à succès.
Figure 4: La microscopie à fluorescence. L'effet de l'addition de la pénicilline (400 uM) sur la viabilité et la production d'EPS sont présentés ici. Les premières images (A) correspondent à biofilms non traitées et biofilms à la pénicilline traité, où les cellules viables sont des cellules mortes et vertes colorées sont colorées en rouge. Le graphique inséré illustre le calcul des ratios de fluorescence G / R. Les images de fond (B) correspondent à des films biologiques non traités et de la pénicillinecellules colorées avec traités par la sonde WGA. Le graphique insérée présente la quantification des signaux WGA pour les échantillons traités et non traités biofilm et les barres d'erreur représentent les écarts types. Modifié à partir de Skogman et al. 26 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Traitement des données et analyse statistique
les paramètres statistiques sont calculés pour caractériser la qualité des essais et de suivre leurs performances lors de courses de sélection. Les équations des paramètres les plus importants utilisés, ainsi que les valeurs obtenues et de la cible, sont énumérées dans le tableau 1. Dans toutes les équations, SD min, μ min, SD max, et u max représentent les écarts - types et les moyens du minimum(Min) et des signaux maximaux (max), respectivement. Dans les résultats présentés ici, appariés comparaisons des valeurs initiales ont été faites avec un test t non apparié avec correction de Welch, où p <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Tableau 1: paramètres statistiques utilisées pour évaluer la performance des essais. Dans toutes les équations, SD min, μ min, SD max, et u max représentent les écarts - types et les moyens du minimum (min) et des signaux maximaux (max), respectivement. Les RES méthodes de coloration, la résazurine, le cristal violet, et germe de blé agglutinine, sont abrégées, CrV et WGA, respectivement. RFU: unités de fluorescence relative; RAU: unités d'absorbance relative. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Il n'y a pas de méthode unique qui peut simultanément mesurer l'effet d'un composé sur la viabilité, la biomasse, et de la matrice de biofilm. Par conséquent, il est nécessaire de combiner des tests pour détecter un effet sur les trois points d'extrémité, de préférence à une étape de criblage primaire.
La résazurine est un protocole de coloration très simple ne comportant que de l'addition de la sonde redox. Cependant, l'établissement du temps d'incubation optimale des biofilms avec la résazurine est cruciale pour le succès de cet essai. Dans certaines souches bactériennes, la réduction de la sonde de résazurine à la rose, résorufine fluorescente se produit très rapidement, alors que dans d' autres , elle peut durer plusieurs heures 19. En outre, dans la même souche bactérienne, il peut aussi y avoir des différences significatives entre les bactéries et les biofilms planctoniques. Les bactéries planctoniques sont généralement plus facilement accessibles, principalement parce que la densité bactérienne est plus faible dans les populations planctoniques que dans biofilm populations, qui favorise la rotation plus rapide de la réaction. Dans une comparaison publiée des sondes de coloration biofilm de viabilité, résazurine a été conclu pour être l' un des tests les plus précis, simples à utiliser et moins coûteux 19. En outre, il a été démontré être applicable à une variété d'organismes bactériens et fongiques 19. D'autre part, le dosage de cristal violet est le plus largement utilisé pour la masse de biofilm quantification 19,32,33. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont l'ajout et le retrait de la solution de cristal violet tache. Ces étapes doivent être menées très soigneusement pour éviter la coloration non spécifique (par exemple, en raison de gouttes de teinture sur les parois des puits). L'un des principaux avantages de l'utilisation résazurine que le test de coloration initiale est le fait qu'il est non toxique pour les cellules, ce qui permet l'utilisation de la même plaque pour coloration au cristal violet. La combinaison des deux tests simplifie considérablement le flux de travail, réduit les coûts, permet d'économiser consomables et minimise l'utilisation de composés d'essai, ce qui est particulièrement utile dans un contexte de dépistage.
Comme indiqué précédemment, la matrice de polysaccharide extracellulaire auto-produit est une composante essentielle de biofilms. Pour mesurer la teneur en matrice (en particulier les polysaccharides essentiels), un troisième essai a été inclus ici, sur la base marqué par fluorescence WGA. A l' origine de la quantification WGA a été décrite comme une lectine sorbant dosage lié à une enzyme (ELLA) 24. Un essai similaire basé sur glycosaminoglycanes de coloration (GAG) dans la matrice de biofilms de S. aureus avec le bleu de diméthylméthylène (DMMB) a également été utilisé 31,34. GAG sont semblables aux adhésines intercellulaires de polysaccharide (PIA) trouvés dans la matrice de Staphylococcus spp. biofilms 35. La WGA-test de manière similaire des cibles PIA, mais plus spécifiquement WGA se lie à poly- N résidus de acétyl-glucosamine, qui jouent un rôle essentiel dans la matrice du biofilm 36 </ Sup>. Cibler la matrice est d'une grande importance en raison du fait que les biofilms peuvent facilement repousser si la matrice est à gauche après un traitement antibiotique ou chimique. Les bactéries peuvent également plus facilement attacher à une surface qui est la matrice de pré-enduit 35. Il a été démontré que certains antibiotiques peuvent efficacement réduire la viabilité et la biomasse biofilm, mais sans aucun effet sur la matrice. Dans nos expériences, cela est illustré par le cas de 31 ciprofloxacine. Certains antibiotiques peuvent même augmenter la production de matrice, comme l'a démontré ici avec de la pénicilline G 26. Sur la base de ces changements, les antibiotiques peuvent être classés dans les catégories énumérées dans le tableau 2. Tous les résultats de nos études de dépistage (figure 2) peuvent être classés, en collaboration avec la ciprofloxacine, comme des composés qui tuent les bactéries dans le biofilm et réduisent la biomasse mais ne démontent ou perturbent la matrice du biofilm.
| Catégorie | Effet sur les bactéries | Effet sur la matrice | Exemple antibiotique (cible biofilm) | Référence |
| 1 | aucun | aucun | ampicilline (SA) | (Toté et al. , 2009) |
| 2 | aucun | - | céfalotine (SA) | (Toté et al. , 2009) |
| 3 | - | aucun | polymyxine (SA) | (Toté et al. , 2009) |
| 4 | - | - | kanamycine (PA) | (Toté et al. , 2009) |
| ciprofloxacine (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | doxycycline (PA) | (Toté et al. , 2009) |
| 6 | - | + | pénicilline G (SA, CE) | (Skogman et al. 2012) |
Tableau 2: Classification des antibiotiques. Les antibiotiques sont divisés en catégories en fonction de leur effet sur la viabilité des bactéries du biofilm (en utilisant résazurine coloration) et la matrice (en utilisant WGA ou bleu (DMMB) coloration diméthylméthylène). SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; CE: Escherichia coli. Modifié à partir de Toté et al. 31
En outre, cette plate-forme est idéale pour effectuer des campagnes de dépistage primaire. La stratégie la plus rentable et le temps efficace est d'appliquer des essais à base de violette-résazurine et le cristal comme une stratégie de premier niveau et de passer à l'essai WGA-matrice de deuxième niveau (suivi) des études. Ceci est dû au fait que la sonde WGA est assez cher et que ce dosage est constitué de plusieurs étapes, ce qui rend plus laborieuse et prend du temps.
Une caractéristique pertinente de cette plate-forme est la possibilité d'évaluer les effets à long terme des antimicrobiens identifiés. effets chimiothérapeutiques à long terme ne peuvent être atteints que si la matrice du biofilm est démonté. Il a été démontré que le risque de réanimation de l'infection par le biofilm est beaucoup plus élevé si la matrice est laissée. Avec cette plate-forme, il est possible d'évaluer d'abord si la biomasse globale de biofilm est affectée à l'aide coloration au cristal violet. A plus detailed évaluation des polysaccharides de la matrice du biofilm, en utilisant le test WGA, peut suivre. À noter, la probabilité d'identifier une molécule unique qui peut à la fois démonter la matrice et exercer une antibactérienne (biocide) effets peuvent être considérés comme faibles. En effet, jusqu'à présent, les seuls composés de ce type que nous avons identifiés sont des peptides antimicrobiens 37. Pour y remédier, des suivis sont effectués dans cette plate-forme soit avec succès violet actif resazurin- ou de cristal, puisque cette stratégie permet l'identification de composés avec biocide séparée ou une activité dégradant la matrice. Ces pistes peuvent être potentiellement intéressant pour les stratégies multi-composants. Une combinaison de molécules dégradant la matrice avec des composés biocides ou de type antibiotique devrait permettre l'éradication de biofilm plus efficace.
En résumé, la plate-forme présentée ici constitue une bonne base pour le dépistage anti-biofilm utilisant la viabilité et de la biomasse des mesures conjointement avec la matrice quantification et de visualisation. Les deux résazurine et le cristal violet des essais de coloration peuvent également être utilisés pour d'autres types de micro-organismes formant biofilm-. Cependant, ces tests nécessitent une optimisation séparée pour les deux conditions de croissance et de coloration. L'applicabilité de l'essai de coloration WGA est limitée aux bactéries dans lesquelles la N - acétyl-glucosamine poly est un composant principal de la matrice du biofilm. D'autres essais matrice de quantification (tels que celui basé sur la coloration au bleu de diméthyl-méthylène) peuvent être appliqués dans d'autres cas. Au total, les essais dans cette plate-forme sont assez faciles à réaliser, et tous les réactifs sont facilement disponibles ainsi que généralement abordables. Cette plate-forme est adapté à faible au dépistage anti-biofilm à débit moyen, sans le besoin d'investissements d'équipement coûteux.
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Acknowledgments
Les auteurs remercient le professeur Paul Cos et LMPH, Université d'Anvers, en Belgique pour son soutien au cours du processus de tournage dans son laboratoire. Ce travail a été financé par l'Académie des projets Finlande (projets 272266 et 282981) et Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlande. Les contributions techniques du MSc Janni Kujala sont reconnus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
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