천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
바이오 필름은 현대 생물 의약의 가장 도전적인 주제 중 하나로 간주되고, 그들은 잠재적으로 항생제 내성 감염의 80 %에 대한 책임이 있습니다. 바이오 필름은 인성 생각된다 화학 요법에 대한 매우 높은 공차를 표시하고있다. 예를 들어, 행렬은 생물막으로 항생제의 침투를 감소 물리적 장벽을 제공한다. 또한, 생물막 내에서 세포 표현형 다양하다. 가능성, 생물막 탄력성이와 다른, 아직 알려지지 않은 메커니즘의 조합에서 발생한다. 현재 기존 항생제 모두 단일 세포 (플랑크톤) 박테리아에 대해 개발되어왔다. 따라서, 지금까지 분자의 매우 제한된 레퍼토리는 선택적 성숙한 생물막에 작용할 수있는. 이러한 상황은 방지 생물막에 대한 검색이 더 눈에 띄는 자리를 차지하도록 촉구되어있는 신약 개발의 진보적 인 패러다임의 변화를 주도하고있다. 추가 과제는이 때문이다매우 생물막 연구를위한 표준화 된 방법, 화학 라이브러리의 대규모 스크리닝에 사용될 수있는 특히 수를 제한했다. 여기, 화학 검사에 대한 실험 안티 바이오 필름 플랫폼이 제공됩니다. 폴리 N의 아세틸 글루코사민, PNAG의 그것은 밀 배아 응집소를 사용하여 생물막 (레사 주린 염색과) 가능성, (크리스탈 바이올렛 염색) 총 바이오 매스 및 바이오 필름 매트릭스 (측정하는 세 가지 분석을 사용 WGA-형광 기반의 염색 , 분수). 모든 분석은 모델 박테리아 포도상 구균을 사용하여 개발 하였다. 플랫폼 일차 스크리닝뿐만 아니라 식별 항 생물막 히트 기능적 특성화에 사용될 수있는 방법의 예를 제시한다. 이 실험 순서는 또한 측정 된 엔드 포인트에 기초하여 히트 분류 할 수 있습니다. 또한 특히 단기 화학 요법의 효과에 비해 장기에, 행동의 자신의 모드에 대한 정보를 제공합니다. 따라서, 매우 ADVA은다양한 생명 의학 애플리케이션을위한 출발점을 제공 할 수 고품질의 히트 화합물의 빠른 식별을위한 ntageous.
Introduction
박테리아는 생물막이 가장 일반적인 예입니다있는 두 개의 매우 다른 생활 양식, 플랑크톤 및 정착, 사이를 전환 할 수 있습니다. 생물막에서 세균은 자체 제작 매트릭스 1에 포함 된 구조화 된 사회를 형성한다. 이 자동 생성 행렬은 세균 및 외부 환경 사이에 장벽이며, 근접을 유지하면서 균체를 보호한다. 생물막 매트릭스의 조성 사이에도 종 내에서 변화하지만, 대부분은 리포 폴리 사카 라이드, 세포 DNA와 단백질의 긴밀한 네트워크로 구성된다. 행렬은 유해한 제제의 입사를 억제하는 물리 장벽으로서 역할뿐만 아니라 탈수 생물막을 보호하고, 전지 (2)을 빠져 나가는 영양분을 방지한다.
바이오 필름은 현대 생물 의약의 가장 도전적인 주제 중 하나로 간주되고, 그들은 항생제 내성 감염 (3)의 80 % 이상에 대한 소문에 책임이 있습니다. 그들은 DISP습도, 삼투압, 기계적 응력 4, 열, 자외선 5, 살균제, 항균제, 호스트 면역 체계 1 : 외부 위협에 대한 본질적으로 높은 내성을 배치합니다. 예를 들어, 바이오 필름을 죽이기 위해 필요한 필요한 항균제의 농도는 플랑크톤 박테리아를 죽이기 위해 요구되는에 비해 최대 1000 배 높은 것으로 밝혀졌다. 이 높은 허용 오차에 대한 설명은 다 인성 것으로 보인다. 매트릭스는 생물막으로 항생제의 침투를 감소 물리적 장벽을 제공한다. 또한, 바이오 필름 내의 세포 표현형 다양하다; 이들은 의한 바이오 필름 (6)의 내측 및 외측 부분 사이의 산소, 영양소 및 대사 산물의 존재 구배 다른 대사 상태 사이에서 전환. 따라서, 이러한 핵심으로 일부 생물막 지역에서, 박테리아는 산소와 영양분을 박탈되며 대사 덜 활성 또는 완전히 휴면 상태에 살고 <suP> 7. 완전 휴면 세포는 세포 persister 지칭되며, 이들은 통상적 인 항균 치료 8에 민감하지 않다. 따라서, 생물막 탄력성이 현재 제안 및 다른 아직 알려지지 않은 메카니즘의 조합으로부터 발생하는 것으로 보인다. 황색 포도상 구균 종. 심한 흔히 생물막 관련 감염 4 일으키는 가장 문제 그람 양성균 중 계속된다. 모든 박테리아의 최대 99 %가 그 주된 세균의 라이프 스타일 3 만들기, 생물막 내에서 연관되는 것이 좋습니다. 그러나, 현재 존재하는 모든 항생제는 단일 셀 (플랑크톤) 박테리아에 대해 개발되어왔다. 지금까지 분자의 매우 제한된 레퍼토리는 선택적 성숙한 생물막에 작용할 수있는. 이러한 상황은 방지 생물막에 대한 검색이 더 눈에 띄는 자리를 차지하도록 촉구되어있는 신약 개발의 진보적 인 패러다임의 변화를 주도하고있다.
methodolog에서생물막 방식에만 한정 표준 제정기구 화학적 라이브러리의 고 – 처리량 스크리닝에 적용 특히 개발 한 것처럼 iCal의 관점 추가적인 어려움이 존재한다. (하나만 제외)의 모든 표준 분석법 생물막 반응기에 기초하여,이 방법은 일반적으로 초기 임상 단계 9-12 동안 사용할 수없는 큰 작동 부피 및 시험 될 화합물의 대용량을 필요로한다. 유일한 기존 표준 스크리닝 적용 분석은 시판 최소 생물막 제거 농도 (MBEC) 시스템이 개발되었다 13-15되는 소위 캘거리 생물막 장치이다. 그러나 이러한 분석의 한계는 생물막이 쐐기 상에 성장되고, 모든 박테리아 종 또는 동일한 종의 균주 내에서조차하지이 장치에 바이오 필름을 형성 할 수 있다는 것이다. 또한, 특히 천연 화합물의 탐색에 적용 할 수있는 방법은필요로했다. 천연 제품은 지난 세기 16 세 이상의 항균 신약 개발의 혁신의 주요 원천이되어왔다. 또한 persister 세포에 효과적 작용 고유 메커니즘 신규 항 생물막 화합물을 제공 할 수있다. 따라서, 자연과 자연에서 영감을 라이브러리의 탐사 유망 독특한 안티 바이오 필름 리드를 생산의 높은 가능성을 가지고있다.
여기서는 포도상 구균 생물막의 생존 총 미생물, 매트릭스에 대한 효과를 측정하기 위하여 세 가지 분석법을 이용하여 항 – 생물막 화합물의 화학적 스크리닝 개발 된 분석법의 플랫폼의 실험 세부 사항을 제시한다. 첫번째 분석은 생물막의 생존 능력을 측정하고,이를 레사 주린 염색에 기초한다. 레사 주린은 산화 된 상태에서 파란색과 비 형광 및 박테리아의 대사 활동에 의해 감소 할 때 핑크, 높은 형광 레조 루핀 (resorufin)으로 변 산화 환원 얼룩입니다. 그것은 매우 간단하고 빠른 m이다기본 검진 17 ~ 20에 적합 ethod. 두 번째 분석은, 크리스탈 바이올렛 염색을 기준으로 총 생물막 질량을 측정한다. 크리스탈 바이올렛은 바이오 필름 19,21-23에서 세균과 박테리아를 연구하는데 널리 사용되는 얼룩입니다. 상기 분석은 저렴한 시약에 기초한 간단한 흡광도 포인트 판독 갖는다. 마지막으로 세 번째 분석은 포도상 구균 생물막 (24)의 매트릭스에 존재하는 N의 아세틸 글루코사민 잔기 (PNAG)을 폴리 데 특이 적으로 결합 밀 배아 응집소 통해 생물막 (WGA)의 세포 외 고분자 물질 (EPS) -matrix 타겟팅. WGA는 형광 강도 리더 (25)를 사용하여 검출 될 수있는 형광 물질로 접합된다. 우리는 여기에 근거하고 우리는 응용 프로그램의 예를 포함, 개발 플랫폼의 세부 사항을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
동시에 생존, 바이오 매스 및 생물막 행렬의 화합물의 효과를 측정 할 수있는 하나의 방법은 없다. 따라서, 바람직하게는 일차 스크리닝 단계에서 세 개의 엔드 포인트에 영향을 검출하기 위해 분석을 조합이 필요하다.
레사 주린는 산화 환원 프로브의 첨가로 이루어지는 매우 간단한 염색 프로토콜이다. 그러나, 레사 주린과 생물막 최적의 배양 시간을 설정하는 것은 상기 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 자신의 실험실에서 촬영 과정에서 그의 지원을위한 교수 폴 감옥과 LMPH, 앤트워프 대학, 벨기에 감사합니다. 이 작품은 핀란드 프로젝트 아카데미 (272266 및 282981 프로젝트) 및 스웨덴어 Tekniska Vetenskapsakademien 나는 핀란드에 의해 투자되었다. 석사 야니 Kujala의 기술적 기여가 인정된다.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
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