Abstract
Biofilme sind als eines der schwierigsten Themen der modernen Biomedizin angesehen, und sie sind möglicherweise verantwortlich für über 80% der Antibiotika-tolerante Infektionen. Biofilme haben eine außerordentlich hohe Toleranz für die Chemotherapie angezeigt, die multifaktoriell zu sein gedacht wird. Zum Beispiel stellt die Matrix eine physikalische Barriere, die das Eindringen von Antibiotika in den Biofilm abnimmt. Auch Zellen innerhalb der Biofilme sind phänotypisch vielfältig. Wahrscheinlich entsteht Biofilm Elastizität aus einer Kombination von diesen und anderen, noch unbekannte Mechanismen. Alle derzeit bestehenden Antibiotika gegen Single-Zellen (Plankton) Bakterien entwickelt worden. Daher Bisher existiert ein sehr begrenztes Repertoire von Molekülen, die selektiv auf reife Biofilme wirken kann. Diese Situation hat sich eine progressive Paradigmenwechsel in der Arzneimittelforschung getrieben, in denen Orten für die Anti-Biofilm gedrängt wurde eine prominentere Stelle zu besetzen. Eine weitere Herausforderung ist, dass es eine gibtsehr begrenzte Anzahl von standardisierten Verfahren zur Biofilmforschung, insbesondere diejenigen, die für große Durchsatzscreening von chemischen Bibliotheken verwendet werden können. Hier wird ein experimentelles anti-Biofilm-Plattform für chemisches Screening vorgestellt. Es nutzt drei Assays Biofilm Lebensfähigkeit (mit Resazurin - Färbung), Gesamtbiomasse (mit Kristallviolett - Färbung) und Biofilmmatrix (unter Verwendung eines Weizenkeimagglutinin, WGA-Fluoreszenz-basierte Färbung der Poly- N - Acetyl-Glucosamin zu messen, PNAG Fraktion). Alle Tests wurden unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Modell Bakterien entwickelt. Beispiele dafür, wie die Plattform für die primäre Screening verwendet werden sowie für die funktionelle Charakterisierung von identifizierten anti-Biofilm Treffer vorgestellt. Diese experimentelle Sequenz ermöglicht ferner die Klassifizierung der Basis Treffer auf den gemessenen Endpunkte. Es bietet auch Informationen über ihre Wirkungsweise, vor allem auf langfristige gegen kurzfristige chemotherapeutischen Effekte. Somit ist es sehr advantageous für die schnelle Identifizierung von qualitativ hochwertigen Hit-Verbindungen, die als Ausgangspunkte für verschiedene biomedizinische Anwendungen dienen kann.
Introduction
Bakterien können sich zwischen zwei sehr unterschiedlichen Lebensstile wechseln, planktonischen und sessilen, von denen ein Biofilm das häufigste Beispiel ist. In Biofilmen bilden Bakterien strukturierte Gemeinschaften in einem selbstproduzierten eingebettete Matrix 1. Diese selbst hergestellten Matrix ist eine Barriere zwischen den Bakterien und ihrer äußeren Umgebung und schützt die mikrobiellen Zellen, so dass sie in unmittelbarer Nähe zu halten. Die Zusammensetzung der Biofilmmatrix variiert zwischen und sogar innerhalb der Arten, aber es besteht hauptsächlich aus einem engen Netz von Lipopolysacchariden, extrazelluläre DNA und Proteinen. Die Matrix dient als physikalische Barriere das Eindringen von schädlichen Substanzen inhibierende, aber es schützt auch die Biofilm vor Austrocknung und verhindert Nährstoffe entweicht der Zelle 2.
Biofilme sind als eines der schwierigsten Themen der modernen Biomedizin angesehen, und sie sind angeblich verantwortlich für über 80% der Antibiotika-tolerante Infektionen 3. Sie displag ein von Natur aus eine hohe Toleranz gegen äußere Bedrohungen: Feuchtigkeit, den osmotischen Druck, mechanische Beanspruchung 4, Hitze, UV - Strahlung 5, Desinfektionsmittel, antimikrobielle Mittel, und das Immunsystem des Wirts 1. Zum Beispiel für die erforderliche antimikrobielle Mittel Konzentration einen Biofilm zu töten wurde im Vergleich zu der erforderlich ist, um zu töten Planktonbakterien bis zu 1000-mal höher erwiesen. Die Erklärung für diese höhere Toleranz scheint multifaktoriell zu sein. Die Matrix stellt eine physikalische Barriere, die das Eindringen von Antibiotika in den Biofilm abnimmt. Auch Zellen innerhalb der Biofilme sind phänotypisch vielfältig; sie Übergang zwischen verschiedenen metabolischen Zuständen aufgrund eines vorhandenen Gradienten von Sauerstoff, Nährstoffen und Stoffwechselprodukten zwischen den inneren und äußeren Teilen des Biofilms 6. Daher wird in einigen Biofilm Regionen, wie der Kern, sind Bakterien der Sauerstoff entzogen und Nährstoffe und leben in einer metabolisch weniger aktive oder einem völlig ruhenden Zustand
Aus methodologische Perspektive, zusätzliche Herausforderungen bestehen, da nur eine begrenzte Anzahl von Biofilmverfahren durch Normungsorganisationen entwickelt wurden, vor allem diejenigen, die für das Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken. Alle standardisierten Assays (mit einer Ausnahme) basieren auf Biofilmreaktoren, und diese Verfahren erfordern große Arbeitsvolumina und große Mengen von Verbindungen getestet werden, die während der frühen Untersuchungsstadium 9-12 Regel nicht verfügbar sind. Die einzige existierende standardisierte Screening-Assays anwendbar ist die sogenannte Calgary Biofilm Gerät, aus dem der handelsüblichen Mindest Biofilm Eliminieren Konzentration (MBEC) System wurde 13-15 entwickelt. Allerdings ist die Begrenzung dieses Tests, daß die Biofilme auf Zapfen aufgewachsen sind, und nicht alle Bakterienarten oder sogar Stämmen innerhalb derselben Spezies können Biofilme auf diesem Gerät zu bilden. Darüber hinaus Methoden, die besonders auf die Erforschung von Naturstoffen angewendet werden können, sinderforderlich. Natürliche Produkte haben die Hauptquelle für Innovationen in der antimikrobiellen Wirkstoffforschung im vergangenen Jahrhundert 16 gewesen. Sie können neuartige Anti-Biofilm-Verbindungen mit einzigartigen Wirkmechanismen zur Verfügung stellen, die auch wirksam gegen persister Zellen sein kann. Somit hat die Erforschung der natürlichen und natürlich inspirierten Bibliotheken hohe Chancen zur Herstellung von vielversprechenden und einzigartige Anti-Biofilm führt.
Hier stellen wir die experimentellen Details einer Plattform von Assays , die für die chemische Screening von Anti-Biofilm - Verbindungen unter Verwendung von drei Assays Zur Messung der Wirkungen auf die Lebensfähigkeit, Gesamtbiomasse und Matrix von Staphylococcus aureus Biofilm entwickelt wurde. Der erste Test misst Biofilm Lebensfähigkeit und es wird basierend auf Resazurin-Färbung. Resazurin ist ein Redox-Farbstoff, der in seinem oxidierten Zustand blau und nicht-fluoreszierend ist und verwandelt sich in rosa, stark fluoreszierenden Resorufin, wenn sie durch die Stoffwechselaktivität der Bakterien reduziert. Es ist eine sehr einfache und schnelle methode geeignet für primäre Screenings 17-20. Der zweite Test, basierend auf Kristallviolett-Färbung misst Gesamtbiofilmmasse. Kristallviolett ist eine weit verbreitete Färbung für 19,21-23 Bakterien und Bakterien in Biofilmen zu studieren. Der Test basiert auf kostengünstigen Reagenzien und hat eine einfache Absorption Endpunkt Lesen. Schließlich zielt die dritte Assay die extrazelluläre polymere Substanz (EPS) -Matrix des Biofilms durch Weizenkeim - Agglutinin (WGA), die spezifisch N - acetyl-Glucosamin - Reste (PNAG) in der Matrix von Staphylokokken - Biofilme 24 bis Poly- bindet. Die WGA wird mit einem Fluorophor konjugiert ist , der 25 unter Verwendung von Fluoreszenzintensitäts Leser erkannt werden kann. Wir stellen Ihnen hier die Gründe und Einzelheiten der Plattform, die wir entwickelt, darunter Beispiele für Anwendungen.
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Protocol
1. Anzucht der Bakterien
- Vorkultur die Bakterien über Nacht in einer tryptischen Sojabrühe (TSB) bei 37 ° C mit 220 Umdrehungen pro Minute Schütteln (16-18 h).
- Verdünnen Sie die Vorkultur 100-1000 Zeiten ( in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der Bakterien, hier 1.000 - mal für S. aureus verwendet wird) in frischem TSB und lassen Sie es bei 37 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute wachsen exponentielles Wachstum zu erreichen (optisch Dichte bei 595 nm (OD 595) zwischen 0,2 und 0,6).
Hinweis: Dieser Schritt erfordert stammspezifische Optimierung.
2. Bildung von Biofilmen: Pre- und Post-Exposition
- Verdünne die exponentiell gewachsenen Kultur 100 - mal (das entspricht etwa 10 6 koloniebildende Einheiten pro Milliliter (CFU / ml)).
- Pre-Expositions - Protokoll
- Für unbehandelten Kontrollproben, 200 ul der verdünnten Bakterienkultur pro Vertiefung einer sterilen 96-Mikrotiterplatte.
- Hinzufügen 4 ul einer Testverbindung oder einer KontrollAntibiotikum (50x Stammlösung) und 196 ul der verdünnten Bakterienkultur pro Vertiefung.
- Inkubieren bei 37 ° C auf einem Plattenschüttler bei 200 UpM für 18 Stunden.
Hinweis: Hier haben wir einen Schüttler mit einem 2 mm Orbit verwenden.
- Postexpositionsprotokoll
- Für alle Proben mit 200 ul der verdünnten Bakterienkultur pro Vertiefung einer sterilen 96-Mikrotiterplatte.
- Inkubieren bei 37 ° C auf einem Plattenschüttler bei 200 UpM für 18 Stunden.
Hinweis: Hier haben wir einen Schüttler mit einem 2 mm Orbit verwenden. - Entfernen Sie die gesamte planktonischen Lösung vorsichtig, ohne den Biofilm zu berühren, eine Mehrkanal-Pipette.
- In 4 ul einer Testverbindung oder einer Kontroll Antibiotikum (50x Stammlösung) und 196 ul TSB pro Vertiefung.
- Inkubieren auf einem Plattenschüttler bei 200 rpm für weitere 24 h bei 37 ° C.
Hinweis: Hier haben wir einen Schüttler mit einem 2 mm Orbit verwenden.
3. Resazurin Anfärbung Protocol für eine Rentabilitätsprüfung von Biofilmen
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,1 mg / ml Resazurin (0,4 mm) in sterilem PBS. Halten Sie diese Lager steril, vor Licht geschützt Belichtung und bei 4 ° C.
- Verdünne das Resazurin Lager 01.50 in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) in einer Endkonzentration von 20 uM zu erreichen.
- Übertragen Sie die gesamte planktonischen Lösung (die Biofilme in den Vertiefungen zu verlassen) sorgfältig, ohne die Biofilme zu berühren oder das Erstellen von Luftblasen, zu einem separaten, sauberen 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
- Waschen Sie die Biofilme einmal mit sterilem PBS mit 200 & mgr; l pro Vertiefung hinzufügen und entfernen Sie sie vorsichtig mit einem mehrkanaligen Pipette.
- In 200 ul der verdünnten Resazurin pro Vertiefung des Biofilms Platte mit einer mehrkanaligen Pipette.
- Inkubieren es in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (RT) und 200 Umdrehungen pro Minute, für ca. 20 min schütteln, bis die unbehandelten Kontrollen Biofilm gleichmäßig rosa sind.
- Messen der Fluoreszenz beiλ exc = 560 nm und λ em = 590 nm mit einem Plattenlesegerät (oben Lesen).
4. Kristallviolett-Färbung Protokoll für Biomasse Quantifizierung von Biofilmen Mit der gleichen Platte wie in Schritt 3
- Entfernen Sie die Resazurin Fleck vorsichtig aus den Vertiefungen einer Mehrkanalpipette mit.
- Befestigen Sie die Biofilme mit 200 ul Methanol für 15 min.
- Lassen Sie die Platte der Luft trocknen für 10 min.
- In 190 ul von 0,02% (vol / vol, verdünnt in demineralisiertem Wasser) Kristallviolett-Lösung, vorsichtig mit einem mehrkanaligen Pipette. Vermeiden Sie die Seiten der Vertiefungen mit dem Fleck beim Pipettieren zu berühren und verhindern die Bildung von Luftblasen durch nicht die Pipette drücken Blow-out zu vervollständigen.
- Inkubieren Sie für 5 min bei RT.
- Entfernen Sie den Fleck vorsichtig mit Hilfe einer Mehrkanalpipette.
- Waschen Sie es zweimal mit VE-Wasser (200 & mgr; l jeder Zeit).
- Lassen Sie die Vertiefungen für 5 min bei RT trocknen und löse den restlichen Fleckin 96% Ethanol oder 33% Essigsäure.
- Inkubieren für 1 h bei RT und die Extinktion bei 595 nm abgelesen.
5. Auswertung der bakterizide Wirkung auf Planktonische Bakterien mit der gleichen Probe Platte wie für die Biofilme
- Messen Sie die Trübung bei 595 nm der Platte mit der planktonischen Lösung von 3,3.
- Stain die planktonischen Bakterien mit Resazurin von 10 ul der Resazurin Lager Hinzufügen pro Vertiefung. Gut mischen durch Pipettieren.
- Inkubieren es bei RT für etwa 5 Minuten in der Dunkelheit, bis die unbehandelten Kontrollen gleichmäßig rosa sind.
- Messen der Fluoreszenz bei λ exc = 560 nm und λ em = 590 nm.
6. Weizenkeimagglutinin Färbung für Matrix Quantifizierung und Fluoreszenzmikroskopie Imaging von Biofilmen
- Matrix Quantifizierung
- Bereiten Sie eine 5 & mgr; g / ml-Lösung von der WGA-Sonde in sterilem PBS.
- Verwenden Sie eine parallele Probe plate für diese Färbung. Entfernen Sie die planktonischen Lösung aus den Vertiefungen und waschen Sie einmal mit sterilem PBS (200 ul pro Vertiefung), vorsichtig mit einem mehrkanaligen Pipette, ohne die Biofilme zu berühren.
- In 200 ul WGA-Lösung pro Vertiefung gefärbt werden.
- Inkubieren bei 4 ° C für 2 Stunden in Dunkelheit.
- Entfernen Sie die ungebundenen Fleck durch die Vertiefungen mit 200 ul PBS dreimal gewaschen.
- Lassen Sie die Platte trocken für 15 min bei RT.
- Man löst den gebundenen Fleck in 33% Essigsäure, unter Verwendung von 200 & mgr; l pro Vertiefung.
- Verschließen Sie die Vertiefungen mit Streifen Kappen und beschallen sie mit einem Wasserbad Beschallungsgerät für 30 s bei RT und 40 kHz.
- Inkubieren der Platte für 1 h bei RT.
- Wiederholen Sie den Beschallungsschritt. Die Vertiefungen können zwischen den Beschallungsschritten verschlossen bleiben.
- Messen Sie die Fluoreszenz bei λ ex = 495 nm und λ em = 520 nm mit einem Plattenlesegerät (oben Lesen).
- Visualisierung der Matrix mitFluoreszenzmikroskopie
- Verwenden Sie das gleiche Protokoll wie oben bis Schritt 6.1.6.
- Nach dem Trocknungsschritt, zu visualisieren, die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop, einem FITC-Filter (oder ein anderes geeignetes grünen Anregungsfilter) verwendet.
7. Die Färbung durchführbare und toten Zellen innerhalb der Biofilme für Imaging mit Fluoreszenzmikroskopie und Quantifizierung des Signals für die Grün-zu-Rot-Verhältnis (G / R)
- Imaging mit Fluoreszenzmikroskopie
- Bereiten Sie eine Lösung jeder Sonde (eine Färbung lebender Zellen und die andere Färbung toten Zellen), nach den Richtlinien des Herstellers.
- Entfernen Sie die planktonischen Lösung aus den Vertiefungen und waschen Sie einmal mit sterilem PBS (200 ul pro Vertiefung) einer Mehrkanalpipette mit.
- In 6 ul der Färbungslösung pro Vertiefung.
- Die Platte in der Dunkelheit für 15 min.
- Vor der Mikroskopie, entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit manually mit einer Mehrkanalpipette.
- Erfassen Sie die Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop, beispielsweise unter Verwendung eines FITC-Filter (für grüne Fluoreszenz, lebende Zellen) oder TRITC-Filter (rote Fluoreszenz, tote Zellen).
- Quantifizierung des Signals als grünes-zu-Rot-Fluoreszenzverhältnis (G / R)
- Folgen Sie dem gleichen Protokoll wie in den Schritten 7.1.1 und 7.1.2.
- In 200 ul der Färbungslösung pro Vertiefung und inkubieren sie für 15 Minuten in der Dunkelheit.
- Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Plattenleser bei Anregungs- / Emissions-Wellenlängen 485/535 nm und 485/635 für grüne und rote Fluoreszenz, bzw. (oben Lesen).
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Representative Results
In der vorgeschlagenen Plattform, die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, Biomasse und Biofilmmatrix quantifiziert. In der Arbeitssequenz (Abbildung 1), wird eine Probenplatte mit Resazurin und anschließend mit Kristallviolett gefärbt , um gleichzeitig die Auswirkungen auf die bakterielle Biofilm Lebensfähigkeit zu bewerten und auf insgesamt Biofilm Biomasse. Beide Assays können in der gleichen Platte durchgeführt nacheinander werden , weil es gezeigt wurde früher , daß eine erste Färbung mit Resazurin auf der Kristallviolettfärbung Ergebnis (p = 0,4149 für den Vergleich der maximalen Signal Extinktionseinheiten zwischen Kristallviolett Platten gefärbt separat keine statistisch signifikante Wirkung hatte oder nach Resazurin-Färbung, n = 20) 26. Die Wirkung auf Planktonbakterien können gleichzeitig ausgewertet werden.
Wenn Hits identifiziert werden entweder die Lebensfähigkeit oder der Biomasse-basierten Assays, ist eine zweite Platte st mit dem WGA-Sonde ained die Wirkung der Verbindungen auf die Polysaccharid-Komponente (PNAG) der Biofilmmatrix zu quantifizieren. Dieser Arbeitsablauf kann zum Screening von chemischen Bibliotheken angewandt werden, sowie für funktionelle Folgestudien zur Potenz Messungen der Trefferverbindungen, wie unten veranschaulicht.
Abbildung 1: Workflow des Drei-Assay - Plattform. Schematische Darstellung des Workflows die drei Assays auf Biofilmproben kombiniert. Die Plattform umfasst Färbung für einen Effekt auf die Lebensfähigkeit, Biomasse und EPS-Schicht; Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie; und Auswertung der Auswirkung auf die planktonischen Phase. "A" und "NA" steht für "Aktiv" und "nicht aktiv" sind. Geändert von Skogman et al. 26jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Performance der Plattform Drei-Assay für Screening-Zwecke
Hier sind zwei Screening Läufe werden als repräsentative Ergebnisse der Leistung der Plattform dargestellt. In der ersten Kampagne (2A), eine kleine Bibliothek von Cinchonaalkaloid Derivaten wurde für die Anti-Biofilm - Aktivität gegen S. aureus gescreent Biofilme 27, während im zweiten Beispiel (2B), eine natürliche und natürlich inspiriert Bibliothek von Abietan-Typ diterpenoids und Derivate wurde 28,29 erforscht. Die aktiven Hits wurden unter Verwendung der berechneten Treffergrenzen (Schwellen; Gleichung 6, Tabelle 1) bestimmt. In jedem Screening-Studie, die Ergebnisse der ersten beiden Tests sehr gut korreliert; die Hits waren alle in der Lage, die Lebensfähigkeit und den Biofilm Biomasse zu reduzieren, während die inaktiven Verbindungen zeigten keine Wirkung auf beiden Assays. Alle identifizierten Hits wurden dann auf dem dritten (WGA) Assay getestet, aber sie hatten keine Matrix-Zerlegung (oder Matrix-abbauenden) Wirkungen (Ergebnisse nicht gezeigt).
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse von Screening - Kampagnen , die Plattform mit S. aureus Biofilmen verwendet wird . Zwei Beispiele für Proof-of-Concept-Validierung Bildschirme mit der Assay-Plattform durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Prozent der unbehandelten Kontrolle Biofilm präsentiert werden die Trefferverbindungen in rot angezeigt, und die Linien stellen die berechnete Treffer Grenzen. (A) Die Vorführung eines Cinchona-Alkaloid - Derivat - Bibliothek identifiziert einen Wirkstoff. (B) Das Screening einer Bibliothek von Abietan-Typ diterpenoids und Derivate fünf Akt identifiziertive Verbindungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Performance der Plattform Drei-Assay für Follow-up-Studien
Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3 zu sehen ist, wo zwei bekannten Antibiotika in einem sehr breiten Bereich von Konzentrationen getestet wurden (0,5 nM-5 mM) gegen S. aureus Biofilm. Minimale Hemmkonzentration (MIC) -Werte von Referenzverbindungen gegen Planktonbakterien (entweder aus der Literatur oder im Labor durchgeführt) dienen als Richtlinien für die Konzentrationen gegen Biofilme der gleichen Spezies zu testen wählen. Zusätzlich Kenntnis der Konzentrationswerte in dem keine Zytotoxizität in Säugetierzellen erkannt wird, kann auch in der Wahl der Konzentration für die Anti-Biofilm-Follow-ups zu testen helfen. Ideal,wenn beide antimikrobielle und Zytotoxizität Daten für eine bestimmte Verbindung zur Verfügung stehen, ein Parameter , der als "Biokompatibilität Index" (BI) bekannt ist, kann berechnet werden, wie definiert durch Müller und Kramer 30. Hier MIC Werte gegenüber planktonischen S. aureus für Penicillin G und Ciprofloxacin bestimmt wurden 0,04 uM und 6 & mgr; M sein, bzw. (Ergebnisse nicht gezeigt). So lag die Konzentration Intervall von etwa 10 5 x MIC bis 10 -2 x MIC und 10 3 x MIC bis 10 -4 x MIC für Penicillin und Ciprofloxacin sind. Beide Antibiotika könnte die Lebensfähigkeit, Biomasse deutlich verringern, und Biofilmmatrix PNAG Gehalt , wenn sie auf Einzelzell Bakterien ausgesetzt wurden vor der Initiierung der Biofilmbildung Verfahrens (Abbildung 3a). Doch trotz der sehr hohen Konzentration von Antibiotika auf vorgeformten (18 hr) Biofilme getestet, die Lebensfähigkeit und die Biomasse wurden nur in etwa 50% der t reduziertSchlauch von unbehandeltem Biofilmen (Abbildung 3b). Das auffälligste Ergebnis war hier die Erhöhung der Biofilm-Matrix (auf über 200%) als vorgeformtes Biofilmen mit hohen Konzentrationen an Penicillin G. behandelt wurden, keine Änderungen in dem Inhalt der Biofilmmatrix detektiert wurden, als vorgeformtes Biofilmen mit Ciprofloxacin behandelt wurden.
Abbildung 3: Beispiel für eine Follow-up - Studie von Anti-Biofilm - Effekte mit zwei Modell Antibiotika gegen S. aureus Biofilmen. Die Wirkung von Penicillin G und Ciprofloxacin werden hier vorgestellt: (A) vor der Bildung der Biofilm (Vorbelichtung) und (B) nach der Bildung von Biofilmen (Post-Expositions). Für Figur Klarheit sind nur die niedrigsten und die höchsten Konzentrationen getestet gezeigt. Die Standardabweichungen nicht überschreiten 20%. *** equals p <0,01. Geändert von Skogman et al. 26 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fluoreszenzmikroskopie-basierten Imaging
Das Ergebnis , das Penicillin G bei 400 uM (sowie höhere Konzentrationen, wie in 3b gezeigt) tötet etwa 50% der S. aureus Biofilm vorgeformten Bakterienpopulation mit einer anderen Lebensfähigkeit Färbungsassay bestätigt wurde. Der Durchschnitt der grün-zu-Rot (G / R) Fluoreszenz-Verhältnisse für die unbehandelten Biofilm Brunnen war 2,75, eine Dominanz von Live (grün-gefärbt) Zellen anzeigt, über tote (rot-gefärbten Zellen). Jedoch in Penicillin-behandelten Zellen die G / R-Verhältnis verringerte sich auf 1,54 bis 56% der Kontrollvertiefungen entspricht. Die verbleibenden Zellen am Leben nach Penicillin-Behandlung produced eine deutlich höhere Menge an EPS, als wenn sie mit unbehandelten Biofilmen (4b) im Vergleich in grün (WGA) Fluoreszenz aus der detektierten Zunahme beurteilt. Wir empfehlen, wenn möglich, diese bildbasierte Experimente durchzuführen, um die Ergebnisse weiter der Plattform bestätigen, vor allem während der Phase der Charakterisierung von Hit-Kandidaten.
Abbildung 4: Die Fluoreszenzmikroskopie. Die Wirkung von Penicillin Zugabe (400 & mgr; M) auf die Lebensfähigkeit und EPS Produktion werden hier gezeigt. Die Top - Bilder (A) entsprechen unbehandeltem Biofilmen und Penicillin behandelten Biofilmen, wo lebende Zellen grün gefärbt und toten Zellen sind rot gefärbt. Der eingesetzte Graph zeigt die Berechnungen von G / R Fluoreszenz-Verhältnisse. Die unteren Bilder (B) entsprechen unbehandeltem Biofilmen und Penicillin-behandelten Zellen mit dem WGA-Sonde gefärbt. Der eingesetzte Graph stellt die Quantifizierung der WGA Signale für behandelten und unbehandelten Biofilmproben und Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen. Geändert von Skogman et al. 26 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Datenverarbeitung und statistische Analyse
Statistischen Parameter berechnet, um die Qualität der Assays zu charakterisieren und ihre Leistung während Screenen Läufe zu folgen. Die Gleichungen der wichtigsten Parameter sowie die erhaltenen und Zielwerte sind in Tabelle 1 aufgeführt. In allen Gleichungen, SD min, μ min, SD max und umax die Standardabweichungen und mittels des minimal vertreten(Min) und der maximalen (max) Signale. In den hier gezeigten Ergebnisse, gepaart Vergleiche der ursprünglichen Werte mit einem ungepaarten t-Test mit Welch - Korrektur durchgeführt wurden, wobei p <0,05 als statistisch signifikant.
Tabelle 1: Statistische Parameter verwendet , um die Leistung der Assays zu bewerten. In allen Gleichungen, SD min, μ min, SD max und umax repräsentieren die Standardabweichungen und mittels der minimal (min) und der maximalen (max) Signale. Die Färbeverfahren, Resazurin, Kristallviolett und Weizenkeimagglutinin, abgekürzt RES, CrV und WGA sind. RFU: relative Fluoreszenzeinheiten; RAU: relative Absorptionseinheiten. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Es gibt keine einzige Methode, die gleichzeitig die Wirkung einer Verbindung auf die Lebensfähigkeit messen kann, Biomasse und Biofilmmatrix. Daher besteht ein Bedarf an Assays, um die Kombination eine Wirkung auf die drei Endpunkte, vorzugsweise an einem primären Siebstufe zu detektieren.
Resazurin ist ein sehr einfaches Färbeprotokoll nur von der Zugabe des Redox-Sonde besteht. Jedoch mit der Resazurin die optimale Inkubationszeit der Biofilme Festlegung ist entscheidend für den Erfolg dieses Assays. In einigen Bakterienstämmen tritt die Reduktion des Resazurin Sonde mit dem rosa, fluoreszierende Resorufin sehr schnell, während in anderen kann es einige Stunden dauern 19. Darüber hinaus innerhalb der gleichen Bakterienstamm gibt auch signifikante Unterschiede zwischen planktonische Bakterien und Biofilmen sein kann. Die planktonischen Bakterien typischerweise mehr sind leicht zu erreichen, vor allem, weil die Bakteriendichte in planktonischen Bevölkerung niedriger ist als in der Biofilm populations, die schneller Umsatz der Reaktion fördert. In einer veröffentlichten Vergleich der Färbung Sonden Biofilm Lebensfähigkeit wurde Resazurin abgeschlossen Verwenden Sie eine der genauesten, einfach zu sein, und am wenigsten teure Tests 19. Außerdem hat es sich 19 auf einen Bereich von Bakterien und Pilzorganismen anwendbar gezeigt. Auf der anderen Seite ist der Kristallviolett - Assay , um die am häufigsten für die Biofilmmasse Quantifizierung 19,32,33 verwendet. Die kritischsten Schritte dieses Protokolls sind, die Zugabe und die Entfernung der violet Färbelösung Kristall. Diese Schritte müssen sehr sorgfältig durchgeführt werden unspezifische Färbung zu vermeiden (beispielsweise aufgrund von Tropfen Flecken auf den Wänden der Vertiefungen). Einer der Hauptvorteile der Verwendung von Resazurin als Anfangsfärbungsassay ist die Tatsache, dass es zu den Zellen nicht toxisch ist, die für das Kristallviolett-Färbung die Verwendung der gleichen Platte ermöglicht. Die Kombination beider Tests erheblich vereinfacht den Workflow, senkt die Kosten, spart consummöglicht, und minimiert die Verwendung der Testverbindungen, die in einem Screening-Umgebung besonders wertvoll ist.
Wie bereits erwähnt, ist die selbst produzierten extrazelluläre Polysaccharid-Matrix ein wesentlicher Bestandteil von Biofilmen. Um den Matrixgehalt (besonders wichtig Polysaccharide) messen, ein dritter Test wurde hier enthalten sind, basierend auf Fluoreszenz-markierten WGA. Ursprünglich war der WGA Quantifizierung wurde als ein Enzym-linked - Lectin-Sorbens - Test (ELLA) 24 beschrieben. Ein ähnlicher Assay basiert auf Färbungs Glykosaminoglykane (GAGs) in der Matrix von S. aureus Biofilm mit Dimethylmethylen Blau (DMMB) wurde ebenfalls 31,34 verwendet. GAGs sind ähnlich den Polysaccharid interzellularen Adhäsine (PIAs) in der Matrix von Staphylococcus spp. Biofilme 35. Die WGA-Assay ähnlich PIAs Ziele, aber WGA mehr bindet spezifisch N - acetyl-Glucosamin - Reste zu Poly-, die 36 eine wesentliche Rolle in der Biofilm - Matrix spielen </ Sup>. die Matrix Targeting ist von hoher Bedeutung aufgrund der Tatsache, dass Biofilme leicht nachwachsen kann, wenn die Matrix nach einer chemischen oder antibiotische Behandlung gelassen wird. Bakterien können auch an einer Oberfläche befestigen leichter , die Matrix 35 vorbeschichtet ist. Es hat sich gezeigt, daß einige Antibiotika wirksam die Lebensfähigkeit und Biofilm Biomasse senken, jedoch ohne Wirkung auf die Matrix. In unseren Experimenten wird dies durch den Fall von Ciprofloxacin 31 veranschaulicht. Einige Antibiotika können auch Matrixproduktion zu erhöhen, wie 26 hier mit Penicillin G unter Beweis gestellt. Auf der Grundlage dieser Veränderungen können Antibiotika in die in Tabelle 2 aufgeführten Kategorien klassifiziert werden. Alle Treffer in unserem Screening - Studien (Abbildung 2) klassifiziert werden können, zusammen mit Ciprofloxacin, als Verbindungen, die die Bakterien im Biofilm zu töten und die Biomasse zu reduzieren , aber nicht zerlegen oder die Biofilmmatrix stören.
| Kategorie | Wirkung auf Bakterien | Auswirkung auf die Matrix | Beispiel Antibiotikum (Ziel Biofilm) | Referenz |
| 1 | keiner | keiner | Ampicillin (SA) | (TOTE et al. 2009) |
| 2 | keiner | - | Cefalotin (SA) | (TOTE et al. 2009) |
| 3 | - | keiner | Polymyxin (SA) | (TOTE et al. 2009) |
| 4 | - | - | Kanamycin (PA) | (TOTE et al. 2009) |
| Ciprofloxacin (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | Doxycyclin (PA) | (TOTE et al. 2009) |
| 6 | - | + | Penicillin G (SA, EG) | (Skogman et al. 2012) |
Tabelle 2: Klassifizierung von Antibiotika. Die Antibiotika werden in Kategorien eingeteilt auf der Grundlage ihrer Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Biofilmbakterien (mit Resazurin-Färbung) und die Matrix (unter Verwendung von WGA oder Dimethylmethylen Blau (DMMB) Färbung). SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; EG: Escherichia coli. Geändert von TOTE et al. 31
Darüber hinaus ist diese Plattform ideal für das primäre Screening-Kampagnen durchführen. Die kosten- und zeiteffektive Strategie ist Resazurin und Kristallviolett-basierte Assays als First-Tier-Strategie anzuwenden und in der zweiten Stufe mit dem WGA-Matrix-Test zu bewegen (Follow-up) Studien. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass die WGA Sonde ziemlich teuer ist, und dass dieser Test besteht aus mehreren Schritten, die es mühsam und zeitaufwendig macht.
Ein relevantes Merkmal dieser Plattform ist die Möglichkeit, die langfristigen Auswirkungen der identifizierten antimikrobiellen Substanzen zu bewerten. Langzeitchemotherapeutische Effekte können nur dann, wenn der Biofilm-Matrix zerlegt erreicht werden. Es wurde gezeigt, dass das Risiko einer Wiederbelebung des Biofilms Infektion ist viel höher, wenn die Matrix zurückgelassen. Mit dieser Plattform ist es möglich, zuerst bewerten, ob die Gesamt Biofilm Biomasse Kristallviolett-Färbung beeinflußt wird verwendet. Eine dETAILLIERTE Beurteilung der Biofilmmatrix Polysaccharide, die WGA-Assay verwenden, folgen können. Zu beachten ist, ist die Wahrscheinlichkeit, ein einzelnes Molekül zu identifizieren, die sowohl die Matrix zu zerlegen können und üben antibakteriell (Biozid) Wirkungen als gering angesehen werden kann. Tatsächlich bisher die einzigen Verbindungen dieser Art , die wir identifiziert haben , sind antimikrobielle Peptide 37. Um dies zu beheben, Follow-ups sind in dieser Plattform erfolgt entweder mit resazurin- oder Kristallviolett-aktiv-Hits, da diese Strategie die Identifizierung von Verbindungen mit getrennten biozide oder Matrix-abbauenden Aktivität ermöglicht. Solche Leitungen können für Mehrkomponenten-Strategien potentiell interessant sein. Eine Kombination von Matrix-abbauenden Molekülen mit bioziden oder Antibiotika-Typ-Verbindungen wird erwartet, effizienter Biofilm Beseitigung zu sorgen.
Zusammenfassend stellte die Plattform hier ist eine gute Basis für die Anti-Biofilm-Screening Lebensfähigkeit und Biomassemessungen unter Verwendung zusammen mit Matrix quantifiKation und Visualisierung. Sowohl die Resazurin und Kristallviolett-Färbung Assays können auch für andere Arten von biofilm- bildenden Mikroorganismen verwendet werden. Jedoch erfordern diese Assays getrennte Optimierung sowohl für wachsende und Färbungsbedingungen. Die Anwendbarkeit des WGA Färbetest beschränkt auf jene Bakterien , in denen das Poly - N - acetyl-glucosamin eine Hauptkomponente der Biofilmmatrix ist. Andere Matrixquantifizierungsassays (wie die auf Basis von Dimethyl-Methylenblau-Färbung) können auch in anderen Fällen angewandt werden. Insgesamt werden die Assays in dieser Plattform relativ einfach durchzuführen, und alle Reagenzien sind leicht sowie allgemein erschwinglich erhältlich. Diese Plattform ist für schwach- bis mittel Durchsatz Anti-Biofilm-Screening ohne die Notwendigkeit für teure Ausrüstung Investitionen geeignet.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Professor Paul Cos und LMPH, Universität Antwerpen, Belgien für seine Unterstützung während der Dreharbeiten in seinem Labor. Diese Arbeit wurde von Academy of Finland geförderten Projekte (Projekte 272.266 und 282.981) und Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finnland. Die technischen Beiträge von MSc Janni Kujala werden anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
