Abstract
Biofilms נחשב אחד הנושאים המאתגרים ביותר של רפואה המודרנית, והם בעלי פוטנציאל אחראים על 80% של זיהומים אנטיביוטיים סובלנית. Biofilms הפגין סובלנות גבוהה במיוחד עבור כימותרפיה, אשר נחשבה מולטיפקטוריאלית. למשל, המטריצה מספקת מכשול פיזי מקטין את חדירת אנטיביוטיקה לתוך ביופילם. כמו כן, תאים בתוך biofilms הם phenotypically מגוונים. סביר, החוסן ביופילם נובע משילוב של אלה ואחרים, עדיין לא ידועים, מנגנונים. כל האנטיביוטיקה הקיימים כיום פותחו נגד חיידקים חד תאיים (planktonic). לכן, עד כה, רפרטואר מצומצם מאוד של מולקולות קיים שיכול לפעול באופן סלקטיבי על biofilms הבוגרת. מצב זה מונע שינוי פרדיגמה מתקדם לגילוי תרופות, שבה מחפש-biofilms אנטי כבר דחק לתפוס מקום בולט יותר. אתגר נוסף הוא כי ישמאוד מוגבל במספר השיטות הסטנדרטיות למחקר ביופילם, במיוחד אלה שיכולים לשמש הקרנה גדולה תפוקה של ספריות כימיות. הנה, פלטפורמה אנטי biofilm ניסיון להקרנה כימית מוצגת. היא משתמשת שלושה מבחנים למדוד כדאיות ביופילם (עם מכתים resazurin), ביומסה הכולל (עם מכתים סגול קריסטל), מטריצת ביופילם (באמצעות agglutinin ניבט חיטה, מכתים WGA-קרינה מבוססת של N -acetyl-גלוקוזאמין פולי, PNAG , שבריר). כל המבחנים פותחו באמצעות Staphylococcus aureus כמו חיידקי המודל. דוגמאות לאופן שבו הפלטפורמה יכולה לשמש לסינון ראשוני וכן אפיון פונקציונלי של להיטים אנטי biofilm המזוהים מוצגות. רצף ניסיוני זה מאפשר נוסף לסיווג הלהיטים המבוססים על נקודות קצה הנמדדות. הוא גם מספק מידע על אופן הפעולה שלהם, במיוחד על לטווח ארוך בניגוד לתופעות כימותרפיות לטווח קצר. לכן, זה מאוד אדוהntageous לזיהוי המהיר של תרכובות להיט באיכות גבוהה שיכול לשמש נקודות התחלה עבור יישומים ביו שונים.
Introduction
חיידקים יכולים לעבור בין שני סגנונות חיים שונים מאוד, planktonic ו נייחים, מתוכם ביופילם היא הדוגמה הנפוצה ביותר. ב biofilms, חיידקים ליצור קהילות מובנהיות משוקעות בתוך הגוש בהפקה עצמית 1. מטריקס בהפקה עצמית זו הוא חסם בין חיידקי הסביבה החיצונית שלהם, והוא מגן על תאי חיידקים, שמירה על אותם בקרבת המקום. הרכב של מטריקס ביופילם משתנה בין ואף בתוך מינים, אבל זה מורכב בעיקר רשת הדוקה של lipopolysaccharides, DNA התאי, וחלבונים. המטריצה משמשת כמחסום פיזי עיכוב הכניסה של סוכנים מזיקים, אבל זה גם מגן על ביופילם מהתייבשות ומונע הזנה לברוח התא 2.
Biofilms נחשב אחד הנושאים המאתגרים ביותר של רפואה המודרנית, והם כביכול אחראים על 80% של זיהומים אנטיביוטיים סובלני 3. הם חד פעמייםשכב סובלנות גבוהה מטבעם מפני איומים חיצוניים: לחות, לחץ האוסמוטי, לחץ מכאני 4, חום, קרינת UV 5, חומרי חיטוי, סוכני מיקרוביאלית, ומערכת החיסון של פונדקאי 1. לדוגמה, ריכוז סוכן מיקרוביאלית נדרש נדרש להרוג biofilm הוכח להיות עד 1,000 פעמים גבוה בהשוואה לזה הנדרש כדי להרוג חיידקים planktonic. הסבר סובלנות גבוהה יותר זה נראה מולטיפקטוריאלית. המטריצה מספקת מכשול פיזי מקטין את חדירת אנטיביוטיקה לתוך ביופילם. כמו כן, תאים בתוך biofilms הם phenotypically מגוונים; שהם מעבר בין מדינות שונות מטבולית בשל שיפוע הקיים של חמצן, חומרי הזנה, מטבוליטים בין החלקים הפנימיים והחיצוניים של ביופילם 6. לפיכך, באזורים מסוימים ביופילם, כגון הליבה, חיידקים ללא חמצן וחומרים מזינים חיים פעילים מבחינה מטבולית פחות או במצב רדום לחלוטין
מנקודת methodologפרספקטיבת iCal, אתגרים נוספים קיימות, כמו שרק מספר מצומצם של שיטות ביופילם פותח על ידי ארגונים תקינים, במיוחד לאלו החלימו על הקרנת התפוקה הגבוהה של ספריות כימיות. כל המבחנים הסטנדרטיים (עם רק חריג אחד) מבוססים על כורי biofilm, ושיטות אלה דורשים כמויות עבודה גדולות וכמויות גדולות של תרכובות להיבדק, אשר בדרך כלל אינן זמינים בשלב המחקר מוקדם 9-12. ההקרנה ניתן ליישמן הסטנדרטי הקיימים רק assay הוא ההתקן שנקרא קלגרי Biofilm, שממנו ריכוז ביטול biofilm מינימום הזמין המסחרי (MBEC) המערכת פותחה 13-15. עם זאת, המגבלה של assay זה היא כי biofilms גדל על יתדות, ולא כל מיני החיידקים או אפילו זנים בתוך אותו המין מסוגלים ליצור biofilms במכשיר זה. יתר על כן, שיטות שניתן ליישם במיוחד למשימות של תרכובות טבעיות הןנָחוּץ. מוצרים טבעיים היו המקור העיקרי בזכות חדשנותה בתחום גילוי תרופות מיקרוביאלית במאה השנים האחרונות 16. הם יכולים לספק תרכובות אנטי biofilm רומן עם מנגנוני פעולה ייחודיים כי גם יכול להיות יעיל נגד תאי persister. לפיכך, החקר של ספריות טבעיות ובאופן טבעי השראה שקיים הסתברות גבוהה של ייצור ידיעה אנטי biofilm מבטיחה וייחודית.
כאן, אנו מציגים את הפרטים הניסיונות של פלטפורמה של מבחנים אשר פותחה עבור ההקרנה הכימית של תרכובות אנטי biofilm באמצעות שלושה מבחנים למדוד את ההשפעות על הכדאיות, ביומסה מוחלטת, מטריצה של biofilms Staphylococcus aureus. את assay הראשון מודד כדאיות ביופילם, והיא מבוססת על מכתים resazurin. Resazurin היא כתם חיזור כי הוא כחול ללא ניאון במצב מחומצן שלה והופך ורוד, resorufin פלורסנט מאוד כאשר מופחת על ידי פעילות מטבולית של חיידקים. זהו מ 'מאוד פשוטים ומהיריםethod המתאים וניפוי ראשוני 17-20. את assay השני, המבוסס על מכתים סגול קריסטל, מודד את המסה ביופילם הכולל. סגול קריסטל הוא כתם בשימוש נרחב ללימוד חיידקים וחיידקים biofilms 19,21-23. Assay הוא מבוסס על חומרים כימיים זולים ויש לו קריאת סיום הספיג פשוטה. לבסוף, assay השלישי מתמקד חומר פולימרי תאיים (EPS) -matrix של ביופילם באמצעות נבט חיטה agglutinin (WGA), הנקשר באופן פולי N שאריות -acetyl-גלוקוזאמין (PNAG) הנוכחי במטריצה של biofilms staphylococcal 24. של WGA היא מצומדת עם fluorophore כי ניתן לאתר באמצעות קוראי עוצמת הקרינה 25. אנו מציגים כאן את הרציונל ופרטים של הפלטפורמה שפתחנו, כולל דוגמאות של יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול החיידקים
- טרום התרבות חיידקים לילה במרק סויה tryptic (TSB) על 37 מעלות צלזיוס עם 220 סל"ד רועד (16-18 שעות).
- לדלל את התרבות מראש 100-1,000 פעמים (תלוי בקצב הצמיחה של החיידקים; כאן, 1,000 פעמים משמשות aureus S.) ב TSB הטרי ולתת לו לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד להגיע גידול מעריכי (אופטי צפיפות בבית 595 ננומטר (OD 595) בין 0.2 ו -0.6).
הערה: שלב זה דורש אופטימיזציה ספציפית-זן.
2. כינונה Biofilm: לפני ואחרי חשיפה
- לדלל את פעמי תרבות 100 גדלו באופן מעריכי (זה שווה כ 10 6 יחידות מושבת יוצרים למיליליטר (CFU / ml)).
- פרוטוקול טרום חשיפה
- לקבלת דוגמיות קבוצת ביקורת, להוסיף 200 μl של תרבות חיידקים המדולל גם צלחת 96-microwell סטרילי.
- הוסף 4 μl של תרכובת בדיקה או פקד(פתרון 50x מלאה) אנטיביוטי ו -196 μl של תרבות חיידקים המדוללת היטב.
- דגירה זה ב 37 ° C על שייקר צלחת ב 200 סל"ד במשך 18 שעות.
הערה: כאן אנו משתמשים שייקר עם מסלול 2 מ"מ.
- פרוטוקול לאחר חשיפה
- עבור כל הדגימות, להוסיף 200 μl של תרבות חיידקים המדולל גם צלחת 96-microwell סטרילי.
- דגירה זה ב 37 ° C על שייקר צלחת ב 200 סל"ד במשך 18 שעות.
הערה: כאן אנו משתמשים שייקר עם מסלול 2 מ"מ. - הסר את פתרון planktonic כולו בזהירות, בלי לגעת biofilm, בעזרת פיפטה רבה ערוצים.
- הוסף 4 μl של תרכובת בדיקה או אנטיביוטיקה מלאה (פתרון מניות 50x) ו -196 μl של TSB לכל טוב.
- דגירה זה ב 37 ° C על שייקר צלחת ב 200 סל"ד במשך שעות 24 נוספים.
הערה: כאן אנו משתמשים שייקר עם מסלול 2 מ"מ.
3. Resazurin מכתים Protocol עבור הערכת הכדאיות של Biofilms
- הכן פתרון המניות של 0.1 מ"ג / מ"ל resazurin (0.4 מ"מ) ב- PBS סטרילית. שמור את זה המניה סטרילי, מוגן מפני חשיפה לאור, ו ב 4 מעלות צלזיוס.
- לדלל את מניות resazurin 01:50 ב פוספט שנאגר מלוח סטרילית (PBS) כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר.
- מעבירים את הפתרון planktonic כולו (עזיבת biofilms בבארות) בזהירות, בלי לגעת biofilms או יצירת בועות אוויר, לצלחת נפרדת, נקי 96-היטב בעזרת פיפטה רב ערוצי.
- שטוף את biofilms פעם עם PBS סטרילי על ידי הוספת 200 μl לכל היטב, ולהסיר אותו באמצעות פיפטה רבה בזהירות.
- הוסף 200 μl של resazurin המדולל היטב של צלחת biofilm בעזרת פיפטה רבה ערוצים.
- דגירה זה בחושך, בטמפרטורת החדר (RT), ו -200 סל"ד, רעד במשך כ 20 דקות עד הבקרות ביופילם מטופל ורודים שווה.
- מדוד את הקרינהλ EXC = 560 ננומטר λ em = 590 ננומטר עם קורא צלחת (קריאה למעלה).
4. קריסטל ויולט מכתים פרוטוקול כימות ביומסה של Biofilms שימוש פלייט זהה שלב 3
- הסר את כתם resazurin בזהירות המבארת בעזרת פיפטה רבה ערוצים.
- תקן את biofilms עם 200 μl של מתנול במשך 15 דקות.
- תן אוויר יבש הצלחת למשך 10 דקות.
- להוסיף 190 μl של 0.02% (כרך / כרך, מדולל deionized מים) פתרון סגול קריסטל, באמצעות פיפטה רבה בזהירות. הימנע ממגע עם הצדדים של בארות עם הכתם בעוד pipetting ולמנוע היווצרות של בועות אוויר על ידי לא לוחץ על פיפטה כדי להשלים איזה פיצוץ.
- דגירה זה במשך 5 דקות ב RT.
- הסר את הכתם בזהירות, בעזרת פיפטה רבה ערוצים.
- לשטוף את זה פעמיים עם מים ללא יונים (200 μl בכל פעם).
- תנו בארות להתייבש במשך 5 דקות ב RT ו לפזר את הכתם שנותרב 96% אתנול או 33% חומצה אצטית.
- דגירה זה במשך שעה 1 ב RT ולקרוא את הספיגה ב 595 ננומטר.
5. בוחנת את השפעת חיידקים על חיידקים planktonic שימוש פלייט מדגם זהה עבור Biofilms
- מדוד את העכירות ב 595 ננומטר של הצלחת עם פתרון planktonic מ -3.3.
- כתם חיידקי planktonic עם resazurin על ידי הוספת 10 μl של מניית resazurin לכל טוב. מערבבים היטב על ידי pipetting.
- דגירה זה בחושך ב RT במשך כ 5 דקות, עד שולטת מטופל ורודים שווה.
- למדוד את הקרינה ב λ EXC = 560 ננומטר λ em = 590 ננומטר.
6. נבט חיטה agglutinin מכתים עבור כימות מטריקס והדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי של Biofilms
- כימות מטריקס
- כן פתרון 5 מיקרוגרם / מיליליטר של חללית WGA ב PBS סטרילית.
- השתמש PLA מדגם מקבילte מכתים זה. הסר את פתרון planktonic מבאר ולשטוף פעם עם PBS סטרילי (200 μl לכל היטב), באמצעות פיפטה רבה בזהירות בלי לגעת biofilms.
- הוסף 200 μl של פתרון WGA לכל טוב להיות מוכתם.
- דגירה זה בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- הסר את הכתם מאוגד על ידי שטיפת בארות עם 200 μl של שלוש פעמים PBS.
- תן יבש הצליח במשך 15 דקות ב RT.
- ממיסים את הכתם כבול בחומצה 33% אצטית, באמצעות 200 μl לכל טוב.
- חותם את הבארות עם כובעים חשפנות sonicate אותם באמצעות sonicator באמבט מים במשך 30 שניות ב RT ו -40 kHz.
- הדגירה הצליחה במשך שעה 1 ב RT.
- חזור על שלב sonication. הבארות יכולות להישאר חתום בין צעדי sonication.
- למדוד את הקרינה ב לשעבר λ = 495 ננומטר λ em = 520 ננומטר עם קורא צלחת (קריאה למעלה).
- לדמיין את המטריצה עםמיקרוסקופ פלואורסצנטי
- השתמש באותו פרוטוקול כנ"ל עד שלב 6.1.6.
- לאחר שלב הייבוש, לדמיין את הדגימות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות מסנן FITC (או אחר מסנן עירור ירוק מתאים).
7. מכתים תאים קיימא ואת המלח בתוך Biofilms הדמיה עם הקרינה מיקרוסקופית וכימות של אותות הירוק אל אדום-יחס (G / R)
- הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי
- כן פתרון של כל בדיקה (מכתים אחד תאי קיימא ואת התאים המתים המכתימים אחד האחרים), על פי הנחיות היצרן.
- הסר את פתרון planktonic מבאר ולשטוף פעם עם PBS סטרילי (200 μl לכל היטב) באמצעות פיפטה רבה.
- הוסף 6 μl של הפתרון מכתים לכל טוב.
- דגירת הצלחת בחושך במשך 15 דקות.
- לפני מיקרוסקופיה, להסיר את הנוזל העודף מanually באמצעות פיפטה רבה.
- ללכוד את התמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות למשל מסנן FITC (פלואורסצנטי ירוק, תאים קיימא) או מסנן TRITC (אדום פלואורסצנטי, תאים מתים).
- כימות האות כיחס ירוק-עד-אדום-קרינה (G / R)
- עקוב באותו פרוטוקול בצעדים 7.1.1 ו 7.1.2.
- הוסף 200 μl של הפתרון מכתים בכל טוב דגירה אותם במשך 15 דקות בחושך.
- למדוד את הקרינה עם קורא צלחת באורכי גל עירור / פליטה 485/535 ננומטר 485/635 עבור פלואורסצנטי ירוק ואדום, בהתאמה (קריאה למעלה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשנת הפלטפורמה המוצעת, את ההשפעות על הכדאיות, ביומסה, ומטריקס ביופילם הן לכמת. בסיקוונס העבודה (איור 1), צלחת דגימה אחת מוכתמת resazurin ובהמשך עם סגול קריסטל כדי להעריך את ההשפעות זמנית על הכדאיות biofilm חיידקים על ביומסה biofilm הכולל. מבחני שניהם יכולים להתבצע ברצף באותו צלחת כי זה היה הפגינו מוקדם יותר כי מכתים הראשון עם resazurin לא היתה השפעה משמעותית סטטיסטית על התוצאה מכתים קריסטל סגול (p = 0.4149 להשוואה יחידות ספיגת אות מקסימאלית בין לוחות סגול קריסטל מוכתם בנפרד או לאחר resazurin מכתים, n = 20) 26. ההשפעה על חיידקים planktonic ניתן להעריך בו זמנית.
כאשר להיטים מזוהים מאחדים את הכדאיות או assay המבוסס על ביומסה, צלחת שנייה הוא st ained עם החללית WGA לכמת את ההשפעה של תרכובות על מרכיב פוליסכריד (PNAG) של המטריצה ביופילם. עבודה זו יכולה להיות מיושמת על ההקרנה של ספריות כימיות, כמו גם מחקר מעקב תפקודי למדידות עצמה של תרכובות להיט, כפי שהודגמה בהמשך.
איור 1: Workflow של פלטפורמת תלת assay. ייצוג סכמטי של זרימת העבודה המשלבת את השלושה מבחנים על דגימות biofilm. הפלטפורמה כוללת מכתים עבור השפעה על כדאיות, ביומסה, ושכבת EPS; הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; והערכת ההשפעה על שלב planktonic. "A" ו- "NA" לעמוד "פעיל" ו "לא פעיל", בהתאמה. שונה מ ואח Skogman. 26jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ביצועים של הפלטפורמה תלת assay למטרות הקרנה
הנה, שתי ריצות הקרנה מוצגות כתוצאות תצגנה את הביצועים של הפלטפורמה. במערכה הראשונה (איור 2 א), ספרייה קטנה של נגזרי אלקלואיד כינין הוקרנה לפעילות אנטי biofilm נגד S. aureus biofilms 27, ואילו בדוגמא השנייה (התרשים 2B), ספרייה טבעית ובאופן טבעי השראה של סוג abietane diterpenoids ונגזר שנחקר 28,29. הלהיטים הפעילים נקבעו באמצעות מגבלות ביקור חושב (סף; משוואת 6, טבלת 1). בכל מחקר הקרנה, תוצאות שני המבחנים הראשונים בקורלציה היטב; המכות היו כל יכולים להפחית את הכדאיות ואת ביומסה biofilm, while התרכובות הפעילות לא הראו כל השפעה משני assay. כל הנפילות נבדקו מכן על השלישי (WGA) assay, אך הם לא היו-פירוק מטריקס (או מטריצה משפילה) אפקטים (תוצאות לא מוצגות).
איור 2: תוצאות נציג של קמפייני הקרנה באמצעות הפלטפורמה עם S. aureus biofilms. שתי דוגמאות של מסכי אימות הוכחה של קונספט בוצעו באמצעות פלטפורמת assay. התוצאות מוצגות כאחוז השליטה ביופילם מטופל, תרכובות הלהיט מסומנות באדום, ואת הקווים מייצגים את גבולות להיט המחושבים. (א) הקרנת ספרייה נגזרת כינין-אלקלואיד מזוהה מתחם פעיל אחד. (ב) הקרנת ספריה של diterpenoids ונגזרים abietane מסוג זיהה חמישה מעשהתרכובות אייב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הביצועים של פלטפורמת תלת assay למחקרי מעקב
נציג התוצאות ניתן לראות באיור 3, שבו שני סוגי אנטיביוטיקה ידוע נבדקו מגוון רחב מאוד של ריכוזים (0.5 ננומטר-5 מ"מ) נגד biofilms S. aureus. ריכוז מעכבות מינימום (MIC) ערכים של תרכובות התייחסות נגד חיידקים planktonic (בין אם בספרות או ביצע במעבדה) לשמש הנחיות לבחירת ריכוזים לבדוק נגד biofilms מאותו המין. בנוסף, ידע בעולם ערכי הריכוז שבו לא cytotoxicity מזוהה בתאי יונקים גם יכול לעזור בבחירה של הריכוז כדי לבדוק קופצים בצעו אנטי ביופילם. באופן אידיאלי,אם שני נתונים מיקרוביאלית cytotoxicity עבור תרכובת מסוימת זמינים, פרמטר המכונה "מדד Biocompatibility" (BI) ניתן לחשב, כפי שהוגדר על ידי מולר וקרמר 30. כאן, ערכי MIC נגד planktonic S. aureus עבור פניצילין G ו- ciprofloxacin נקבעו 0.04 מיקרומטר ו -6 מיקרומטר, בהתאמה (תוצאות לא מוצגות). לפיכך, המרווח ריכוז נע בין כ -10 5 x MIC עד 10 -2 x MIC ו -10 3 x MIC עד 10 -4 x MIC עבור פניצילין ciprofloxacin, בהתאמה. אנטיביוטיקה שניהם יכול להפחית באופן משמעותי את הכדאיות, ביומסה, ותוכן ביופילם מטריקס PNAG כאשר הם נחשפו לחיידק תא בודד לפני תחילת תהליך היווצרות ביופילם (איור 3 א). עם זאת, למרות ריכוז גבוה מאוד של אנטיביוטיקה נבדק על preformed (18 שעות) biofilms, את הכדאיות ואת ביומסה הופחתו רק כ 50% של tצינור של biofilms מטופלים (איור 3B). התוצאה הבולטת ביותר כאן היא העלייה של מטריקס ביופילם (מעל 200%) כאשר biofilms מתבצעת טופלו ריכוזים גבוהים של פניצילין G. אין שינויים בתוכן של מטריקס ביופילם התגלו כאשר biofilms מתבצעת טופלה ciprofloxacin.
איור 3: דוגמה של מחקר מעקב של השפעות אנטי biofilm באמצעות שני סוגי אנטיביוטיקה מודל נגד biofilms S. aureus. ההשפעות של פניצילין G ו- ciprofloxacin מוצגים כאן: (א) לפני biofilm היווצרות (חשיפה מראש) ו- (ב) שלאחר biofilm היווצרות (לאחר חשיפה). לשם בהירות דמות, רק הנמוך ביותר המרכזות הנבדקות מוצגות. סטיות התקן לא יעלה על 20%. *** equals p <0.01. שונה מ ואח Skogman. 26 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הדמיה מבוססת מיקרוסקופ פלואורסצנטי
התוצאה כי G פניצילין ב 400 מיקרומטר (וכן ריכוזים גבוהים יותר, כפי שמוצג באיור 3 ב) הורג כ -50% של אוכלוסיית חיידקי ביופילם מתבצעות S. aureus אושר עם אחר assay מכתים הכדאיות. הממוצע של ירוק-עד-אדום (G / R) יחסי קרינה עבור בארות ביופילם המטופל היה 2.75, מה שמעיד על דומיננטיות של תאי חיים (ירוקים מוכתמים), על תאים מתים (אדום מוכתם). עם זאת, בתאים שטופלו פניצילין היחס G / R ירד ל 1.54, המקביל ל 56% מהבארות שליטה. התאים הנותרים בחיים לאחר פרו טיפול פניציליןduced כמות גבוהה יותר של EPS, כמו להישפט מהגידול זוהה פלואורסצנטי ירוק (WGA) בהשוואה biofilms מטופלים (איור 4 ב). אנו ממליצים, בכל הזדמנות אפשרית, כדי לבצע את הניסויים האלה מבוססות הדמיה להמשיך לאשר את התוצאות של הפלטפורמה, במיוחד בשלב האפיון של מועמדים פגע.
איור 4: מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השפעת בנוסף פניצילין (400 מיקרומטר) על ייצור כדאיות EPS מוצגת כאן. התמונות העליונות (א) מתאימות biofilms מטופל biofilms שטופל פניצילין, שבו תאי קיימא הם תאים ירוקים מת מוכתם מהגואלות אדומים. הגרף המוכנס ממחיש את חישובי יחסי קרינת G / R. התמונות התחתונות (B) מתאימות biofilms מטופל פניציליןתאי -treated מוכתמים חללית WGA. הגרף מוכנס מציג כימות של אותות WGA עבור דגימות biofilm מטופלים ואינם מטופלים, וברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן. שונה מ ואח Skogman. 26 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עיבוד וניתוח נתונים סטטיסטיים
פרמטרים סטטיסטיים מחושבים לאפיין את איכות המבחנים לעקוב ביצועיהם במהלך ריצות הקרנה. המשוואות של הפרמטרים החשובים ביותר בשימוש, כמו גם את הערכים שהתקבלו וקהל יעד שונה מפורטים בטבלה 1. בכל המשוואות, דקות SD, דקות μ, מקסימום SD, ו מיקרון מקסימום מייצגים סטיות התקן ואמצעי מינימלי(דקות) מקסימאליים (מקסימום) אותות, בהתאמה. בתוצאות המוצגות כאן, לזווג השוואות של הערכים המקוריים נעשו עם מבחן t מזווג עם התיקון של וולש, כאשר p <0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.
טבלת 1: פרמטרים סטטיסטיים להשתמש כדי להעריך את הביצועים של המבחנים. בכל המשוואות, דקות SD, דקות μ, SD מקסימום, ואת מיקרון מקסימום מייצג סטיות ההתקן ואמצעים של (דקות) המינימאליות מקסימאליים (מקסימום) אותות, בהתאמה. שיטות מכתים, resazurin, סגול קריסטל, ונבטי חיטה agglutinin, הם RES מקוצר, CRV, ו WGA, בהתאמה. RFU: יחידות קרינה יחסיות; ראה: יחידות ספיגות יחסית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אין שיטה אחת שניתן למדוד את ההשפעה זמנית של תרכובת על הכדאיות, ביומסה, ומטריקס ביופילם. לכן, יש צורך לשלב מבחנים כדי לזהות השפעה על שלוש נקודות הקצה, רצוי בשלב סינון ראשוני.
Resazurin הוא פרוטוקול מכתים מאוד פשוט המורכבת רק התוספת של חללית החיזור. עם זאת, הקמת זמן הדגירה האופטימלית של biofilms עם resazurin היא קריטית להצלחת assay זה. בחלק זני חיידקים, הפחתה של החללית resazurin אל resorufin ורוד, פלורסנט מתרחשת מהר מאוד, בעוד שאצל אחרים זה יכול להימשך מספר שעות 19. יתר על כן, בתוך אותה זן החיידקים, גם ייתכנו הבדלים משמעותיים בין חיידקי planktonic ו biofilms. החיידקים planktonic הם בדרך כלל יותר להגיע בקלות, בעיקר בגלל צפיפות חיידקים נמוכה באוכלוסיות planktonic מאשר biofilm populations, המקדמת מחזור מהיר יותר של התגובה. לשם השוואה לאור של בדיקות מכתימות כדאיות ביופילם, resazurin הסתיים להיות אחד המדויק ביותר, פשוט לשימוש, ויקרים לפחות המבחנים 19. יתר על כן, הוכח לחול על מגוון של אורגניזמים חיידקים ופטריות 19. מצד השני, assay הסגול קריסטל הוא נפוץ ביותר עבור כימות המוני ביופילם 19,32,33. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם התוספת והסרת הפתרון כתם סגול קריסטל. יש צעדים אלה להתנהל בזהירות רבה, כדי למנוע הכתמה נוקבת (למשל, עקב טיפות של כתם על הקירות של הבארות). אחד היתרונות העיקריים של שימוש resazurin כמו assay המכתים הראשוני הוא העובדה שהוא אינו רעיל לתאים, המאפשר השימוש באותה צלחת מכתים סגול קריסטל. השילוב של שני המבחנים משמעותיים מפשט את העבודה, מפחית את העלויות, חוסך consumables, וממזער את השימוש של תרכובות הבדיקה, שהוא בעל ערך במיוחד בסביבת הקרנה.
כפי שצוין קודם לכן, מטריצת פוליסכריד תאיים בהפקה עצמית היא מרכיב חיוני של biofilms. כדי למדוד את תוכן מטריקס (במיוחד סוכרים חיוניים), assay שלישי נכלל כאן, מבוסס על WGA קרינה שכותרתו. במקור כימות WGA תוארה assay האנזים צמוד לקטינים-sorbent (ELLA) 24. Assay דומה המבוסס על glycosaminoglycans מכתים (GAGs) במטריצה של biofilms S. aureus עם כחול dimethylmethylene (DMMB) שימש גם 31,34. GAGs דומה adhesins אינטר פוליסכריד (Pias) נמצא במטריצה של spp Staphylococcus. biofilms 35. את assay-WGA דומה מטרות Pias, אבל WGA ליתר דיוק נקשר פולי N שאריות -acetyl-גלוקוזאמין, אשר ממלאים תפקיד חיוני במטריצה ביופילם 36 < / Sup>. מיקוד המטריצה הוא בעל חשיבות גבוהה בשל העובדה כי biofilms יכול לצמוח מחדש בקלות אם המטריצה שנשארה אחרי כימיקל או טיפול אנטיביוטי. חיידקים יכולים גם יותר בקלות לצרף משטח כי הוא מטריקס 35 מראש מצופה. הוכח כי טיפול אנטיביוטי יכול למעשה להוריד את ביומסה הכדאיות ביופילם, אך ללא כל השפעה על המטריצה. בניסויים שלנו, זה בא לידי ביטוי על ידי במקרה של ciprofloxacin 31. אנטיביוטיקה מסוימת יכולה אפילו להגדיל את ייצור מטריקס, כפי שמודגם כאן עם פניצילין G 26. על פי שינויים אלה, אנטיביוטיקה יכולה להיות מסווגת לקטגוריות מפורטות בטבלה 2. כל הלהיטים במחקרים ההקרנה שלנו (איור 2) ניתן לסווג, יחד עם ciprofloxacin, כמו תרכובות להרוג את החיידקים biofilm ולהפחית את ביומסה אבל אין לפרק או לשבש את מטריקס ביופילם.
| קטגוריה | השפעה על חיידקים | השפעה על מטריצה | אנטיביוטיקה דוגמה (ביופילם היעד) | התייחסות |
| 1 | אף לא אחד | אף לא אחד | אמפיצילין (SA) | (ואח Tote. 2009) |
| 2 | אף לא אחד | - | cefalotin (SA) | (ואח Tote. 2009) |
| 3 | - | אף לא אחד | polymyxin (SA) | (ואח Tote. 2009) |
| 4 | - | - | kanamycin (PA) | (ואח Tote. 2009) |
| ciprofloxacin (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | דוקסיציקלין (PA) | (ואח Tote. 2009) |
| 6 | - | + | פניצילין G (SA, EC) | (Skogman et al. 2012) |
טבלה 2: סיווג של אנטיביוטיקה. האנטיביוטיקה מחולקים לקטגוריות על סמך השפעתם על הכדאיות של חיידקים ביופילם (באמצעות resazurin מכתים) ואת מטריקס (באמצעות WGA או dimethylmethylene כחול (DMMB) מכתים). SA: Staphylococcus aureus; הרש"פ: Pseudomonas aeruginosa; EC: coli Escherichia. שונה מ ואח Tote. 31
יתר על כן, פלטפורמה זו היא אידיאלית לביצוע קמפייני הקרנה ראשיים. אסטרטגית העלות וזמן-היעיל ביותר היא ליישם resazurin וקריסטל מבוסס מבחנים סגולים כאסטרטגיה ראשונית וכדי לעבור את assay-מטריקס WGA ב-רובד שני (מעקב) מחקרים. זאת בשל העובדה כי חללית WGA היא די יקרה וכי assay זה מורכב מכמה שלבים, מה שהופך את זה יותר מייגע זמן רב.
תכונה רלוונטית של הפלטפורמה הזו היא האפשרות להעריך את ההשפעות ארוכות הטווח של antimicrobials מזוהה. תופעות כימותרפיות לטווח ארוך יכולות להיות מושגת רק אם המטריצה ביופילם היא מפורקת. הוכח כי הסיכון של החייאה של זיהום ביופילם הוא הרבה יותר גבוה אם המטריצה הוא נשאר מאחור. עם פלטפורמה זו, אפשר להעריך תחילה אם ביומסה biofilm הכוללת מושפעת באמצעות מכתים סגול קריסטל. יותר דהערכת etailed של סוכרי מטריקס ביופילם, באמצעות assay WGA, יכול לעקוב אחר. ראוי לציין, את הסבירות לזיהוי מולקולה בודדת שיכול גם לפרק את המטריצה ולהפעיל אנטיבקטריאלי (biocidal) השפעות עשויות להיחשב נמוך. ואכן, עד כה, תרכובות כאלו רק שזיהינו הם פפטידים מיקרוביאלית 37. כדי לפתור בעיה זו, בצע קופצים מבוצעות פלטפורמה זו גם עם resazurin- או קריסטל להיטים סגול-אקטיבי, שכן אסטרטגיה זו מאפשרת זיהוי של תרכובות עם biocidal נפרד או פעילות משפיל-מטריקס. מוביל מסוג זה יכול להיות מעניין פוטנציאלי עבור אסטרטגיות רבות רכיב. שילוב של מולקולות משפילות-מטריקס עם תרכובות biocidal או אנטיביוטיקה מסוג צפוי לספק מיגור ביופילם יעיל יותר.
לסיכום, הפלטפורמה המובאת כאן מספקת בסיס טוב להקרנה אנטי biofilm באמצעות מדידות כדאיות ביומסה יחד עם מטריקס quantifiקטיון ויזואליזציה. שני מבחני מכתים resazurin וקריסטל סגול יכול לשמש גם עבור סוגים אחרים של מיקרואורגניזמים להרכיב biofilm-. עם זאת, מבחנים אלה דורשים אופטימיזציה נפרד הוא תנאי גידול וכתמים. תחולתו של assay מכתים WGA מוגבל חיידקים אלה שבהם N -acetyl-גלוקוזאמין פולי הוא המרכיב העיקרי של מטריקס ביופילם. מבחני כימות מטריקס אחרים (כגון זו המבוססת על מכתים כחול מתילן דימתיל) ניתן ליישם במקרים אחרים. בסך הכל, המבחנים ב פלטפורמה זו הם די קלים לביצוע, וכל ריאגנטים זמינים בקלות כמו גם בדרך כלל סבירים. פלטפורמה זו מתאימה נמוכה עד ההקרנה בינוני תפוקה אנטי biofilm ללא צורך בהשקעות בציוד יקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים פרופסור פול קוס ו LMPH, אוניברסיטת אנטוורפן, בלגיה על תמיכתו בתהליך הצילומים במעבדתו. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה פרויקטים פינלנד (פרויקטי 272,266 ו 282,981) ו Svenska Tekniska Vetenskapsakademien אני פינלנד. התרומות הטכניות של MSc יאני Kujala מוכרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al.
- Lewis, K.
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
