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Immunology and Infection

एंटी biofilm Assays का एक मंच प्राकृतिक यौगिक पुस्तकालय के अन्वेषण के लिए उपयुक्त

Published: December 27, 2016 doi: 10.3791/54829
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

Abstract

Biofilms आधुनिक बायोमेडिसिन का सबसे चुनौतीपूर्ण विषयों में से एक के रूप में माना जाता है, और वे संभावित एंटीबायोटिक सहिष्णु संक्रमण के 80% से अधिक के लिए जिम्मेदार हैं। Biofilms कीमोथेरेपी के लिए एक असाधारण उच्च सहिष्णुता, जो multifactorial माना जाता है प्रदर्शित किया है। उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स एक शारीरिक बाधा है कि biofilm में एंटीबायोटिक दवाओं की पहुंच कम हो जाती है। इसके अलावा, biofilms भीतर कोशिकाओं phenotypically विविध रहे हैं। अधिक संभावना है, biofilm लचीलापन इन और अन्य, अभी तक अज्ञात है, तंत्र का एक संयोजन से उठता है। वर्तमान में मौजूदा एंटीबायोटिक दवाओं के सभी एकल कोशिकाओं (planktonic) बैक्टीरिया के खिलाफ विकसित किया गया है। इसलिए, अब तक, अणुओं की एक बहुत ही सीमित प्रदर्शनों की सूची है कि चुनिंदा परिपक्व biofilms पर कार्य कर सकते हैं मौजूद है। इस स्थिति में दवाओं की खोज में एक प्रगतिशील बदलाव, जिसमें विरोधी biofilms के लिए खोज एक अधिक प्रमुख स्थान पर कब्जा करने के लिए आग्रह किया गया है प्रेरित किया है। एक अतिरिक्त चुनौती वहाँ एक यह है किबहुत biofilm अनुसंधान के लिए मानकीकृत तरीके, विशेष रूप से उन है कि रासायनिक पुस्तकालयों की बड़ी throughput स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की संख्या सीमित है। इधर, रासायनिक जांच के लिए एक प्रयोगात्मक विरोधी biofilm मंच प्रस्तुत किया है। पाली एन -acetyl-Glucosamine, PNAG की यह biofilm व्यवहार्यता (resazurin धुंधला के साथ), कुल बायोमास (क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के साथ), और biofilm मैट्रिक्स (मापने के लिए एक गेहूं के बीज का उपयोग कर agglutinin तीन assays उपयोग करता है, WGA-प्रतिदीप्ति आधारित धुंधला , अंश)। सभी assays मॉडल बैक्टीरिया के रूप में स्ताफ्य्लोकोच्चुस का उपयोग कर विकसित किया गया। कैसे मंच प्राथमिक जांच के लिए के रूप में अच्छी तरह से विरोधी biofilm पहचान हिट के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के उदाहरण प्रस्तुत कर रहे हैं। इस प्रयोगात्मक अनुक्रम आगे मापा अंत अंक के आधार पर हिट के वर्गीकरण के लिए अनुमति देता है। यह भी कार्रवाई के अपने मोड पर जानकारी प्रदान करता है, विशेष रूप से अल्पकालिक chemotherapeutic प्रभाव बनाम लंबी अवधि पर। इस प्रकार, यह बहुत ही उन्नत स्तर हैउच्च गुणवत्ता हिट यौगिकों कि विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए के रूप में शुरू अंक सेवा कर सकते हैं की जल्दी पहचान के लिए ntageous।

Introduction

बैक्टीरिया दो बहुत अलग जीवन शैली, planktonic और बिना डंठल, जिनमें से एक biofilm सबसे आम उदाहरण है के बीच स्विच कर सकते हैं। Biofilms में, जीवाणु एक स्वयं उत्पादित मैट्रिक्स 1 में एम्बेडेड संरचित समुदायों के रूप में। यह स्वयं उत्पादित मैट्रिक्स बैक्टीरिया और उनके बाहरी वातावरण के बीच एक बाधा है, और यह माइक्रोबियल कोशिकाओं की रक्षा करता है, उन्हें करीब निकटता में रखते हुए। biofilm मैट्रिक्स की रचना के बीच और भी प्रजाति के भीतर बदलता है, लेकिन यह ज्यादातर lipopolysaccharides, बाह्य डीएनए और प्रोटीन की एक तंग नेटवर्क के होते हैं। मैट्रिक्स एक शारीरिक बाधा हानिकारक एजेंटों के प्रवेश द्वार के रूप में कार्य करता बाधा है, लेकिन यह भी निर्जलीकरण से biofilm रक्षा करता है और सेल 2 भागने से पोषक तत्वों से बचाता है।

Biofilms आधुनिक बायोमेडिसिन का सबसे चुनौतीपूर्ण विषयों में से एक के रूप में माना जाता है, और वे एंटीबायोटिक सहिष्णु संक्रमण के 3 में से 80% से अधिक के लिए कथित रूप से जिम्मेदार हैं। वे dispआर्द्रता, आसमाटिक दबाव, यांत्रिक तनाव 4, गर्मी, पराबैंगनी विकिरण 5, कीटाणुनाशक, रोगाणुरोधी एजेंटों, और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली 1: बाहरी खतरों के खिलाफ एक स्वाभाविक उच्च सहिष्णुता रखना। उदाहरण के लिए, आवश्यक रोगाणुरोधी एजेंट एकाग्रता एक biofilm मारने के लिए आवश्यक planktonic बैक्टीरिया को मारने के लिए आवश्यक है कि की तुलना में 1,000 गुना ज्यादा होना दिखाया गया है। इस उच्च सहिष्णुता के लिए स्पष्टीकरण multifactorial हो रहा है। मैट्रिक्स एक शारीरिक बाधा है कि biofilm में एंटीबायोटिक दवाओं की पहुंच कम हो जाती है। इसके अलावा, biofilms भीतर कोशिकाओं phenotypically विविध रहे हैं; वे ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, और biofilm 6 के भीतरी और बाहरी हिस्सों के बीच चयापचयों के एक मौजूदा ढाल के कारण विभिन्न चयापचय राज्यों के बीच संक्रमण। इसलिए, इस तरह के कोर के रूप में कुछ biofilm क्षेत्रों में, जीवाणु ऑक्सीजन और पोषक तत्वों से वंचित है और एक पाचन कम सक्रिय या एक पूरी तरह से निष्क्रिय अवस्था में रहते हैं 8 के लिए अतिसंवेदनशील नहीं हैं। इस प्रकार, यह है कि biofilm लचीलापन वर्तमान में सुझाव दिया है और दूसरे, अभी तक अज्ञात है, तंत्र का एक संयोजन से उठता है की संभावना है। Staphylococcus एसपीपी। सबसे समस्याग्रस्त ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के बीच अभी भी कर रहे हैं, गंभीर, अक्सर biofilm से संबंधित, संक्रमण 4 के कारण। यह सुझाव दिया है कि सभी बैक्टीरिया के ऊपर से 99% biofilms भीतर जुड़े रहे हैं, यह प्रबल बैक्टीरियल जीवन शैली 3 बना रही है। हालांकि, वर्तमान में मौजूदा एंटीबायोटिक दवाओं के सभी एकल कोशिका (planktonic) बैक्टीरिया के खिलाफ विकसित किया गया है। अब तक, अणुओं की एक बहुत ही सीमित प्रदर्शनों की सूची है कि चुनिंदा परिपक्व biofilms पर कार्य कर सकते हैं मौजूद है। इस स्थिति में दवाओं की खोज में एक प्रगतिशील बदलाव, जिसमें विरोधी biofilms के लिए खोज एक अधिक प्रमुख स्थान पर कब्जा करने के लिए आग्रह किया गया है प्रेरित किया है।

एक methodolog सेराजनैतिक परिप्रेक्ष्य, अतिरिक्त चुनौतियों मौजूद हैं, के रूप में केवल biofilm तरीकों की एक सीमित संख्या के मानक स्थापित संगठनों, विशेष रूप से उन रासायनिक पुस्तकालयों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए लागू द्वारा विकसित किया गया है। (केवल एक अपवाद के साथ) सभी मानकीकृत assays biofilm रिएक्टरों पर आधारित हैं, और इन तरीकों बड़े काम की मात्रा और यौगिकों की बड़ी मात्रा का परीक्षण किया जा सकता है, जो आम तौर पर जल्दी अनुसंधानात्मक चरण 9-12 के दौरान उपलब्ध नहीं हैं की आवश्यकता होती है। केवल मौजूदा मानकीकृत स्क्रीनिंग-परख लागू तथाकथित कैलगरी Biofilm डिवाइस है, जिसमें से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूनतम biofilm नष्ट एकाग्रता (MBEC) प्रणाली 13-15 विकसित किया गया था। हालांकि, इस परख की सीमा यह है कि biofilms खूंटे पर हो रहे हैं, और सभी प्रजातियों के जीवाणु या यहां तक ​​कि एक ही प्रजाति के भीतर उपभेदों इस डिवाइस पर biofilms बनाने में सक्षम हैं। इसके अलावा, तरीकों कि विशेष रूप से प्राकृतिक यौगिकों के अन्वेषण के लिए लागू किया जा सकता हैजरूरत है। प्राकृतिक उत्पादों पिछली सदी 16 से अधिक रोगाणुरोधी दवाओं की खोज में नवाचार के लिए प्रमुख स्रोत रहा है। वे कहते हैं कि यह भी persister कोशिकाओं के खिलाफ प्रभावी हो सकता है कार्रवाई की अनूठी तंत्र के साथ उपन्यास विरोधी biofilm यौगिकों प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार, प्राकृतिक और स्वाभाविक रूप से प्रेरित पुस्तकालयों के अन्वेषण होनहार और अद्वितीय विरोधी biofilm सुराग के उत्पादन की उच्च संभावना है।

यहाँ, हम assays के एक मंच है कि व्यवहार्यता, कुल बायोमास, और स्ताफ्य्लोकोच्चुस biofilms के मैट्रिक्स पर प्रभाव को मापने के लिए तीन assays का उपयोग विरोधी biofilm यौगिकों की रासायनिक जांच के लिए विकसित किया गया था की प्रयोगात्मक विवरण प्रस्तुत करते हैं। पहली परख biofilm व्यवहार्यता के उपाय, और यह resazurin धुंधला पर आधारित है। Resazurin एक redox दाग है कि नीले और इसके ऑक्सीकरण राज्य में गैर फ्लोरोसेंट है और जब बैक्टीरिया की चयापचय क्रिया द्वारा कम गुलाबी, अत्यधिक फ्लोरोसेंट resorufin में बदल जाता है। यह एक बहुत ही सरल और तेज मीटर हैप्राथमिक स्क्रीनिंग 17-20 के लिए उपयुक्त ethod। दूसरी परख, क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के आधार पर, कुल biofilm बड़े पैमाने पर उपाय। क्रिस्टल बैंगनी biofilms 19,21-23 में बैक्टीरिया और जीवाणुओं के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल दाग है। परख सस्ती अभिकर्मकों पर आधारित है और एक सरल absorbance के समापन बिंदु पढ़ने की है। अंत में, तीसरे परख कोशिकी polymeric पदार्थ (ईपीएस) गेहूं के बीज agglutinin के माध्यम से biofilm (WGA), जो विशेष रूप से बांधता एन -acetyl-glucosamine अवशेषों (PNAG) staphylococcal biofilms 24 की मैट्रिक्स में मौजूद पाली के मैट्रिक्स निशाना बनाता है। WGA एक fluorophore कि प्रतिदीप्ति तीव्रता पाठकों 25 का उपयोग कर पता लगाया जा सकता साथ संयुग्मित है। हम यहाँ तर्क और मंच हम आवेदनों की उदाहरण सहित विकसित की है, का ब्यौरा प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

1. जीवाणु बढ़ रहा है

  1. प्री-संस्कृति 220 आरपीएम मिलाते (16-18 घंटा) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) में रात भर बैक्टीरिया।
  2. ताजा टीएसबी में है और यह 37 डिग्री सेल्सियस और 200 rpm पर बढ़ने तेजी से विकास होने तक पहुंचने के लिए करते हैं (ऑप्टिकल, पूर्व संस्कृति पतला 100-1,000 बार (यहाँ, 1,000 बार एस ऑरियस के लिए प्रयोग किया जाता है बैक्टीरिया की वृद्धि दर के आधार पर) 0.2 और 0.6) के बीच 595 एनएम (आयुध डिपो 595) पर घनत्व।
    नोट: यह कदम तनाव-विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता है।

2. biofilm गठन: पूर्व और बाद के जोखिम

  1. तेजी से बढ़ी संस्कृति 100 गुना पतला है (यह मिली लीटर प्रति लगभग 10 6 कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU / एमएल) के बराबर होती है)।
  2. प्री-प्रदर्शन प्रोटोकॉल
    1. अनुपचारित नियंत्रण नमूने के लिए, एक बाँझ 96 microwell थाली के प्रति अच्छी तरह पतला जीवाणु संस्कृति के 200 μl जोड़ें।
    2. एक परीक्षण यौगिक या एक नियंत्रण के 4 μl जोड़ेएंटीबायोटिक (50x शेयर समाधान) और अच्छी तरह पतला प्रति जीवाणु संस्कृति की 196 μl।
    3. 18 घंटे के लिए 200 rpm पर एक थाली प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं।
      नोट: यहाँ हम एक 2 मिमी कक्षा के साथ एक प्रकार के बरतन का उपयोग करें।
  3. बाद जोखिम प्रोटोकॉल
    1. सभी नमूनों के लिए, एक बाँझ 96 microwell थाली के प्रति अच्छी तरह पतला जीवाणु संस्कृति के 200 μl जोड़ें।
    2. 18 घंटे के लिए 200 rpm पर एक थाली प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं।
      नोट: यहाँ हम एक 2 मिमी कक्षा के साथ एक प्रकार के बरतन का उपयोग करें।
    3. पूरे planktonic समाधान ध्यान से निकालें, biofilm छू, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग किए बिना।
    4. एक परीक्षण यौगिक या एक नियंत्रण एंटीबायोटिक (50x शेयर समाधान) और अच्छी तरह से प्रति टीएसबी के 196 μl के 4 μl जोड़ें।
    5. एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए 200 rpm पर एक थाली प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं।
      नोट: यहाँ हम एक 2 मिमी कक्षा के साथ एक प्रकार के बरतन का उपयोग करें।

3. Resazurin धुंधला ProtocoBiofilms की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए L

  1. बाँझ पीबीएस में 0.1 मिलीग्राम / एमएल resazurin (0.4 मिमी) के एक शेयर समाधान तैयार है। इस शेयर बाँझ, प्रकाश जोखिम से सुरक्षित रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में resazurin शेयर 01:50 पतला 20 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
  3. एक अलग, स्वच्छ 96 अच्छी तरह से थाली एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए पूरे planktonic समाधान (कुओं में biofilms छोड़कर) को ध्यान से स्थानांतरण, biofilms छूने या हवा के बुलबुले बनाने के बिना।
  4. अच्छी तरह से प्रति 200 μl जोड़कर बाँझ पीबीएस के साथ एक बार biofilms धो लें, और ध्यान से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर इसे हटा दें।
  5. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग biofilm थाली के प्रति अच्छी तरह पतला resazurin के 200 μl जोड़ें।
  6. अंधेरे में यह सेते हैं, कमरे के तापमान (आरटी), और 200 rpm पर, लगभग 20 मिनट के लिए मिलाते हुए जब तक इलाज biofilm नियंत्रण में समान रूप से गुलाबी रहे हैं।
  7. पर प्रतिदीप्ति उपायλ exc = 560 एनएम और λ उन्हें = एक प्लेट रीडर (शीर्ष पढ़ने) के साथ 590 एनएम।

4. क्रिस्टल वायलेट धुंधला प्रोटोकॉल biofilms के बायोमास मात्रा के लिए चरण 3 में के रूप में एक ही थाली का प्रयोग

  1. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कुओं से ध्यान resazurin दाग निकालें।
  2. 15 मिनट के लिए मेथनॉल के 200 μl के साथ biofilms को ठीक करें।
  3. 10 मिनट के लिए थाली शुष्क हवा।
  4. 0.02% की 190 μl (/ खंड खंड, विआयनीकृत पानी में पतला) क्रिस्टल बैंगनी समाधान, ध्यान से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर जोड़ें। दाग जबकि pipetting के साथ कुओं के पक्षों को छूने से बचें और झटका बाहर पूरा करने के लिए पिपेट दबाने नहीं द्वारा हवा के बुलबुले के गठन को रोका जा सके।
  5. आरटी पर 5 मिनट के लिए यह सेते हैं।
  6. दाग ध्यान से निकालें, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग।
  7. यह दो बार धो विआयनीकृत पानी (200 हर बार μl) के साथ।
  8. कुओं आरटी पर 5 मिनट के लिए सूखी और शेष दाग भंग96% इथेनॉल या 33% एसिटिक एसिड में।
  9. आरटी पर 1 घंटे के लिए यह सेते हैं और 595 एनएम पर absorbance पढ़ें।

5. Biofilms के लिए के रूप में एक ही नमूना प्लेट का उपयोग planktonic बैक्टीरिया पर जीवाणुनाशक प्रभाव का मूल्यांकन

  1. 3.3 से planktonic समाधान के साथ थाली के 595 एनएम पर मैलापन उपाय।
  2. अच्छी तरह से प्रति शेयर resazurin के 10 μl जोड़कर resazurin साथ planktonic बैक्टीरिया दाग। pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. लगभग 5 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में यह सेते हैं, जब तक अनुपचारित नियंत्रण में समान रूप से गुलाबी रहे हैं।
  4. Λ exc = 560 एनएम पर प्रतिदीप्ति उपाय और λ उन्हें = 590 एनएम।

6. मैट्रिक्स मात्रा का ठहराव और biofilms के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए गेहूं के बीज agglutinin धुंधला

  1. मैट्रिक्स मात्रा का ठहराव
    1. बाँझ पीबीएस में WGA जांच के लिए एक 5 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान तैयार है।
    2. एक समानांतर नमूना पीएलए का प्रयोग करेंइस धुंधला के लिए ते। कुओं से planktonic समाधान निकालें और बाँझ पीबीएस (अच्छी तरह से प्रति 200 μl) के साथ एक बार धोने ध्यान से biofilms को छूने के बिना एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग।
    3. अच्छी तरह से प्रति दाग हो WGA समाधान के 200 μl जोड़ें।
    4. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में यह सेते हैं।
    5. पीबीएस तीन बार के 200 μl के साथ कुओं धोने से अनबाउंड दाग निकालें।
    6. आरटी पर 15 मिनट के लिए थाली सूखी।
    7. 33% एसिटिक एसिड में ही दाग ​​भंग अच्छी तरह से प्रति 200 μl का उपयोग कर।
    8. पट्टी टोपी के साथ कुओं को सील करने और आरटी पर 30 सेकंड और 40 किलोहर्ट्ज़ के लिए एक पानी के स्नान sonicator का उपयोग कर उन्हें sonicate।
    9. आरटी पर 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
    10. sonication चरण को दोहराएँ। कुओं sonication कदम के बीच सील कर रह सकते हैं।
    11. Λ पूर्व = 495 एनएम पर प्रतिदीप्ति उपाय और λ उन्हें = एक प्लेट रीडर (शीर्ष पढ़ने) के साथ 520 एनएम।
  2. साथ मैट्रिक्स Visualizingप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
    1. कदम 6.1.6 जब तक ऊपर के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का प्रयोग करें।
    2. सूखने के कदम के बाद, एक FITC फिल्टर (या किसी अन्य उपयुक्त हरे रंग उत्तेजना फिल्टर) का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ नमूने कल्पना।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और ग्रीन करने वाली लाल-अनुपात के लिए सिग्नल की मात्रा (जी / आर) के साथ इमेजिंग के लिए Biofilms भीतर 7. धुंधला व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग
    1. निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार, प्रत्येक जांच (एक धुंधला व्यवहार्य कोशिकाओं और एक दूसरे को धुंधला मृत कोशिकाओं) का एक समाधान तैयार है।
    2. कुओं से planktonic समाधान निकालें और अच्छी तरह से (प्रति 200 μl) एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग बाँझ पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
    3. अच्छी तरह से प्रति धुंधला समाधान के 6 μl जोड़ें।
    4. 15 मिनट के लिए अंधेरे में थाली सेते हैं।
    5. माइक्रोस्कोपी से पहले, अतिरिक्त तरल मीटर हटानेanually एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग।
    6. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों पर कब्जा, उदाहरण के लिए उपयोग कर एक FITC फिल्टर (हरी प्रतिदीप्ति के लिए, व्यवहार्य कोशिकाओं) या एक TRITC फिल्टर (लाल प्रतिदीप्ति, मृत कोशिकाओं)।
  2. एक हरे रंग के लिए लाल प्रतिदीप्ति अनुपात के रूप में संकेत की मात्रा (जी / आर)
    1. कदम 7.1.1 और 7.1.2 के रूप में ही प्रोटोकॉल का पालन करें।
    2. अच्छी तरह से प्रति धुंधला समाधान के 200 μl जोड़ें और अंधेरे में 15 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं।
    3. उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 485/535 एनएम और हरे और लाल प्रतिदीप्ति के लिए 485/635, क्रमशः (शीर्ष पढ़ने) पर एक थाली पाठक के साथ प्रतिदीप्ति उपाय।

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Representative Results

प्रस्तावित मंच में, व्यवहार्यता, बायोमास, और biofilm मैट्रिक्स पर प्रभाव मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। काम के अनुक्रम (चित्रा 1) में, एक नमूना थाली क्रिस्टल वायलेट के साथ resazurin के साथ और बाद में दाग है एक साथ जीवाणु biofilm व्यवहार्यता पर और कुल biofilm बायोमास पर प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए। दोनों assays एक ही थाली में लगातार किया जा सकता है, क्योंकि यह प्रदर्शन किया गया है कि पहले resazurin के साथ एक पहली धुंधला क्रिस्टल बैंगनी प्लेटों के बीच अधिक से अधिक संकेत absorbance इकाइयों की तुलना के लिए क्रिस्टल बैंगनी धुंधला परिणाम (पी = 0.4149 पर कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा अलग दाग या resazurin धुंधला, एन = 20), 26 के बाद। planktonic बैक्टीरिया पर प्रभाव एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है।

हिट या तो व्यवहार्यता या बायोमास आधारित परख से पहचान कर रहे हैं, एक दूसरे की थाली सेंट है WGA जांच के साथ ained biofilm मैट्रिक्स के polysaccharide घटक (PNAG) पर यौगिकों के प्रभाव यों की। नीचे के रूप में उदाहरण है इस कार्यप्रवाह, रासायनिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही हिट यौगिकों की शक्ति माप के लिए कार्यात्मक अनुवर्ती अध्ययन करने के लिए।

आकृति 1
चित्रा 1: तीन-परख मंच के कार्यप्रवाह। biofilm नमूनों पर तीन assays के संयोजन कार्यप्रवाह की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। मंच व्यवहार्यता, बायोमास, और EPS परत पर एक प्रभाव के लिए धुंधला हो जाना भी शामिल है; प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग; और planktonic चरण पर प्रभाव का मूल्यांकन। "ए" और "ना" के लिए "सक्रिय" और "सक्रिय नहीं," क्रमशः खड़े हो जाओ। Skogman एट अल से संशोधित। 26जेपीजी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए तीन-परख मंच के प्रदर्शन

इधर, दो स्क्रीनिंग रन मंच के प्रदर्शन के प्रतिनिधि परिणाम के रूप में दिखाया जाता है। पहले अभियान (2A चित्रा) में, सिनकोना उपक्षार डेरिवेटिव का एक छोटा सा पुस्तकालय एस ऑरियस के खिलाफ विरोधी biofilm गतिविधि के लिए दिखाई गई 27 biofilms, जबकि दूसरा उदाहरण (चित्रा 2 बी), abietane प्रकार की प्राकृतिक और स्वाभाविक रूप से प्रेरित पुस्तकालय में diterpenoids और डेरिवेटिव 28,29 का पता लगाया गया था। सक्रिय हिट गणना हिट सीमा (; समीकरण 6, 1 टेबल थ्रेसहोल्ड) का उपयोग निर्धारित किया गया है। प्रत्येक स्क्रीनिंग अध्ययन में, बहुत अच्छी तरह से सहसंबद्ध पहले दो assays के परिणाम; हिट सभी व्यवहार्यता और biofilm बायोमास कम करने के लिए, w में सक्षम थेhile निष्क्रिय यौगिकों या तो परख पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया। सभी की पहचान की हिट फिर तीसरे (WGA) परख पर परीक्षण किया गया, लेकिन वे कोई मैट्रिक्स-disassembly (या मैट्रिक्स अपमानजनक) प्रभाव पड़ा (परिणाम दिखाया गया है)।

चित्र 2
चित्रा 2: के साथ एस ऑरियस biofilms मंच का उपयोग स्क्रीनिंग अभियानों के प्रतिनिधि परिणाम है। सबूत की अवधारणा को मान्यता स्क्रीन के दो उदाहरण परख मंच का उपयोग कर प्रदर्शन किया। परिणाम इलाज biofilm नियंत्रण का एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, हिट यौगिकों लाल रंग में संकेत कर रहे हैं, और लाइनों की गणना हिट सीमा प्रतिनिधित्व करते हैं। (ए) एक सिनकोना-उपक्षार व्युत्पन्न पुस्तकालय की स्क्रीनिंग के एक सक्रिय यौगिक की पहचान की। (बी) के पांच अधिनियम पहचान abietane प्रकार diterpenoids और डेरिवेटिव के एक पुस्तकालय की स्क्रीनिंगIve यौगिकों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुवर्ती अध्ययन के लिए तीन-परख मंच के प्रदर्शन

प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3, जहां दो ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं के एक बहुत व्यापक एस ऑरियस biofilms के खिलाफ सांद्रता की सीमा (0.5 एनएम 5 मिमी) पर परीक्षण किया गया में देखा जा सकता है। planktonic बैक्टीरिया के खिलाफ संदर्भ यौगिकों (या तो साहित्य से या प्रयोगशाला में प्रदर्शन) की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) मूल्यों एक ही प्रजाति के biofilms के खिलाफ परीक्षण करने के लिए सांद्रता चुनने के लिए दिशा निर्देशों के रूप में सेवा करते हैं। इसके अलावा, एकाग्रता मूल्यों में जो कोई cytotoxicity स्तनधारी कोशिकाओं में पाया जाता है का ज्ञान भी विरोधी biofilm फॉलो-अप के लिए परीक्षण करने के लिए एकाग्रता के चयन में मदद कर सकते हैं। आदर्श रूप में,अगर एक निश्चित परिसर के लिए दोनों रोगाणुरोधी और cytotoxicity डेटा उपलब्ध हैं, एक पैरामीटर "biocompatibility सूचकांक" (बीआई) के रूप में जाना जाता है, के रूप में गणना की जा सकती है, मुलर और क्रेमर 30 द्वारा परिभाषित किया। इधर, पेनिसिलिन जी और सिप्रोफ्लोक्सासिन के लिए planktonic एस ऑरियस के खिलाफ एमआईसी मूल्यों 0.04 सुक्ष्ममापी और 6 माइक्रोन, क्रमशः के लिए निर्धारित किया गया है (परिणाम) नहीं दिखाया। इस प्रकार, एकाग्रता अंतराल लगभग 10 5 एक्स एमआईसी से 10 -2 एक्स एमआईसी और पेनिसिलिन और सिप्रोफ्लोक्सासिन के लिए क्रमश: 10 3 एक्स एमआईसी 10 -4 के लिए एक्स एमआईसी तक बताया गया। दोनों एंटीबायोटिक दवाओं काफी व्यवहार्यता, बायोमास, और biofilm मैट्रिक्स PNAG सामग्री जब वे biofilm गठन की प्रक्रिया (चित्रा 3 ए) की दीक्षा से पहले एकल कोशिका बैक्टीरिया के संपर्क में थे कम हो सकता है। हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं preformed (18 घंटा) biofilms पर परीक्षण के बहुत उच्च एकाग्रता के बावजूद, व्यवहार्यता और बायोमास केवल टी का लगभग 50% तक कम हो गई थीइलाज biofilms (चित्रा 3 बी) की नली। यहाँ सबसे प्रमुख परिणाम (200% से अधिक करने के लिए) biofilm मैट्रिक्स की वृद्धि हुई है जब preformed biofilms पेनिसिलिन जी की उच्च सांद्रता जब preformed biofilms सिप्रोफ्लोक्सासिन साथ इलाज किया गया biofilm मैट्रिक्स की सामग्री में कोई परिवर्तन नहीं पाया गया साथ इलाज किया गया था।

चित्र तीन
चित्रा 3: एस ऑरियस biofilms के खिलाफ दो मॉडल एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग विरोधी biofilm प्रभाव की एक अनुवर्ती अध्ययन का उदाहरण है। पेनिसिलिन जी और सिप्रोफ्लोक्सासिन के प्रभाव को यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं: (ए) के गठन (पूर्व जोखिम) और (बी) के बाद biofilm गठन (बाद जोखिम) biofilm से पहले। चित्रा स्पष्टता के लिए, केवल निम्नतम और उच्चतम सांद्रता का परीक्षण दिखाए जाते हैं। मानक विचलन 20% से अधिक नहीं है। *** equaरास पी <0.01। Skogman एट अल से संशोधित। 26 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग आधारित

400 सुक्ष्ममापी पर नतीजा यह है कि पेनिसिलिन जी (के रूप में अच्छी तरह से उच्च सांद्रता, के रूप में चित्रा 3 बी में दिखाया गया है) को मारता है preformed एस ऑरियस biofilm जीवाणु की आबादी का लगभग 50% एक और व्यवहार्यता धुंधला परख के साथ की पुष्टि की थी। इलाज biofilm कुओं के लिए हरे रंग के लिए लाल (जी / आर) प्रतिदीप्ति अनुपात की औसत 2.75 था, जी (हरा-दाग) कोशिकाओं की एक विशेषता, मृत (लाल दाग) कोशिकाओं से अधिक का संकेत है। हालांकि, एक प्रकार की दवा इलाज कोशिकाओं में जी / आर अनुपात 1.54 से कम, नियंत्रण कुओं का 56% के लिए इसी। कोशिकाओं के बाद पेनिसिलिन उपचार समर्थक जिंदा बचेईपीएस के एक काफी उच्च राशि पेश, जब इलाज biofilms के साथ तुलना में ग्रीन (WGA) प्रतिदीप्ति में पता चला वृद्धि से आंका (चित्रा 4 बी) के रूप में। हम अनुशंसा करते हैं, जब भी संभव हो, इन इमेजिंग आधारित प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए आगे, मंच के परिणामों की पुष्टि करने के लिए विशेष रूप से हिट उम्मीदवारों के लक्षण वर्णन के चरण के दौरान।

चित्रा 4
चित्रा 4: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी। व्यवहार्यता और ईपीएस उत्पादन पर पेनिसिलिन अलावा (400 माइक्रोन) के के प्रभाव यहाँ दिखाए जाते हैं। शीर्ष छवियों (ए) के इलाज biofilms और पेनिसिलिन इलाज biofilms, जहां व्यवहार्य कोशिकाओं दाग हरे और मृत कोशिकाओं को लाल दाग रहे हैं के अनुरूप हैं। डाला ग्राफ जी / आर प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना को दिखाता है। नीचे छवियों (बी) के इलाज biofilms और पेनिसिलिन के अनुरूप-treated WGA जांच के साथ दाग कोशिकाओं। डाला ग्राफ और इलाज biofilm नमूनों के लिए WGA संकेतों की मात्रा का ठहराव प्रस्तुत करता है, और त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। Skogman एट अल से संशोधित। 26 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डाटा प्रोसेसिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण

सांख्यिकीय मानकों को assays की गुणवत्ता को चिह्नित करने और स्क्रीनिंग रन के दौरान उनके प्रदर्शन को पालन करने के लिए गणना कर रहे हैं। इस्तेमाल सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर है, साथ ही प्राप्त की और लक्ष्य मूल्यों के समीकरणों, 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं। सभी समीकरण, एसडी मिनट, μ मिनट, एसडी मैक्स, और अधिकतम मानक विचलन और कम से कम करने के साधन का प्रतिनिधित्व μ में(मिनट) और अधिक से अधिक (अधिकतम) का संकेत है, क्रमशः। यहाँ दिखाए गए परिणामों में, बनती मूल मूल्यों की तुलना वेल्च के सुधार, जहां पी <0.05 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था के साथ एक unpaired टी परीक्षण के साथ किया गया।

आकृति 1
तालिका 1: सांख्यिकीय assays के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल मापदंडों। सभी समीकरण, एसडी मिनट, μ मिनट, एसडी मैक्स, और μ में अधिकतम मानक विचलन और कम से कम (न्यूनतम) का मतलब है और अधिक से अधिक (अधिकतम) का संकेत है, क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं। धुंधला तरीकों, resazurin, क्रिस्टल बैंगनी, और गेहूं के बीज agglutinin, संक्षिप्त कर रहे हैं आरईएस, CRV, और WGA, क्रमशः। RFU: रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों; राव: रिश्तेदार absorbance इकाइयों। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कोई भी तरीका है कि एक साथ व्यवहार्यता, बायोमास, और biofilm मैट्रिक्स पर एक यौगिक के प्रभाव को मापने कर सकते हैं। इसलिए, वहाँ आदेश अधिमानतः एक प्राथमिक जांच के स्तर पर, तीन समापन पर एक प्रभाव का पता लगाने के assays के संयोजन के लिए एक की जरूरत है।

Resazurin एक बहुत ही सरल धुंधला केवल redox जांच के अलावा से मिलकर प्रोटोकॉल है। हालांकि, resazurin साथ biofilms के इष्टतम ऊष्मायन समय की स्थापना इस परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ जीवाणु उपभेदों में, गुलाबी, फ्लोरोसेंट resorufin को resazurin जांच की कमी है, बहुत जल्दी होता है जबकि अन्य लोगों में यह कई घंटे 19 पिछले कर सकते हैं। इसके अलावा, एक ही बैक्टीरियल तनाव के भीतर, वहाँ भी planktonic बैक्टीरिया और biofilms के बीच महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है। planktonic बैक्टीरिया आम तौर पर और अधिक आसानी से पहुँच रहे हैं, जिसका मुख्य कारण बैक्टीरियल घनत्व biofilm पुलिस में से planktonic आबादी में कम हैpulations, जो प्रतिक्रिया की तेजी से कारोबार को बढ़ावा देता है। Biofilm व्यवहार्यता धुंधला जांच की प्रकाशित इसकी तुलना में, resazurin, सबसे सटीक का उपयोग करने के लिए सरल है, और कम से कम महंगी assays के 19 में से एक हो निष्कर्ष निकाला गया था। इसके अलावा, यह बैक्टीरियल और फंगल जीवों 19 की एक श्रृंखला के लिए लागू होना दिखाया गया है। दूसरी ओर, क्रिस्टल बैंगनी परख सबसे व्यापक रूप से बड़े पैमाने पर biofilm मात्रा का ठहराव 19,32,33 के लिए प्रयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम अलावा और क्रिस्टल बैंगनी दाग ​​समाधान के हटाने कर रहे हैं। ये कदम (कुओं की दीवारों पर दाग की बूंदों के कारण, उदाहरण के लिए) unspecific धुंधला से बचने के लिए बहुत सावधानी से ही किया जा सकता है। resazurin प्रारंभिक धुंधला परख के रूप में उपयोग करने का मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह कोशिकाओं है, जो क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के लिए एक ही थाली का उपयोग सक्षम बनाता करने के लिए गैर विषैले है। दोनों assays के संयोजन काफी कार्यप्रवाह सरल, लागत को कम करती है, consum बचाता हैables, और परीक्षण यौगिकों, जो एक स्क्रीनिंग वातावरण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के उपयोग को कम करता है।

पहले संकेत के रूप में, स्वयं उत्पादित कोशिकी मैट्रिक्स polysaccharide biofilms का एक आवश्यक घटक है। मैट्रिक्स सामग्री (विशेष रूप से आवश्यक polysaccharides) को मापने के लिए, एक तिहाई परख यहाँ पर प्रतिदीप्ति लेबल WGA आधार पर शामिल किया गया था। मूलतः WGA मात्रा का ठहराव एक एंजाइम से जुड़ी लेक्टिन-Sorbent परख (एला) 24 के रूप में वर्णित किया गया था। इसी तरह की एक dimethylmethylene नीला (DMMB) के साथ एस ऑरियस biofilms के मैट्रिक्स में धुंधला glycosaminoglycans (GAGs) के आधार पर परख भी 31,34 इस्तेमाल किया गया है। GAGs polysaccharide कहनेवाला adhesins (पीआईए) Staphylococcus एसपीपी के मैट्रिक्स में पाया करने के लिए समान हैं। 35 biofilms। WGA-परख इसी तरह के लक्ष्यों को पीआईए, लेकिन WGA अधिक विशेष एन -acetyl-glucosamine के अवशेष, जो biofilm मैट्रिक्स 36 <में एक आवश्यक भूमिका निभाते पाली को बांधता/ Sup>। मैट्रिक्स लक्ष्य निर्धारण उच्च महत्व का तथ्य यह है कि biofilms आसानी से regrow सकता है अगर मैट्रिक्स एक रासायनिक या एंटीबायोटिक उपचार के बाद छोड़ दिया है की वजह से है। जीवाणु भी अधिक आसानी से एक सतह कि मैट्रिक्स पूर्व लेपित है 35 को संलग्न कर सकते। यह दिखाया गया है कि कुछ एंटीबायोटिक दवाओं को प्रभावी ढंग से व्यवहार्यता और biofilm बायोमास कम कर सकते हैं, लेकिन मैट्रिक्स पर किसी भी प्रभाव के बिना। हमारे प्रयोगों में, इस सिप्रोफ्लोक्सासिन 31 के मामले द्वारा उदाहरण है। कुछ एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में भी पेनिसिलिन जी 26 के साथ यहाँ का प्रदर्शन, मैट्रिक्स उत्पादन बढ़ा सकते हैं। इन परिवर्तनों के आधार पर, एंटीबायोटिक दवाओं 2 तालिका में सूचीबद्ध श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है। हमारे स्क्रीनिंग अध्ययन (चित्रा 2) में सभी हिट यौगिकों कि biofilm में बैक्टीरिया को मारने और बायोमास को कम लेकिन जुदा या biofilm मैट्रिक्स को बाधित नहीं है, वर्गीकृत किया जा सकता एक साथ सिप्रोफ्लोक्सासिन के साथ।

वर्ग बैक्टीरिया पर प्रभाव मैट्रिक्स पर प्रभाव उदाहरण एंटीबायोटिक (लक्ष्य biofilm) संदर्भ
1 कोई नहीं कोई नहीं एम्पीसिलीन (एसए) (ढोना एट अल। 2009)
2 कोई नहीं - cefalotin (एसए) (ढोना एट अल। 2009)
3 - कोई नहीं polymyxin (एसए) (ढोना एट अल। 2009)
4 - - केनामाइसिन (पीए) (ढोना एट अल। 2009)
सिप्रोफ्लोक्सासिन (एसए) (Skogman एट अल। 2012)
5 - (+) - डॉक्सीसाइक्लिन (पीए) (ढोना एट अल। 2009)
6 - + पेनिसिलिन जी (एसए, ईसी) (Skogman एट अल। 2012)

तालिका 2: एंटीबायोटिक दवाओं का वर्गीकरण। एंटीबायोटिक दवाओं और मैट्रिक्स (WGA या dimethylmethylene नीला (DMMB) धुंधला का उपयोग) (धुंधला resazurin का उपयोग) biofilm बैक्टीरिया की व्यवहार्यता पर उनके प्रभाव के आधार पर श्रेणियों में विभाजित हैं। SA: स्ताफ्य्लोकोच्चुस; PA: Pseudomonas aeruginosa; चुनाव आयोग: कोलाई। ढोना एट अल से संशोधित। 31

इसके अलावा, इस मंच प्राथमिक जांच अभियान के प्रदर्शन के लिए आदर्श है। सबसे लागत और समय प्रभावी रणनीति के लिए एक रणनीति के रूप में पहली स्तरीय resazurin और क्रिस्टल बैंगनी आधारित assays लागू करने के लिए और दूसरी स्तरीय (अनुवर्ती) के अध्ययन में WGA मैट्रिक्स परख करने के लिए पर स्थानांतरित करने के लिए है। इस तथ्य के कारण है कि WGA जांच बल्कि महंगी है और इस परख जो इसे और अधिक कठिन और समय लेने वाली बनाता कई चरणों के होते हैं कि,।

इस मंच की एक प्रासंगिक सुविधा संभावना पहचान antimicrobials के दीर्घकालिक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है। यदि biofilm मैट्रिक्स disassembled है लंबे समय तक chemotherapeutic प्रभाव केवल प्राप्त किया जा सकता है। यह दिखाया गया है biofilm संक्रमण के पुनर्जीवन का खतरा बहुत अधिक है कि अगर मैट्रिक्स पीछे छोड़ दिया है। इस मंच के साथ, यह पहली बार है, तो कुल मिलाकर biofilm बायोमास क्रिस्टल बैंगनी धुंधला का उपयोग प्रभावित है का आकलन करने के लिए संभव है। एक अधिक Dbiofilm मैट्रिक्स polysaccharides के etailed मूल्यांकन, WGA परख का उपयोग, का पालन कर सकते हैं। ध्यान से, एक अणु है कि दोनों मैट्रिक्स अलग करना और खींचना जीवाणुरोधी (biocidal) प्रभाव कम के रूप में माना जा सकता है सकते हैं की पहचान करने की संभावना है। दरअसल, इस प्रकार अब तक, इस प्रकार के केवल यौगिकों कि हम पहचान की है रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स 37 हैं। यह पता करने के लिए, का पालन-अप, या तो resazurin- या क्रिस्टल बैंगनी सक्रिय सफल फिल्मों के साथ इस मंच में प्रदर्शन कर रहे हैं इस रणनीति अलग biocidal या मैट्रिक्स अपमानजनक गतिविधि के साथ यौगिकों की पहचान परमिट के बाद से। इस तरह के सुराग बहु घटक रणनीतियों के लिए संभावित दिलचस्प हो सकता है। biocidal या एंटीबायोटिक प्रकार यौगिकों के साथ मैट्रिक्स अपमानजनक अणुओं का एक संयोजन और अधिक कुशल biofilm उन्मूलन प्रदान करने की उम्मीद है।

सारांश में, यहाँ प्रस्तुत मंच व्यवहार्यता और बायोमास माप का उपयोग कर एक साथ मैट्रिक्स quantifi के साथ विरोधी biofilm स्क्रीनिंग के लिए एक अच्छा आधार प्रदान करता हैकेशन और दृश्य। दोनों resazurin और क्रिस्टल बैंगनी धुंधला assays भी biofilm- बनाने सूक्ष्मजीवों के अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इन assays दोनों बढ़ रही है और धुंधला स्थितियों के लिए अलग अनुकूलन की आवश्यकता है। WGA धुंधला परख की प्रयोज्यता उन बैक्टीरिया जिसमें पाली एन -acetyl-glucosamine biofilm मैट्रिक्स का एक मुख्य घटक है तक सीमित है। (जैसे डाइमिथाइल-methylene नीले रंग धुंधला के आधार पर एक के रूप में) अन्य मैट्रिक्स मात्रा का ठहराव assays के अन्य मामलों में लागू किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस मंच में assays प्रदर्शन करने के लिए काफी आसान कर रहे हैं, और सभी अभिकर्मकों आसानी से उपलब्ध है और साथ ही आम तौर पर सस्ती कर रहे हैं। इस मंच महंगे उपकरण निवेश के लिए आवश्यकता के बिना मध्यम throughput विरोधी biofilm स्क्रीनिंग के लिए कम के लिए उपयुक्त है।

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Acknowledgments

लेखकों अपनी प्रयोगशाला में फिल्माने की प्रक्रिया के दौरान उनके समर्थन के लिए प्रोफेसर पॉल कंपनियां और LMPH, एंटवर्प विश्वविद्यालय, बेल्जियम धन्यवाद। इस काम फिनलैंड परियोजनाओं के अकादमी (परियोजनाओं 272266 और 282981) और हिन्दी Tekniska Vetenskapsakademien मैं फिनलैंड द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एमएससी Janni Kujala के तकनीकी योगदान को स्वीकार किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Resazurin Sigma Aldrich R7017
Crystal violet Sigma Aldrich HT90132 
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific W11261
LIVE/DEAD BacLight  Molecular Probes L7012 SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red
Phosphate Buffered Saline
Tryptone soy agar Lab M, Neogen LAB011
Tryptine soy broth Lab M, Neogen LAB004
F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom Thermo Fisher Scientific 161093
BRAND caps, strips of 8 Sigma Aldrich BR781413-300EA
Branson CPX series ultrasonic bath Sigma Aldrich Z769428-1EA
Multipipette Thermo Fisher Scientific
Multidrop dispenser Thermo Fisher Scientific
Biomek 3000 Beckman Coulter
Varioskan Flash Multiplate reader Thermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureus ATCC  25923

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References

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संक्रमण अंक 118 biofilms परख मंच resazurin क्रिस्टल बैंगनी गेहूं के बीज agglutinin WGA धुंधला स्क्रीनिंग प्राकृतिक यौगिकों विरोधी biofilms।
एंटी biofilm Assays का एक मंच प्राकृतिक यौगिक पुस्तकालय के अन्वेषण के लिए उपयुक्त
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Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries. J. Vis. Exp. (118), e54829, doi:10.3791/54829 (2016).

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